* Mục đích: Xác định nhiệt độ tối thích của PPO đến sự hoạt động của enzyme PPO
trích ly từ ngó sen.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp
lại.
Nhân tố B: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm được bố trí ở 10 mức nhiệt độ
B1: 25 B2: 30 B3: 35 B4: 40
B5: 45 B6: 50 B7: 55 B8: 60
B9: 65 B10: 70
Tổng số nghiệm thức: 10 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 10 x 3 lần lặp lại = 30 mẫu
Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 30 mẫu x 100 g/mẫu = 3.000 (g)
* Cách tiến hành: Sau khi xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme, tiến
hành thí nghiệm 3 tương tự thí nghiệm 1 và 2, tuy nhiên sử dụng dung dịch đệm có pH thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm 2. Dịch trích enzyme thô sau khi ly tâm được cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 25 ÷ 70ºC (mẫu xử lý ở 25ºC được điều chỉnh nhiệt độ bằng nước đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 10 phút trước khi tiến hành phản ứng. Xác định cường độ hấp thu của phản ứng ở bước sóng 540 nm.
* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện nhiệt độ
khảo sát. Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối ưu.
3.3.5 Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ ngó sen
* Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme PPO trong các điều kiện xử
lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, (oC):
C1: 4 C2: 30 C3: 40
C4: 50 C5: 60 C6: 70
Tổng số nghiệm thức: 6 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 lần lặp lại = 18 mẫu
Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 18 mẫu x 100 g/mẫu = 1.800 (g)
* Cách tiến hành: Tiến hành ly trích enzyme thô, dịch trích enzyme thô sau khi ly tâm được cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 4 ÷ 70ºC (mẫu xử lý ở 4ºC được điều chỉnh nhiệt độ bằng nước đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 60 phút và tiến hành xác định quang phổ hấp thu bằng thiết bị đo quang phổ ở bước sóng 540 nm.
* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện nhiệt độ ủ.
Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO đã được xác định ở thí nghiệm 3.
* Kết quả thu nhận: Độ bền nhiệt của PPO từ ngó sen.
3.3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế và hoạt hóa đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen
* Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của các acid hữu cơ và muối ở các nồng độ khác
nhau đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase.
* Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với các 7 nhân tố: Nhân tố D1: Nồng độ (mM) FeCl3.6H2O (Fe3+)
D1.1: 1,0 D1.2: 2,0 D1.3: 3,0
D1.4: 4,0 D1.5: 5,0 D1.6: 6,0
Nhân tố D2: Nồng độ (mM) MgCl2.6H2O (Mg2+)
D2.1: 10 D2.2: 20 D2.3: 30
Nhân tố D3: Nồng độ (mM) CuSO4.5H2O (Cu2+) D3.1: 1 D3.2: 2 D3.3: 3 D3.4: 4 D3.5: 5 D3.6: 6 Nhân tố D4: Nồng độ (mM) MnSO4.H2O (Mn2+) D4.1: 1 D4.2: 2 D4.3: 3 D4.4: 4 D4.5: 5 D4.6: 6
Nhân tố D5: Nồng độ (mM) NaCl (Na+)
D5.1: 10 D5.2: 20 D5.3: 30
D5.4: 40 D5.5: 50 D5.6: 60
Nhân tố D6: Nồng độ (mM) acid ascorbic
D6.1: 10 D6.2: 20 D6.3: 30
D6.4: 40 D6.5: 50 D6.6: 60
Nhân tố D7: Nồng độ (mM) acid citric
D7.1: 10 D7.2: 20 D7.3: 30
D7.4: 40 D7.5: 50 D7.6: 60
* Cách tiến hành: Thí nghiệm được thực hiện tương tự các thí nghiệm trên (thí nghiệm 1 và 2). Nhiệt độ phản ứng được lựa chọn từ thí nghiệm 3 và pH tối ưu được xác định từ thí nghiệm 2. Dịch trích enzyme thô thu được cho vào các ống nghiệm, thêm các chất phụ gia riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất - enzyme và xác định cường độ hấp thu.
* Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính tương đối của enzyme PPO thô trong ngó sen sau khi xử lý với các phụ gia ở các nồng độ khảo sát.
* Kết quả: Xác định khả năng hoạt hóa hay ức chế của các loại phụ gia sử dụng đến sự hoạt động của PPO ngó sen.
