tính chất của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen

Vì vậy, việc xác định tính chất của enzyme PPO từ ngó sen và đề ra những biện pháp xử lý thích hợp nhằm ngăn chặn phản ứng hóa nâu do enzyme là một phần không thể thiếu trong các quá trì

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH NHẬT THANH

TÍNH CHẤT CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Ts Trần Thanh Trúc Huỳnh Nhật Thanh

MSSV: 2101957

Lớp: Công nghệ Thực phẩm K36

Cần Thơ, 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Huỳnh Nhật Thanh với

sự hướng dẫn của Ts Trần Thanh Trúc Các số liệu và kết quả trình bày trong luận

văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện Luận văn đính kèm theo đây, với đề

tài “Tính chất của enzyme pholyphenol oxidase trong ngó sen” đã được hội

đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Người hướng dẫn Người viết

Trần Thanh Trúc Huỳnh Nhật Thanh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến giáo viên hướng

dẫn – Ts Trần Thanh Trúc Xin cảm ơn cô đã tận tình hướng dẫn, giúp tôi có hướng

đi đúng đắn trong quá trình thực hiện luận văn Xin chân thành cảm ơn cô- người đã

thắp sáng ước mơ và hoài bão trong tôi và đã tạo mọi điều kiện, quan tâm giúp đỡ

những lúc khó khăn để tôi có thể thuận lợi hoàn thành nghiên cứu của mình

Xin chân thành cảm ơn thầy PGs.Ts Nguyễn Văn Mười những người đã khơi dậy ở

tôi niềm tin, sự nỗ lực, cố gắng không ngừng và định hướng cho tôi trong công việc

Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy vẫn thường xuyên theo dõi,

hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình và trao đổi những vấn đề mới phát sinh

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực

phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã

truyền đạt những kiến thức hết sức quý báu và tạo điều kiện cơ sở vật chất để tôi có

thể hoàn thành nội dung nghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị học viên Cao học chuyên ngành Công nghệ

thực phẩm khóa 18, 19, các anh, chị cộng sự với cô Trần Thanh Trúc và sinh viên

Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ đã cùng tôi chia sẻ, trao

đổi kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt những năm tháng học tập, hoạt động dưới

mái trường Đại học Cần Thơ

Con xin gửi đến ba mẹ tất cả sự yêu thương và những gì tốt đẹp nhất, cảm ơn ba mẹ

đã luôn ở bên động viên con và giúp con vượt qua nhiều khó khăn trong cuộc sống

Sự khích lệ, động viên mỗi khi con gặp khó khăn mà gia đình đã dành cho con

chính là động lực để con vươn lên và mạnh mẽ hơn

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô cùng các anh, chị được nhiều sức khỏe, luôn

gặt hái được nhiều thành công trong sự nghiệp và cuộc sống

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Nhật Thanh

TÓM TẮT

Đề tài được tiến hành nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tác động đến

hoạt tính enzyme polyphenol oxidase (PPO) được trích ly từ ngó sen Kết quả thí nghiệm

được đánh giá dựa trên sự thay đổi hoạt tính của enzyme PPO, sự thay đổi độ hấp thu của

phản ứng hóa nâu do enzyme gây ra ở bước sóng 540 nm Qua đó, đánh giá và so sánh

hiệu quả của các yếu tố pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất, các chất ức chế, hoạt hóa, độ bền

nhiệt độ trong việc ức chế hoạt động của enzyme PPO được trích ly từ ngó sen

Kết quả của nghiên cứu cho thấy, enzyme PPO hoạt động tốt ở giá trị pH và nhiệt độ tối

thích tương ứng là 6,0 ở 30 o C Hoạt tính enzyme PPO có xu hướng giảm khi tăng nhiệt độ

xử lý và bị vô hoạt ở nhiệt độ 100 o C, trong thời gian là 10 phút Các thông số động học

cũng được xác định với K m = 0,246 mM, V m ax = 0,812.10 -3 OD/giây = 0,812 đơn vị (U), sử

dụng catechol làm cơ chất Hoạt tính dịch trích PPO thô trong ngó sen ban đầu là 3274

(U/ g ngó sen khô ) Việc áp dụng các loại phụ gia riêng lẻ như acid citric, acid ascorbic, và

NaCl cho hiệu quả ức chế hoạt động của enzyme PPO trong ngó sen đáng kể Ngược lại,

các ion khảo sát Fe 3+ , Mg 2+ , Mn 2+ và Cu 2+ thể hiện khả năng hoạt hóa enzyme

Từ khóa: độ bền nhiệt, hoạt hóa, ngó sen, nhiệt độ, hoạt tính, pH, polyphenol oxidase,

ức chế

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TỔNG QUAN 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU 3

2.1.1 Tổng quan về cây sen 3

2.1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

2.1.1.2 Đặc điểm sinh thái 4

2.1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.2 Tổng quan về ngó sen 5

2.1.3 Thành phần hóa học của ngó sen 6

2.2 SỰ HÓA NÂU DO ENZYME 6

2.2.1 Giới thiệu về enzyme polyphenol oxidase (PPO) 6

2.2.2 Các cơ chất của polyphenol oxidase 7

2.2.3 Cơ chế phản ứng 8

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phenolase 10

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN 11

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 11

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] 11

2.3.3 Ảnh hưởng của chất ức chế 11

2.3.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 12

2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

2.3.6 Ảnh hưởng của pH 13

2.4 PHƯƠNG PHÁP KHỐNG CHẾ SỰ HÓA NÂU 14

2.4.1 Phương pháp vật lý 14

2.4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 14

2.4.1.2 Hạn chế oxy trong điều kiện bảo quản 15

2.4.1.3 Chiếu xạ 15

2.4.2 Phương pháp hóa học 15

2.4.2.1 Ức chế hóa học enzyme 15

2.4.2.2 Tác nhân khử 15

2.4.2.3 Tác nhân kìm kẹp 16

2.4.2.4 Tác nhân pH 16

2.4.2.5 Tác nhân phức hợp 17

2.4.3 Phương pháp enzyme 17

2.4.4 Phương pháp gen 17

2.5 CÁC HÓA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 18

2.5.1 Acid citric (C6H8O7) 18

2.5.2 Acid ascorbic (C6H8O6) 19

2.5.3 Natri chloride (NaCl) 20

2.5.4 Calcium chloride(CaCl2) 20

2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN 21

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 23

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 23

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 23

3.1.3 Hóa chất sử dụng 23

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 24

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị dịch trích enzyme thô PPO từ ngó sen 24

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme PPO 24

3.2.4 Xác định hoạt tính của enzyme PPO 25

3.2.5 Xác định các thông số động học VM, KM của PPO ngó sen 25

3.2.6 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 26

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27

3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (catechol) đến hoạt tính PPO trong ngó sen 28

3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen 28

3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen 29

3.3.5 Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ ngó sen

30

3.3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế và hoạt hóa đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BAN ĐẦU CỦA NGUYÊN LIỆU NGÓ SEN 32

4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN 34

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN 35

4.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA ENZYME PPO THU NHẬN TỪ NGÓ SEN

36

4.5 TÁC ĐỘNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ ỨC CHẾ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PPO TRONG NGÓ SEN 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