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC VÀ HOẠT TÍNH ENZYME
BAN ĐẦU CỦA NGUYÊN LIỆ U NGÓ SEN
Mật độ quang (OD) thay đổi của phản ứng hóa nâu trong ngó sen để chuyển hóa catechol (cơ chất) thành benzoquinone (sản phẩm) dưới sự tham gia của PPO là cơ sở để xác định hoạt tính của PPO. Từ giá trị thay đổi mật độ quang OD (bước sóng 540 nm) đo được theo thời gian, thí nghiệm tiến hành xác định tốc độ phản ứng tương ứng với các giá trị nồng độ cơ chất V=f([S]). Kết quả phân tích sự thay đổi mật độ quang nhằm xác định hoạt tính của PPO trong ngó sen được thể hiện trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Sự thay đổi mật độ quang trong quá trình xác định hoạt tính của polyphenol oxidase trong ngó sen
Stt Thời gian (giây) Nồng độ catechol [S], M
0,0120 0,0060 0,0030 0,0015 0,00075 0,000375 0,000188 1 30 0,0657 0,0627 0,0597 0,0527 0,0465 0,0375 0,0353 2 60 0,0852 0,0617 0,0585 0,0480 0,0485 0,032 0,032 3 90 0,0787 0,0597 0,0595 0,0512 0,0452 0,030 0,028 4 120 0,0812 0,0615 0,0577 0,0495 0,0460 0,032 0,0301 5 150 0,0792 0,0597 0,0610 0,0530 0,0450 0,0312 0,0302 6 180 0,0700 0,0607 0,0592 0,1357 0,0452 0,0315 0,0305 7 V, (OD/giây) 0,00093 0,00085 0,00081 0,00078 0,00064 0,00046 0,00044 8 1/V,(OD/giây-1) 989,333 1192,13 1238,44 1291,57 1666,32 2173,91 2272,72 9 1/[S], M-1 83,33 166,66 333,33 666,66 1333,33 2666,66 5333,33
Từ kết quả thu nhận ở Bảng 4.1, đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng của enzyme trong ngó sen ban đầu được thể hiện ở Hình 4.1.a. Các thông số động học Km, Vmax được xác định theo phương pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f (1/[S]) (Hình 4.1.b) dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V (dòng 8) và 1/[S] (dòng 9) được thể hiện trong Bảng 4.1.
Từ đồ thị Hình 4.1.b cho thấy, các thông số động học của PPO như Vmax và Km có thể được xác định thông qua phương trình đường thẳng y (1/[V]) = 0,227x (1/[S]) + 1231 với R2= 0,947 có độ tin cậy ở mức chấp nhận. Nghiên cứu của Rong Bao-hua
et al. (2010) cũng đã sử dụng phương trình đường thẳng từ mô hình Lineweaver–
Burk với giá trị R2 = 0,878 để xác định Vmax và Km của PPO ngó sen. Đồ thị xác định các thông số động học Km và Vmax được thể hiện theo Hình 4.1.
a. Đồ thị Mischealis – Menten b. Đồ thị Lineweaver-Burk
Hình 4.1: Mô hình xác định các thông số động học Vmax, Km của PPO trong ngó sen
Qua kết quả phân tích, các thông số động học của PPO được xác định với hằng số Km là 0,246 mM và Vmax có giá trị tương ứng là 0,812.10-3 OD/giây = 0,812 đơn vị (U). Đồng thời, giá trị Vmax cũng tìm được dựa trên định nghĩa đã nêu, hoạt tính PPO tương ứng trong 1 mL dịch trích được tính là:
a = 0,812 (10-3 OD/giây) x (60 giây/ 1 phút/) x 1000/0,5 mL dịch enzyme phản ứng = 97,48 U/min/mL.
Với thể tích dịch trích V thu được là 46,5 mL, tương ứng với khối lượng mẫu ban đầu là 25,5 g và độ ẩm trung bình của ngó sen là 94,27% (dựa trên kết quả phân tích thành phần trong ngó sen). Do đó, hoạt tính PPO thô trong ngó sen ban đầu đạt đến 3274 (U/g chất khô của ngó sen). Kết quả phân tích hoạt tính PPO ban đầu nhận thấy, hoạt tính PPO trong ngó sen khá cao. Theo nghiên cứu của Rong Bao-hua et al. (2010) cũng xác định hoạt tính enzmye PPO trong nguyên liệu ngó sen, tuy
nhiên không xác định tổng lượng PPO có trong ngó sen mà chỉ dừng lại ở việc xác định hoạt tính PPO trong 1 mL thể tích dịch trích (ở cùng phương pháp khảo sát), giá trị PPO đo được là 103 U/mL. Đồng thời, giá trị Km của ngó sen ở điều kiện khảo sát là 0,246 mM cũng thấp hơn giá trị Km theo nghiên cứu của Rong Bao-hua
et al. (2010) là 0,344 mM. Km được gọi hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme, hằng số tốc độ phản ứng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Giá trị Km
trong nghiên cứu có giá trị tương đối nhỏ, vì thế ái lực của enzmye với cơ chất càng lớn, vân tốc của phản ứng càng lớn (Gouzi et al., 2010; Gnangui et al., 2010).
Ngoài ra, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố nhiệt độ và pH cũng như tác động của các thành phần đóng vai trò là chất hoạt hóa và ức chế lên hoạt động của ngó sen. Điều này có thể là do sự khác biệt về điều kiện thổ nhưỡng, giống sen và cách xử lý nguyên liệu sau thu hoạch (Kahn, 1983). Trong nghiên cứu của Arnnok et al. (2010), giá trị Km từ PPO trích ly từ quả ớt được tìm thấy là 33 mM, sử dụng catechol làm cơ chất. Các giá trị Km của PPO từ hạt xoài (24,6 mM) (Arogba et al., 1998); khoai tây (4,3 trên cơ chất L-DOPA) (Partington và Bolwell,
1996); lá trà (12,5 mM) (Halder et al., 1998); cây bạc hà (7,41 mM) (Neves et al.,
2009); mơ (6,6 mM) (Arslan et al.,1998).
Bên cạnh đó, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố nhiệt độ và pH cũng như tác động của các thành phần đóng vai trò là chất hoạt hóa và ức chế lên hoạt động của ngó sen. Do đó, nghiên cứu xác định các điều kiện tối thích cho hoạt động của PPO là rất cần thiết nhằm xác định chính xác điều kiện xử lý thích hợp và đạt hiệu quả.
4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN
Giá trị pH là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme PPO. Nhìn chung, hoạt tính PPO thay đổi ở các điều kiện pH khác nhau. Kết quả phân tích đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của PPO trong ngó sen được thể hiện ở Hình 4.2.
Hình 4.2: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối PPO của ngó sen
Dựa vào kết quả được thể hiện ở Hình 4.2 nhận thấy, hoạt tính tương đối PPO trong ngó sen có xu hướng tăng đạt đến giá trị cao nhất tại giá trị pH bằng 6,0 và sau đó giảm dần khi tăng giá trị pH đến 7,5. Ở pH bằng 4,0 hoạt tính tương đối của PPO từ ngó sen đạt giá trị thấp nhất (27,53% so với hoạt tính ở giá trị pH tối ưu). Kết quả nghiên cứu trên phù hợp với kết quả nghiên cứu của Rong Bao-hua et al. (2010) khi xác định pH tối ưu của PPO trong ngó sen (Trung Quốc) ở pH 6,0 khi sử dụng catechol như là cơ chất trong phản ứng. Bên cạnh đó, cơ chất dùng cho phản ứng và phương pháp trích ly cũng ảnh hưởng đến hoạt tính PPO (Yagar et al., 2000). Theo nghiên cứu của Alyward và Haisman (1969) nhận thấy, pH tối thích cho hoạt tính cao nhất của PPO trong thực vật trong dãy từ 5,0 đến 7,0 và phụ thuộc vào mức độ tinh sạch enzyme, loại đệm sử dụng và cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu.
Sự thay đổi pH dung dịch đệm trong phản ứng gây bất hoạt PPO ngó sen do sự thay đổi trong trạng thái ion của chuỗi amino acid liên quan trong phản ứng xúc tác, sự thay đổi trạng thái ion của cơ chất, sự thay đổi trạng thái cân bằng của phản ứng liên quan đến H+ hay OH- (Kuby, 1991).Qua kết quả xác định điều kiện pH tối thích của PPO nhận thấy, giá trị pH gần trung tính là điều kiện thích hợp cho hoạt động của PPO (Betrosian et al., 1960, Cash et al., 1976, Chan et al., 1971). Tuy nhiên, enyme
có giá trị pH cao hoặc thấp hơn ở một số loài như dâu tây (pH = 4,5) (Oktay et al., 1995) hoặc táo (pH = 9,0) (Wesche-Ebling và Montgomery, 1990). Tuy nhiên, việc điều khiển pH về mức giá trị thấp có thể ức chế hoạt động của PPO. Trên cơ sở nghiên cứu, việc điều chỉnh pH về mức pH nhỏ hoặc lớn hơn 6 có thể ức chế được hoạt tính của PPO, kiểm soát phản ứng hóa nâu là điều kiện để nguyên liệu ngó sen đạt phẩm chất tốt nhất.