5.1 KẾT LUẬN 41

5.2 ĐỀ NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH x

PHỤ LỤC B KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: N guyên liệu ngó sen 6

Hình 2.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ enzyme 11

Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme 13

Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến vận tốc phản ứng enzyme 13

Hình 2.5: Công thức cấu tạo acid citric 18

Hình 2.6: Công thức cấu tạo L-ascorbic acid 19

Hình 2.7 Sự tạo thành calcium-pectate ở trên tế bào thực vật 21

Hình 3.1: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk 26

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27

Hình 4.1: Mô hình xác định các thông số động học Vmax, Km của PPO trong ngó sen 33

Hình 4.2: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối PPO của ngó sen 34

Hình 4.3: Sự thay đổi hoạt tính tương đối PPO của ngó sen theo nhiệt độ 35

Hình 4.4: Sự thay đổi hoạt tính tương đối của PPO ở các nhiệt độ khác nhau 37

Hình 1PL Thiết bị sấy ẩm x

Hình 2PL: Sơ đồ chuẩn bị dịch trích enzyme thô PPO xii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Một số giống sen trên thế giới 4

Bảng 2.2: Các cơ chế phản ứng hóa nâu 9

Bảng 4.1: Sự thay đổi mật độ quang trong quá trình xác định hoạt tính của polyphenol

oxidase trong ngó sen 32

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả hoạt hóa PPO của ngó sen 38

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của chất ức chế đến khả năng hoạt động của enzyme PPO 39

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

ISO International Organization for Standardization

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 TỔNG QUAN

Các phản ứng hóa nâu thường làm giảm tính chất cảm quan của sản phẩm, thay đổi trong màu sắc, hương vị, cũng như cấu trúc của một loại rau quả (Martinez và Whitaker, 1995) Điều này dẫn đến việc suy giảm chất lượng nhanh chóng và giá thành thấp ngay thời điểm thu hoạch nên đầu ra cho một số loại còn phụ thuộc rất nhiều vào thương lái Sen là loại cây được trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long, có vòng sinh trưởng ngắn, thu hoạch đồng loạt Nhưng bên cạnh đó, một trong những vấn đề thường xảy ra trong chế biến ngó sen là sự hóa nâu và các biến đổi vật lý diễn ra trong suốt quá trình sau thu hoạch và tồn trữ sau đó Đa phần, ngó sen được bán tươi cho hệ thống nhà hàng, quán ăn Nhìn chung, các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về tiền xử lý, bảo quản và chế biến các sản phẩm từ ngó sen vẫn còn rất hạn chế Ngó sen sau thu hoạch nếu không có biện pháp tiền xử lý hiệu quả sẽ nhanh chóng biến đổi màu và mất giá trị dinh dưỡng Trên thực tế, quá trình

xử lý ngó sen vẫn chưa được quan tâm sâu sắc Mặt khác, việc xử lý với các loại hóa chấtn không rõ nguồn gốc, thành phần, xuất xứ và liều lượng sử dụng vẫn còn rất phổ biến trên thị trường, không đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm

Do đó, những biện pháp xử lý thích hợp nhằm ngăn chặn phản ứng hóa nâu do enzyme là một phần không thể thiếu trong các quá trình sản xuất

Enzyme polyphenol oxidase (PPO) được xếp trong nhóm oxydoreductase, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện trong tế bào vi sinh vật, thực vật và cả động vật

(Queiroz et al., 2008; Simsek và Yemenicioglu, 2007) Quá trình xử lý nguyên liệu

sau thu hoạch là một bước cần thiết cho các quá trình chế biến tiếp theo Vì vậy, việc xác định tính chất của enzyme PPO từ ngó sen và đề ra những biện pháp xử lý thích hợp nhằm ngăn chặn phản ứng hóa nâu do enzyme là một phần không thể thiếu trong các quá trình sản xuất Trên cơ sở đó, nghiên cứu khảo sát các tính chất của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen đã được thực hiện để xác định sự tác động của các điều kiện tồn trữ, bảo quản và chế biến đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu chính của đề tài là xác định tính chất của enzyme PPO trong ngó sen trong các điều kiện xử lý khác nhau Trên cơ sở đó, xác định các thông số động học để điều khiển quá trình xử lý nguyên liệu ngó sen tươi sau thu hoạch đồng thời đảm bảo an toàn thực phẩm và giữ được phẩm chất ngó sen

Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài tiến hành nghiên cứu với các nội dụng sau:

- Xác định các thông số động học Vmax, Km và hoạt tính của enzyme ban đầu trong nguyên liêu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, giá trị pH đến hoạt tính enzyme PPO, từ

đó xác định các thông số tối ưu cho sự hoạt động của enzyme

- Xác định khả năng bền nhiệt của enzyme trong điều kiện xử lý nhiệt

- Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt động của PPO

từ ngó sen

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Tổng quan về cây sen

2.1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, có tên khác là Nelumbium nelumbo (L.) Druce

và Nelumbium speciosum (wild)) thuộc họ Nelumbonaceae, là loài thực vật thủy sinh đa niên có nguồn gốc từ châu Á, Ba tư, Ấn Độ (Wang et al., 2009) Hiện nay,

cây sen đã lan rộng đến Trung Quốc và khu vực Đông Bắc của Úc (Nguyen, 2001)

Nelumbo nucifera Gaertn là loài sen được trồng nhiều ở nước ta

Hệ thống phân loại của cây sen:

+ Nhóm sen cho củ: cho năng suất củ cao, chất lượng tốt nhưng không có hoặc

có hoa rất ít

+ Nhóm sen cho hoa: cho hoa to, nhiều, màu sắc đẹp nhưng không có củ Cánh hoa nhiều, còn được gọi là hoa 1.000 cánh Màu sắc của hoa thay đổi từ màu trắng, vàng, tím đỏ hoặc có 2 màu trên cùng một cánh hoa, thường màu trắng ở phần dưới

và tím hoặc hồng ở trên Nhóm sen cho hoa cũng có gương nhưng hột nhỏ, năng suất kém

+ Nhóm sen cho hột: cho nhiều hột với tỉ lệ hột chắc cao Hột lớn có hương vị thơm ngon Cánh hoa ít, màu đỏ, rễ thường mảnh và không có củ (Nguyen, 2001)

Bảng 2.1: Một số giống sen trên thế giới

giống

Loại hình sen

Đặc điểm

Qianling white Wuhan, China Hột Hoa Hoa trắng, thân củ nhỏ Red lotus Wuhan, China Hột Hột Hoa đỏ, không có thân củ Quang Dong Quang Dong, China Củ Củ Hoa trắng, thân củ lớn

rõ Chưa rõ

Việt Nam white Việt Nam Hột Hoa Hoa trắng, thân củ nhỏ Tiền Giang Tiền giang, Việt Nam Hột

Việt Nam Red Việt Nam Hột Hoa Hoa đỏ, cho hột

(Nguyen, 2001)

2.1.1.2 Đặc điểm sinh thái

Sen được tìm thấy ở các ao, đầm, ruộng nước ngọt hoặc nước lợ Theo Nguyễn Quốc Vong (2001), cây sen cũng có một số nhu cầu nhất định về môi trường sống như: đất, nước, thời tiết Đất có tác dụng giúp rễ cây bám vào và phát triển, cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, ổn định pH Đất không thích hợp cho cây sen là đất

sét nặng và đất chứa quá nhiều chất hữu cơ Nhiệt độ bình quân cho sen phát triển

tốt là 25oC Sen không tăng trưởng ở vùng bị sương giá do rất nhạy cảm với nhiệt

độ lạnh Tuy nhiên, củ sen có đặc tính miên trạng qua đông nhằm giúp sen tồn tại

Vì vậy, việc phân hóa củ được kích thích khi cường độ chiếu sáng giảm và nhiệt độ

từ lá qua hệ thống vận chuyển khí gặp trở ngại (Đỗ Tất Lợi, 2004)

2.1.1.3 Đặc điểm hình thái

Sen là loài nê thực vật đa niên hai lá mầm (Hoàng Thị Sản, 1999; Phạm Hoàng Hộ,

1999), bộ nhiễm sắc thể 2n=16 (Nguyen, 2001) Cây sen có rễ, củ (căn hành), lá,

hoa và quả

Rễ: sen có rễ chùm, có khoảng 20 ÷ 50 rễ trên một đốt củ Rễ thường có màu trắng

kem khi còn non và có màu nâu khi già (Nguyen, 2001)

Củ: củ sen thường có từ 3 ÷ 4 lóng, hình thành từ một đoạn rễ, kích thước của lóng

tùy thuộc vào giống sen; thường có màu trắng kem nhưng đôi khi có màu nâu Cấu tạo củ xốp nên không khí có thể thông suốt chiều dài củ (Nguyen, 2001)

Lá: lá sen có hình khiên, kích thước lớn, có đường kính khoảng 20 ÷ 100 cm Màu

sắc lá không hoàn toàn giống nhau giữa các giống sen, lá có màu xanh, xanh xám, xanh đỏ với một lớp sáp dày trên bề mặt Tuy nhiên, mặt dưới có màu xanh sáng không có sáp và có mép láng Gân lá xuất phát từ tâm nơi đính vào cuống và tỏa đều ra mép lá Cuống lá hay còn gọi là cọng sen thường xốp, đường kính và chiều cao thay đổi theo tuổi cây và điều kiện môi trường Cuốn lá nhỏ, mềm và xốp khi

còn non và cứng khi già; có nhiều gai nhỏ (Omata et al., 1992)

Hoa: hoa lưỡng tính, mọc đơn độc, khá lớn, nằm trên một cuống dài Hoa có 4 ÷ 6

cánh đài màu xanh hoặc màu đỏ tía (Nguyen, 2001), đài dạng cánh nên rất khó phân biệt rõ đài và tràng hoa (Hoàng Thị Sản, 1999) Đài hoa và tràng hoa xếp hình xoắn

ốc Tràng hoa thường 12 ÷ 20 cánh hay nhiều hơn tùy vào giống sen Cánh hoa hình elip và có một màu như: trắng, hồng, đỏ tía hoặc có hai màu trên một cánh hoa như trắng với chóp hồng hoặc hồng chóp tía (Nguyen, 2001; Hick, 2000)

2.1.2 Tổng quan về ngó sen

Ngó sen được phát triển ra từ củ của cây sen Ngó sen màu trắng, tiết diện gần tròn,

có khía dọc màu nâu, ngọn có mang chồi hình chóp nhọn Ngó sen là một thức ăn đồng thời là vị thuốc có tính thông dụng Ngó sen được sử dụng rộng rãi và được dùng trong các món ăn phổ biến của các nước trên thế giới Ngó sen được tiêu thụ như rau tươi, ngoài ra được chế biến thành các món gỏi, ngó sen muối chua (Hoàng Thị Sản, 1999)

Trong thành phần ngó sen có chứa glucose, calcium, photpho, sắt, tyrosine, arginine

và đặc biệt là vitamin C Ngó sen được xem là thuốc cầm máu, chữa đại tiểu tiện ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết Bột ngó sen có màu vàng nâu, hạt tinh bột tròn hoặc gần tròn, đường kính 5 ÷ 10 µm Thông thường, ngó sen để ăn sống hoặc luộc ăn, ngó sen có tác dụng bổ trung khai vị thích hợp cho những người cơ thể suy nhược như vừa ốm khỏi

Hình 2.1: Nguyên liệu ngó sen

(http://hcm.eva.vn/suc-khoe/cong-dung-cua-ngo-sen-c131a59919.html)

2.1.3 Thành phần hóa học của ngó sen

Thành phần hóa học của ngó sen thay đổi phụ thuộc chủ yếu vào giống Thành phần hóa học ngó sen bao gồm tinh bột, asparagine, arginine, trigonelline, tyrosine, glucose; các vitamin như C, A, B, PP và một ít tanin Theo y học cổ truyền, ngó sen

có vị ngọt chát, tính bình, vào kinh can tâm vị Ngoài ra, ngó sen có tác dụng thu liễm cầm máu, tráng dương, an thần (http://www.dongyhongduc.com)

2.2 SỰ HÓA NÂU DO ENZYME

2.2.1 Giới thiệu về enzyme polyphenol oxidase (PPO)

Quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật do hệ enzyme oxy hóa khử xúc tác Các enzyme này thuộc nhóm chính trong hệ thống phân loại enzyme

và có tên gọi chung là oxidoreductase (Queiroz et al., 2008) Trong điều kiện sinh

học oxy phân tử có khả năng oxy hóa cơ chất khi được hoạt hóa bởi các enzyme đặc hiệu – các chất hoạt hóa oxy (oxidase) hay các chất hoạt hóa hydro (dehydrogenase) (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005) Nhóm enzyme oxy hóa khử rất phổ biến trong tế bào của mọi sinh vật vì phản ứng oxy hóa khử là một trong những quá trình

cơ bản nhất của sự sống (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 2005) Phản ứng xảy ra mạnh ở môi trường acid yếu gần trung tính

Polyphenol oxidase (hay còn gọi là phenolase) được phát hiện đầu tiên ở nấm bởi Schoenbein năm 1856, là một metalloprotein có chứa nguyên tử đồng và thuộc vào nhóm enzyme oxy hóa khử, xúc tác phản ứng oxy hóa hợp chất phenolic với sự hiện diện của oxy tạo sản phẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương nên polyphenol oxidase được gọi là enzyme hóa nâu (Fabienne Crumière, 2000)

Phenolase xúc tác 2 kiểu phản ứng: phenol hydraxylase (cresolase) và polyphenol oxidase (catecholase) (Kertesz và Zito, 1962) Tùy theo từng loại cơ chất nguồn enzyme mà phenolase có thể có hoạt tính khác nhau

- Hoạt tính cresolase có ở monophenol monoxygenase có khả năng hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol sau đó oxy hóa thành o-quinon Từ lâu người ta đã

biết đến hoạt tính này ở các loài nấm (Galeazzi et al., 1981) và mới phát hiện gần đây ở khoai tây, đào, nho, mơ, táo, bơ, xà lách… (Bohdziewicz et al., 1994), hoạt

tính này thường bị mất đi trong quá trình tinh chế enzyme

- Hoạt tính catecholase xúc tác cho sự oxy hóa o-diphenol thành o-quinon

Theo Benjamin (1973), hoạt tính catecholase giữ vai trò chủ đạo trong quá trình hóa nâu do enzyme của rau quả, nơi chứa rất nhiều hợp chất thiên nhiên ở dạng o-diphenol Enzyme này cũng có trong một số mô động vật nhưng không quan trọng như trong hệ thống thực phẩm