Ngoài ảnh hưởng của yếu tố pH, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc rất lớn vào yếu tố nhiệt độ. Do đó, nghiên cứu xác định các điều kiện nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO là rất cần thiết nhằm xác định chính xác điều kiện nhiệt độ xử lý thích hợp và đạt hiệu quả. Dựa trên kết quả nghiên cứu, giá trị pH thích hợp cho hoạt động của PPO được trích ly từ ngó sen được lựa chọn là 6,0. Sử dụng giá trị pH này để tiến hành xác định các tính chất khác của PPO.
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
POLYPHENOL OXIDASE TRONG NGÓ SEN
Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzyme PPO không nhất định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ thích hợp càng thấp (Martinez, 1995). Nồng độ enzyme và cơ chất hoặc dạng tồn tại của enzyme cũng làm thay đổi đến nhiệt độ hoạt động thích hợp của enzyme. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme polyphenol oxydase được trình bày ở Hình 4.3.
Dựa vào kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tương đối PPO trong ngó sen nhận thấy, có sự khác biệt đáng kể ở các nhiệt độ khác nhau và hoạt tính tương đối của PPO ngó sen cao nhất được xác định ở 30oC. Hoạt tính tương đối có xu hướng giảm khi gia tăng nhiệt độ trên 30oC. Khi tăng nhiệt độ cao hơn 60oC, hoạt tính enzyme PPO ngó sen giảm hơn 50% so với hoạt tính ở nhiệt độ tối thích và Dựa trên lý thuyết, khi gia tăng nhiệt độ các cầu nối cấu trúc bên trong của PPO bị phá vỡ và trung tâm hoạt động của enzyme bị mất ổn định. Điều này dẫn đến PPO trở nên bị vô hoạt và không thể tham gia phản ứng hóa nâu (Betrosian et al., 1960).
Trong nghiên cứu này, nhiệt độ thấp nhất được sử dụng là 25oC thể hiện hoạt tính tương đối là thấp nhất trong số các nhiệt độ khảo sát. Ở nhiệt độ thấp, PPO có năng lượng thấp để di chuyển so với các mức nhiệt độ khảo sát khác dẫn đến tốc độ phản ứng xảy ra chậm. Nhiệt độ tối thích của PPO phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme (Eskin et al., 1971). Đa số các enzyme thể hiện nhiệt độ tối thích trong dãy nhiệt độ từ 30oC đến 40oC.
Xử lý nhiệt là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất do khả năng làm bất hoạt enzyme và ức chế vi sinh vật (Mashall et al., 2000). Nghiên cứu của Liu et al.
(2007) cũng như các thí nghiệm thăm dò cho thấy việc áp dụng xử lý nhiệt độ cao (trên 50C) là nguyên nhân làm mất cấu trúc của nguyên liệu đồng thời tác động biến đổi màu sắc không mong muốn, ảnh hưởng đến hương vị, làm tổn thất giá trị cảm quan và dinh dưỡng khó sử dụng cho các quá trình chế biến tiếp theo.
Kết quả khảo sát cho thấy, với nhiệt độ tối thích 30°C gần như cân bằng với nhiệt độ môi trường, đồng thời khi xử lý nhiệt đến 70°C, hoạt tính của PPO từ ngó sen vẫn duy trì (gần 12% hoạt tính PPO). Điều này cho thấy, ngó sen vẫn còn là đối tượng cho hoạt động hóa nâu do tác động của PPO. Một trong những vấn đề cần được quan tâm tiếp theo là khả năng chịu nhiệt của enzyme này, từ đó việc thiết lập phương thức xử lý chống hóa nâu enzyme.
4.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA ENZYME PPO THU NHẬN TỪ
NGÓ SEN
Tiến hành xác định khả năng chịu nhiệt của PPO từ ngó sen bằng cách ủ mẫu ở nhiệt độ khác nhau trong thời gian 1 giờ. Sự thay đổi hoạt tính của PPO khi so sánh