Ở mô thực vật tươi, chưa bị dập, enzyme phenolase không hoạt động vì chúng nằm trong các bào quan đặc biệt Nhưng khi mô bị dập, phenolase được giải phóng ra có điều kiện tiếp xúc với cơ chất và oxy không khí nên phản ứng hóa nâu xảy ra (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.2 Các cơ chất của polyphenol oxidase

Cơ chất của enzyme PPO là các hợp chất phenol, đây là những chất trong phân tử

có chứa vòng benzen liên kiết với một hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl Cơ chất quan trọng của enzyme này là o-diphenol và m-phenol, các hợp chất dạng p-

diphenol cũng có thể tham gia phản ứng hóa nâu (Hoàng Kim Anh, 2005)

- o-diphenol được xem là cơ chất dễ bị tấn công nhất và có cấu trúc hóa học thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme PPO

- m-diphenol như tyrosine và p-cresol là cơ chất tác dụng chậm, chúng được hydroxyl hóa trước sự oxy hóa đến o-quinones tương ứng

- p-diphenols bị hydroxyl hóa bởi cresolase rồi oxy hóa thành quinone tương ứng

(Hoàng Kim Anh, 2005)

(Hoàng Kim Anh, 2005)

Flavonoid và tannin (catechins và leucoanthocyanins) tác động như cơ chất của phenolase Các dẫn xuất có các nhóm thế methyl không phải là cơ chất của phenolase

Trái với o-diphenol, m-diphenol không là cơ chất thích hợp của PPO, và nó có một hiệu ứng ức chế đối với cơ chất Sự ức chế đó theo kiểu cạnh tranh do có sự gần giống nhau về mặt hóa học giữa các chất ức chế (Hoàng Kim Anh, 2005)

2.2.3 Cơ chế phản ứng

Tùy theo từng loại cơ chất và nguồn enzyme mà phenolase có hoạt tính khác nhau Phenolase thực hiện xúc tác hai kiểu phản ứng: phenol hydroxylase (cresolase) và polyphenol oxidase (catecholase) (Chikezie, 2006) Enzyme phenolase trong chuối, trà và thuốc lá chỉ có hoạt tính catecholase trong khi phenolase ở táo, khoai tây và

củ cải đường có cả hoạt tính cresolase (Baruah và Swain, 1953)

Ở mô thực vật tươi khi chưa bị dập, phenolase không hoạt động vì chúng nằm ở các bào quan đặc biệt Khi mô bị dập, phenolase được giải phóng có điều kiện tiếp xúc với cơ chất với sự hiện diện của oxy và phản ứng hóa nâu mới có thể xảy ra (Karoviová và Kohajdová, 2005)

Cơ chất là diphenol

Catechol là một o-diphenol, dễ dàng bị tấn công bởi enzyme phenolase bằng hoạt tính catecholase Sự tạo thành quinones tùy thuộc vào enzyme và oxy Khi phản ứng này đã xảy ra, các phản ứng tiếp theo sẽ không cần sự hiện diện của enzyme, các phản ứng tạo thành chất màu bắt đầu từ quinones:

- Đầu tiên là hydroxyl hóa o-quinones tạo thành trihydroxybenzene

- Sản phẩm trihydroxybenzene tiếp tục phản ứng với o-quinones để thành lập hydroxyquinone

- Hydroxyquinone xảy ra sự đa phân hóa, ngưng tụ oxy hóa tạo thành hợp chất polymer có màu

- Sản phẩm cuối cùng của sự oxy hóa do phenolase thường có màu nâu, màu đen hoặc các màu trung gian như: hồng, đỏ nâu, xanh đen, gọi chung là melanin hay flobafen (Lê Ngọc Tú, 2002)

Phản ứng hóa nâu trong thực phẩm xảy ra rộng rãi do trong quá trình chế biến hay

do tổn thương cơ học Phản ứng hóa nâu làm biến đổi tính chất màu và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm Trong các sản phẩm sấy khô như rau, củ, quả lạnh đông, sự hóa nâu thường không mong muốn do nó làm thay đổi màu mùi và làm giảm giá trị cảm quan của thực phẩm (Ensiminger và Vamos Vigyyazo, 1995) Hiểu rõ cơ chế các phản ứng hóa nâu giúp ta có thể ngăn chặn hoặc kiểm soát những tiến trình xảy

ra ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm Các cơ chế của các phản ứng hóa nâu được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Các cơ chế phản ứng hóa nâu

Cơ chế Yêu cầu oxygen Cần nhóm amin trong

phản ứng ban đầu

pH thích hợp

(Lê Ngọc Tú, 2002)

Sự hóa nâu do enzyme xảy ra trong nhiều loại rau trái như khoai tây, táo, chuối, cà chua, khi mô bị hư, dập nát, tách vỏ, cắt, bệnh hay để tiếp xúc với các điều kiện không khí Khi đó mô bị tổn thương nhanh chóng hóa sậm màu bên ngoài do sự

biến đổi hợp chất phenol thành melanin màu nâu (Eskin et al., 1971)

Sự hóa nâu do enzyme của mô thực vật trong không khí do sự hiện diện của các cơ chất o-diphenol như catechol, protocatechic acid (3,4-hydroxy benzoic acid) và

cafeic acid (3,4-hydroxy cinnamic acid) với enzyme thích ứng oxygenase (Eskin et al., 197) Các chất flavonoid và tanin (catechin và leucoanthocyanin) tác động như

cơ chất của phenolase

Việc kiểm soát hay ngăn chặn phản ứng hóa nâu do enzyme trong thực phẩm rất quan trọng trong các lĩnh vực trái cây, rau, nước trái cây, thực phẩm đông lạnh và trong các quá trình tách nước thực phẩm (Lê Ngọc Tú, 2002)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phenolase

Giống như những cấu trúc xúc tác sinh học khác, phenolase cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, hàm lượng oxygen, các chất kìm hãm, chất hoạt hóa (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

 Ảnh hưởng bởi cơ chất

Trên những loại cơ chất khác nhau, phenolase có hoạt tính khác nhau Phenolase sẽ thực hiện phản ứng cresolase đối với cơ chất là monophenol và phản ứng với catecholase đối với cơ chất là diphenol, thể hiện hoạt tính xúc tác mạnh nhất đối với

o-diphenol và sẽ bị ức chế với m-diphenol (Galeazzi et al., 1981)

 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng thì khả năng xúc tác của enzyme cũng sẽ tăng theo Nhưng khả năng tăng vận tốc xúc tác cũng luôn có một giới hạn nhất định Quá giới hạn đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và đi đến bị vô hoạt, khi đó cấu trúc không gian của tâm hoạt động của enzyme sẽ không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất Enzyme phenolase hoạt động mạnh trong khoảng nhiệt độ 30 oC ÷ 40oC (Fang et al., 2006)

 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của phenolase

Giá trị pH cho hoạt tính tối đa của phenolase phụ thuộc vào nguồn gốc cũng như thành phần cơ chất được sử dụng Nhìn chung, khoảng pH thích hợp cho hoạt động

của phenolase nằm trong khoảng từ 6 ÷ 7 (Fang et al., 2006)

 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm, hoạt hóa đến hoạt tính enzyme

Sự có mặt của các chất kìm hãm, hoặc hoạt hóa sẽ đưa đến hiện tượng ức chế hay gia tăng hoạt tính xúc tác của polyphenoloxidase, tùy thuộc vào cấu tạo mà chúng

sẽ có cơ chế hoạt hóa, ức chế khác nhau (ức chế không đặc hiệu, ức chế không cạnh

tranh, ức chế cạnh tranh) (Fang et al., 2006)

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Đường biểu diễn có dạng: tốc độ phản ứng v= K[E]

có dạng y = ax Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng vận tốc tăng Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi

Hình 2.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ enzyme

(Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Khi enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) sẽ hình thành phức hợp enzyme –cơ chất Phức hợp sau đó tạo ra sản phẩm (P) và giải phóng enzyme Mischaelis va Menten

đã giải thích tích chất động học của phản ứng enzyme và lập được phương trình biểu diễn sự liên quan giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

Tính chất phổ biến của phương trình Michelis – Menten thể hiện ở chỗ nó không chỉ dùng trong trường hợp đơn giản như đã nói ở trên (một cơ chất S tạo thành một sản phẩm P) mà nó cũng đúng trong những trường hợp phức tạp hơn, phản ứng gồm hai hay nhiều cơ chất tạo thành nhiều sản phẩm (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

2.3.3 Ảnh hưởng của chất ức chế

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme Nó có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

Chất ức chế (hay chất kiềm hãm) là chất có khả năng làm yếu hoặc làm đứt hoàn toàn tác dụng của enzyme Khi có mặt cơ chất, hoạt tính xúc tác của enzyme bị ảnh hưởng bởi loại và nồng độ chất ức chế Các chất ức chế có thể tác động thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzyme Chất ức chế thuận nghịch tương tác với enzyme thông qua các liên kết không đồng hóa trị hay các phản ứng phân ly Ngược lại chất ức chế không thuận nghịch gây ra sự thay đổi liên kết đồng hóa trị trong enzyme

Trong ức chế thuận nghịch gồm có ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh:

+ Ức chế cạnh tranh: chất ức chế có cấu tạo tương tự như cơ chất, nó gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme, ngăn cản sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất Vì vậy xảy ra sự cạnh tranh giữa cơ chất và chất ức chế, làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất, kết quả là hoạt động của enzyme sẽ bị giảm

+ Ức chế không cạnh tranh: chất ức chế không gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme mà gắn vào vị trí khác trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme làm cho enzyme giảm khả năng xúc tác Chất ức chế có thể phản ứng với enzyme tự do và cơ chất tạo thành phức hợp enzyme - chất

ức chế - cơ chất

(Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009)

2.3.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạt hóa enzyme Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau Chúng có thể

là các anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Các chất hoạt hóa có tác dụng hoạt hóa ở nồng độ nhất định Vượt qua nồng độ này chúng sẽ gây

ức chế hoạt động của enzyme Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009)

Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính enzyme

2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme càng tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng từ

40 ÷ 60oC Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ

thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…

Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt tới hạn thường vào khoảng 70 ÷ 80oC Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng phục hồi Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC hoạt tính của enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường (Lê Ngọc Tú, 2002)

Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến vận tốc phản ứng enzyme

(Nguồn: Lê Ngọc Tú, 2002)

Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào những yếu tố khác: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ,… Trong hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển

2.4 PHƯƠNG PHÁP KHỐNG CHẾ SỰ HÓA NÂU

Sự hóa nâu do tác động của PPO làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng thực phẩm, làm giảm giá trị kinh tế của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trái cây tươi như táo, lê, chuối, nho, táo tây và rau củ như rau diếp, nấm rơm, khoai tây, ngó sen, khoai lang,…, và hải sản như tôm, cua (Ensiminger và Vamos Vigyyazo, 1995) Sự hóa nâu làm giảm giá trị cảm quan do đó làm giảm giá trị thương mại và sự chấp nhận của người tiêu dùng (do sự thay đổi màu sắc, mùi vị, độ mềm và giá trị dinh dưỡng)

đối với trái cây và rau củ bị hóa nâu (Marshall et al., 2000)

Ức chế PPO gây hiện tượng hóa nâu trong phần lớn các sản phẩm thực phẩm tươi là mục tiêu của nhiều ngành công nghiệp thực phẩm Có nhiều phương pháp để ức chế enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp lựa chọn (Lê Ngọc Tú, 2002)

2.4.1 Phương pháp vật lý

2.4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ lạnh (dưới 10oC) làm giảm hoạt động của enzyme hóa nâu, tuy nhiên sự thay đổi màu vẫn xảy ra ở nhiệt độ lạnh và sản phẩm dễ bị hỏng do sự tạo thành các tinh thể đá Trong điều kiện lạnh hoạt động enzyme hóa nâu bị ức chế hoàn toàn khi lưu giữ ở nhiệt độ khoảng -18oC

Xử lý ở nhiệt độ cao là phương pháp thường sử dụng trong công nghiệp thực phẩm

để ngăn cản sự hư hỏng của thực phẩm với mục tiêu làm giảm hoạt tính của enzyme bởi sự bất hoạt không thuận nghịch enzyme và giảm sự nhiễm khuẩn Xử lý nhiệt

độ cao là phương pháp dễ sử dụng để ức chế enzyme hóa nâu trong rau quả, trái cây, tôm, tôm hùm, ….Tuy nhiên, thời gian và nhiệt độ xử lý phải phù hợp với tính chất của sản phẩm Những bất lợi của xử lý nhiệt là hình thành mùi và màu không mong muốn do phản ứng Maillard

Phương pháp xử lý nhiệt kết hợp với sóng siêu âm cũng được sử dụng để ức chế PPO Ưu điểm của phương pháp này là giảm nhiệt độ xử lý, thường được ứng dụng

để xử lý các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.4.1.2 Hạn chế oxy trong điều kiện bảo quản

Loại bỏ hoàn toàn oxy là con đường thích hợp nhất để ức chế sự oxy hóa hợp chất phenol xúc tác bởi PPO, phương pháp này được ứng dụng cho mô chết do việc tạo thành hàng rào bảo vệ tự nhiên ngăn cản sự khuếch tán của oxy như ngâm trái cây trong siro đường, sử dụng màng bao không thấm nước hoặc sử dụng khí trơ như chân không hay không khí nghèo oxy (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.4.1.3 Chiếu xạ

Trái cây và rau củ có thể xử lý bởi chiếu xạ tia γ để kéo dài thời gian bảo quản Chiếu xạ tiêu diệt vi sinh vật và kiềm chế quá trình chín và lão hóa của trái cây và rau quả Liu và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ trên cần tây cho thấy sự giảm 73% hoạt tính của PPO trong mẫu xử lý sau 3 ngày bảo quản ở 4C Sau 9 ngày enzyme thể hiện hoạt tính khoảng 25% thấp hơn mẫu đối chứng Có thể sử dụng kết hợp chiếu xạ liều thấp với xử lý hóa chất (calcium ascorbate và acid ascorbic) hay các phương pháp khác để ức chế sự hóa nâu (Fellows, 2002)

2.4.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học thường được sử dụng phổ biến trong ức chế enzyme hóa nâu Tuy nhiên việc sử dụng hóa chất trong chế biến sản phẩm thực phẩm yêu cầu phải không độc và không ảnh hưởng bất lợi đến mùi vị của sản phẩm

2.4.2.1 Ức chế hóa học enzyme

Ức chế hóa học enzyme là sự tác động trực tiếp của chất hóa học lên enzyme và được phân thành hai nhóm : nhóm thứ nhất tương tác với đồng và nhóm thứ hai ảnh hưởng đến vị trí tương tác của enzyme với cơ chất phenolic

Trong nhóm thứ nhất, ức chế bởi tác nhân kìm kẹp ion đồng như acid, cyanide, cacbon monoxide được thử nghiệm trên hoạt tính của PPO từ nhiều nguồn khác

nhau (Healey và Strothkamp, 1981; Zawistowski et al., 1988) Tương tự, ức chế

PPO bởi ion halogen vô cơ được thử nghiệm trên hoạt tính PPO trong táo

(Janovitz-Klapp et al., 1990)

Trong chất ức chế thuộc nhóm thứ 2, acid cacboxylic vòng thơm của benzoic, cinnanic được nghiên cứu rộng rãi, chúng hoạt động như chất ức chế cạnh tranh của PPO bởi vì cấu trúc của chúng tương tự cơ chất phenolic

2.4.2.2 Tác nhân khử

Phương pháp phổ biến nhất trong ức chế enzyme hóa nâu trong công nghiệp và thí nghiệm là sử dụng tác nhân khử như acid ascorbic, hợp chất thiol, sulfite và amino acid Phức hợp khử ngăn chặn sự hóa nâu bởi sự khử o-quinone nội sinh thành o-

diphenol ban đầu hoặc bất hoạt không thuận nghịch PPO Tuy nhiên hiệu quả của tác nhân khử giảm đáng kể nếu sử dụng chúng sau khi phản ứng enzyme đã bắt đầu Acid ascorbic và dẫn xuất của nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để ức chế enzyme hóa nâu Trong hệ thống thực phẩm, chúng hoạt động như các gốc tự do và khử o-quinon thành diphenol Trong hệ thống sinh học, acid ascorbic ức chế sự hóa nâu trong dịch chiết quả lê, trong táo acid ascorbic ức chế mạnh enzyme hóa nâu trên mặt cắt của táo Acid erythorbic có cấu trúc rất giống với acid ascorbic nên cũng được sử dụng trong sản xuất thực phẩm để ức chế hiện tượng hóa nâu, tuy nhiên chúng thường được sử dụng trong thực phẩm dạng lỏng

(Lozano-de-Gonzales et al., 1993)

Sulfite ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong sản phẩm thực phẩm nhưng sulfite ảnh hưởng có hại đến sức khỏe như bệnh hen suyễn, do đó chúng bị giới hạn hay cấm sử dụng ở một số nước Một vài nghiên cứu được thực hiện trên amino acid chứa sulfhydryl như cystein và dẫn xuất của cystein như cystein methyl ester, glutathione được chứng minh là ức chế hiệu quả sự hóa nâu Sodium chloride là tác nhân oxy hóa mạnh, có thể tạo ra chlorine dioxide trong điều kiện acid ức chế hoạt động của PPO (Lê Ngọc Tú, 2002)

2.4.2.3 Tác nhân kìm kẹp

PPO là một metalloenzym chứa đồng, ion đồng là thành phần quan trọng của phản ứng enzyme, PPO bị ức chế bởi tác nhân kìm kẹp Cystein có thể phản ứng với đồng tại trung tâm hoạt động của enzyme và trực tiếp ức chế enzyme

Dẫn xuất photphat và EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) liên kết với đồng tại trung tâm hoạt động của PPO hoặc giảm mức độ hiệu quả của sự hợp nhất đồng trong holoenzyme, tuy nhiên chúng chỉ có khả năng làm chậm phản ứng của enzyme nhưng không hoàn toàn ức chế enzyme (Lê Ngọc Tú, 2002)

EDTA là phức hợp được biết nhiều nhất và sử dụng làm giảm sự hóa đen sau khi nấu tinh bột khoai tây, trong khi Sporix một sản phẩm acidic polyphosphat là tác nhân ức chế mạnh và rất hiệu quả trong ngăn chặn enzyme hóa nâu trong nước táo

2.4.2.4 Tác nhân pH

Hoạt tính tối ưu của enzyme phụ thuộc vào pH, sự thay đổi pH của môi trường làm giảm hoạt tính của PPO pH tối ưu cho hoạt động của PPO phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất, trong nhiều trường hợp pH tối ưu nằm trong khoảng 6 đến 7 PPO bị bất hoạt hiệu quả trong dung dịch có pH thấp hơn 3 Phức hợp chính làm giảm hoạt động của PPO gồm acid hữu cơ như acid malic, tartaric, malonic và acid

vô cơ như phosphoric và hydrochloric acid, acid acetic trong sản phẩm giấm Acid citric ức chế enzyme hóa nâu vì nó hoạt động như tác nhân kìm kẹp để loại bỏ đồng

ở trung tâm hoạt động và nó cũng là phức hợp acid làm giảm pH của hỗn hợp (Hoàng Kim Anh, 2005)

2.4.2.5 Tác nhân phức hợp

Một phương pháp khác để loại bỏ hợp chất phenolic trong thực phẩm dạng lỏng là

sử dụng cyclodextrin, đặc biệt β-cyclodextrin, ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong nước táo, đặc tính quan trọng nhất của cyclodextrin là khả năng hình thành phức hợp với các phân tử hữu cơ kể cả cơ chất của polyphenol oxidase PVPP (polyvinylpolypyrollidone) là sản phẩm cho phép sử dụng để ức chế sự hóa nâu trong nước táo Polysacharide sulphat như carrageenan ức chế hóa nâu trong nước táo, táo cắt lát và hiệu quả ức chế của chúng tăng lên với sự hiện diện của 0,5% acid citric (Nguyễn Văn Mười, 2007)

2.4.3 Phương pháp enzyme

Enzyme có bản chất cấu tạo là protein vì vậy có thể bị tấn công và bất hoạt bởi enzyme khác có khả năng phân giải phần protein của enzyme Sự ức chế enzyme hóa nâu trong kiwi cắt và bột kiwi khi tiếp xúc với actinidin, một protease hoạt tính

cao (Labuza et al., 1990) Ba protease thực vật khác gồm ficin từ sung, papain từ đu

đủ và bromelin từ thơm được chứng minh là hiệu quả trong điều khiển enzyme hóa nâu mà đặc biệt là enzyme ficin có tác động mạnh hơn

Những enzyme khác ngăn chặn sự hóa nâu bởi việc loại bỏ cơ chất phenolic bằng

sự cải biến hóa học Sử dụng o-methyltransferase để methyl hóa o-dihydroxy phenolic thành dẫn xuất methoxy tương ứng Kelly và Finkle xử lý nước táo với

enzym protocatechuate 3,4-dioxygenase từ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa xúc

tác phản ứng oxy hóa mở vòng và phân đôi ortho của catechol, nước táo có xử lý enzyme không bị đen khi so sánh với mẫu đối chứng không xử lý Tuy nhiên việc

xử lý enzyme ngăn chặn sự hóa nâu có giá thành cao và không thích hợp ứng dụng trong sản xuất thương mại

2.5 CÁC HÓA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.5.1 Acid citric ( C 6 H 8 O 7 )

Acid citric là một loại acid hữu cơ thuộc loại yếu và thường được tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quýt Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua Ở lĩnh vực hóa sinh thì acid citric đóng vai trò quan trọng trong chu trình acid citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống Ngoài ra acid citric cũng đóng vai trò là một chất tẩy rửa an toàn đối với môi trường và đồng thời cũng là một tác nhân chống oxy hóa

Acid citric có nhiều trong các loại rau quả và được tìm thấy nhiều nhất trong trái chanh Theo ước tính thì trong trái chanh acid citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô

Hình 2.5: Công thức cấu tạo acid citric

(http://www.fulkersonwinery.com/product-detail/chemicals/citric-acid-2 oz)

Ở nhiệt độ phòng acid citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc dạng khan hoặc dạng monohydrate có chứa một phân tử nước trong mỗi phân tử của acid citric Dạng khan của acid citric thì kết tinh trong nước nóng, ngược lại dạng monohydrate thì kết tinh trong nước lạnh, ở nhiệt độ 74C thì dạng monohdrat sẽ chuyển sang dạng khan Về mặt hóa học thì acid citric cũng có tính chất tương tự như các dạng acid cacboxylic khác, khi nhiệt độ trên 175C thì nó sẽ bị phân hủy tạo thành CO2 và H2O Theo Bohdziewicz et al., (1994), acid citric có khả năng tạo

phức với nhiều kim loại như sắt, đồng, mangan, magie Nhờ vậy mà nó có khả năng chống oxy hóa hiệu quả trong các lĩnh vực bảo quản rau quả và nhiều loại thực phẩm khác

Trong vai trò của một phụ gia thực phẩm, acid citric được sử dụng như là chất tạo hương vị và chất bảo quản trong thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là các loại đồ uống nhẹ, được ký hiệu là E330 Acid citric có tự nhiên trong cơ thể, trong thức ăn thông thường và được coi là không độc Tuy nhiên nếu dùng nhiều và thường xuyên acid citric có thể làm hỏng men răng Khi tiếp xúc với mắt nó có thể gây tổn thương mắt (Hoàng Ngọc Hùng và Vũ Chu Hùng, 2006)

Citric acid là một trong các acid được sử dụng rộng rãi nhất cho việc ức chế màu nâu trong các phản ứng hóa nâu do enzyme Acid citric là một yếu acid hữu cơ tự nhiên thường được tìm thấy trong trái cây cirus và được sử dụng rộng rãi như là một phụ gia thực phẩm Nó cũng được sử dụng với số lượng nhỏ như là một mềm thịt Nồng độ acid citric cao hơn cho vị đắng, do đó việc sử dụng phụ gia thực phẩm này được giới hạn bởi liều lượng sử dụng Acid citric thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm như là một phụ gia thực phẩm do có khả năng tạo cầu nối

và khả năng cô lập các enzyme gây phản ứng hóa nâu Citric acid là một tác nhân

ức chế của PPO bằng cách giảm pH và kết hợp với nguyên tố đồng tại trung tâm hoạt động enzyme Nó thường được dùng như là một tác nhân tạo tạo acid hóa có tác dụng tương tự như acid erythorbic (McCord và Kilara 1983) Acid Citric tạo môi trường acid mạnh với pH thấp có tác dụng ức chế hoạt tính PPO hoạt động mạnh ở pH 5÷7 (Paul & Palmer, 1972)

2.5.2 Acid ascorbic (C 6 H 8 O 6 )

Acid ascorbic là một hợp chất hữu cơ tự nhiên với các đặc tính chống oxy hóa, là chất rắn màu trắng, nhưng các mẫu không tinh khiết có thể xuất hiện màu vàng Acid ascorbic dễ bị hòa tan trong nước và tạo ra môi trường acid nhẹ Ascorbic còn

có tính chất của vitamin C (L-ascorbic) Trong hóa học, ngoài L-ascobic acid thì acid ascorbic còn có một đồng phân khác là D-ascorbic acid nhưng dạng này không tồn tại trong tự nhiên, có thể được tổng hợp nhân tạo và có khả năng chống oxy hóa giống hệt như L-ascorbic Tuy nhiên D-ascorbic thì lại không có nhiều hoạt tính vitamin C như là L-ascorbic acid (mặc dù không hoàn toàn là không) Điều này cho thấy khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic chỉ có một phần nhỏ vitamin tham gia hoạt động

Hình 2.6: Công thức cấu tạo L-ascorbic acid

(http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc-pham/239-vitamin-c.html)

Acid ascorbic cũng có nguồn gốc tương tự như các phân tử đường, mang nhiều nhóm thế chứa oxy Phân tử ascorbic acid tồn tại ở trạng thái cân bằng với hai dạng ketone và enol, trong đó dạng ketone ổn định hơn dạng enol Như là một chất bị oxy hóa nhẹ, acid ascorbic bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí Phản ứng này sẽ xảy

ra nhanh chóng khi tiếp xúc thêm với các ion kim loại và ánh sáng, nó có thể bị oxy

hóa một phần hoặc hoàn toàn tạo thành dehydroascorbic acid (Steele et al., 1976)

Ascorbat hoạt động như một chất chống oxy hóa, thường phản ứng với các oxy của các gốc tự do, chẳng hạn như các gốc tự do hydroxyl hình thành từ hydrogen peroxide, các gốc tự do này có thể gây tổn thương cho thực vật ở mức độ phân tử Các hình thức tự oxy hóa của acid ascorbic thường không kèm theo các phản ứng

phụ khác và không gây ảnh hưởng đến các mô của tế bào (Kim et al., 2002)

Ascorbic acid là một tác nhân có khả năng làm giảm tác động tạo màu nâu trong phản ứng hóa nâu Nó tạo thành muối trung tính và tan trong nước Acid ascorbic được công nhận là an toàn (GRAS) để sử dụng trong trái cây và rau quả và có lẽ là nhất được sử dụng rộng rãi (Lê Ngọc Tú, 2002)

Acid ascorbic và erythorbic đồng phân đã được sử dụng rộng rãi trong các công nghiệp thực phẩm do đặc tính chống oxy hóa của họ Cả hai loại acid đóng vai trò thay đổi thế oxy hóa khử Vai trò trong chống màu nâu là giảm o-quinon thành o-

diphenols trong phản ứng hóa nâu do enzyme (Golan-Goldhirsh et al., 1984)

2.5.3 Natri chloride (NaCl)

Natri chloride là bột tinh thể màu trắng hay tinh thể không màu, vị mặn, không có mùi Dung dịch natri chloride trong nước ăn mòn sắt, cũng có thể phản ứng tạo kết tủa với bạc, chì và thủy ngân; bị chất oxy hóa mạnh giải phóng Clo NaCl có tác dụng ức chế sự hóa nâu Tuy nhiên, để vô hoạt hoàn toàn phenolase cần NaCl có nồng độ cao Nồng độ cao của NaCl có vị mặn không thích hợp trong nhiều trường hợp chế biến Do đó, việc ngâm muối có một giá trị giới hạn NaCl được biết đến như là tác nhân chống oxy hóa enzyme PPO; khả năng ức chế của enzyme PPO gia tăng khi pH giảm Ion Cl- là một tác nhân ức chế hóa nâu yếu; một số tác giả đã báo cáo rằng nồng độ ion Cl- yêu cầu cho việc ức chế PPO là cao, và có thể tác động đến mùi vị của sản phẩm (Mayer và Harel, 1991) Trái lại, một vài tác giả tin rằng việc kiểm soát hóa nâu có thể thực hiện bằng cách ngâm dung dịch acid; pH ít nhất 3,5 (Rouet-Mayer và Philippon, 1986)

2.5.4 Calcium chloride(CaCl 2 )

Vai trò tích cực của dung dịch CaCl2 trong cải thiện cấu trúc đã được ứng dụng đối với nhiều loại rau quả Sự cải thiện cấu trúc (độ cứng, độ giòn của rau quả) do tác động của việc ngâm nguyên liệu trong dung dịch CaCl2 chủ yếu nhờ vào vai trò của ion Ca2+ trong việc tạo sự ổn định hệ thống màng tế bào và hình thành calcium

pectate, làm phiến giữa và vách tế bào trở nên rắn chắc hơn (Lee et al.,1979;

Jackman và Stanley,1995)

Hình 2.7 Sự tạo thành calcium-pectate ở trên tế bào thực vật

(Duvetter, 2007)

Mặt khác, muối calcium có thể tác động lên mô tế bào góp phần làm tăng tính nguyên vẹn của tế bào và kết quả là giữ vững hay tăng độ cứng của tế bào Tuy nhiên, việc sử dụng CaCl2 thừa là nguyên nhân làm cho sản phẩm có vị đắng hay có

mùi vị không tốt (Luna-Guzman el al., 2000) dư lượng của CaCl2 không thấm vào

tế bào sẽ bám bên ngoài sản phẩm Chính vì vậy, đối với mỗi loại nguyên liệu khác nhau cần phải được khảo sát nhằm xác định nồng độ dung dịch CaCl2 thích hợp

2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của enzyme PPO đã và đang được nhận

được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Rong Bao-hua et al (2010) đã

xác định những ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các chất ức chế tác động lên hoạt tính PPO ngó sen và thiết lập phương trình phản ứng động học Nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 30oC ở pH bằng 6,0 Hằng số Km và Vmax của phương trình động học tương ứng là 0,0344 mol/L, 172,41 U/mL Cũng theo nghiên cứu này, enzyme PPO

bị vô hoạt khi bị xử lý nhiệt ở 70C trong thời gian 60 phút, đồng thời ngó sen sau khi tiền xử lý 30 phút trong dung dịch 0,2% calcium chloride cho độ cứng của ngó

sen duy trì không đổi so với ban đầu Các nghiên cứu gần đây của Wang et al (2009), Xu et al (2008) đã đưa ra giải pháp cải thiện chất lượng của ngó sen bằng

cách sử dụng bao gói thích hợp và tiền xử lý ngó sen bằng các tác nhân chống hóa

nâu Đồng thời, nghiên cứu của Xu et al (2008) cũng đề nghị phương thức tiền xử

lý gồm L-cystein (0,3%) kết hợp acid citric (0,5%), acid ascorbic (0,2%) và NaCl (0,5%) kết hợp bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC nhằm ức chế sự hóa nâu và kéo dài thời gian bảo quản ngó sen tươi

Trên thế giới enzyme PPO được thu nhận, tinh chế và khảo sát đặc tính từ lá trà

xanh (Camellia sinensis) được thực hiện bởi nhiều tác giả như Halder, Tamuli và Bhaduri (1998) ; Unal et al (2011) Ngoài ra PPO còn được thu nhận và khảo sát từ nhiều loài thực vật khác như chuối (Galeazzi et al., 1981), vỏ quả xoài (Prabha và

Patwardhan, 1982), quả bơ (Kahn, 1983 và Lelyveld, 1984), quả khế (Adnan et al., 1986), táo Amasya (Oktay et al., 1995), lá đậu xanh (Shin et al., 1996), khoai môn (Yemenicioglu et al., 1997), cây thuốc lá (Richardson và McDougall, 1997), quả

mơ Malatya (Arslan et al., 1998), củ khoai tây (Partington, 1996 và 1999), quả vải (Jiang et al., 1999), cà phê (Mazzafera và Robinson, 2000), mủ cao su (Wititsuwannakula et al., 2002), lá dâu tằm (Sutay, 2003), quả mảng cầu xiêm (Bora et al., 2004), cây bạc hà Metha arvensis (Neves et al., 2009), quả anh đào (Jia

et al., 2011), hoa dâm bụt (Madani et al., 2011),…

Một số nghiên cứu về PPO ở vi sinh vật cũng được thực hiện ở E.coli (Kim et al., 2001), Thermomyces Lanuginosus (Astarci, 2003), Thermophilic bacillus sp

(Guray, 2009), … Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về PPO ở một số đối tượng khác như nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của PPO trong quá trình lên men cacao (Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009)

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, đặc điểm của PPO phụ thuộc rất lớn vào nguồn trích ly, cơ chất phản ứng và các điều kiện môi trường Chính vì vậy, việc khảo sát tính chất của PPO phải được khảo sát một cách cụ thể trên từng đối tượng, làm cơ

sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghi ệm

Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Cân điện tử Vibra, model DJ - 1000TW, độ chính xác 0,01g, Nhật

- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM - 12P, độ chính xác 0,01, Ý

- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc

- Máy đo quang phổ Spectrophotometer, model U-2800, Hitachi, Nhật

- Tủ lạnh Alaska, model LC-633A, Mỹ

- Lò sấy Sanaky, model VH-50HP, nhiệt độ 100 ÷ 250C, Trung Quốc

- Bể điều nhiệt Memmert, model WB-10, công suất 1.250 W, Đức

- Nhiệt kế Hanna, model M-7860, -50 ÷ 150°C, độ chính xác 0,1°C, Mauritius

- Máy lắc ống nghiệm, model IKA, Đức

- Micropipet 1.000 µL (Isolab, Đức) và 5 (Hirschoman, Đức)

- Thiết bị lọc chân không, Trung Quốc

- Máy xay mẫu Kalux, model AK-76, công suất 300 W, Trung Quốc

- Một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Catechol, Merck, độ tinh khiết 99,8%

- Acid ascorbic (C6H8O6), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,7%

- Acid citric (C6H8O7), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%

- Calcium chloride anhydrous (CaCl2), Trung Quốc, độ tinh khiết 96%

- Sodium chloride (NaCl), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%

- Sodium sunphite anhydrous (Na2SO3), Trung Quốc, độ tinh khiết 97%