Acid citric là một loại acid hữu cơ thuộc loại yếu và thường được tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quýt. Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua. Ở lĩnh vực hóa sinh thì acid citric đóng vai trò quan trọng trong chu trình acid citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống. Ngoài ra acid citric cũng đóng vai trò là một chất tẩy rửa an toàn đối với môi trường và đồng thời cũng là một tác nhân chống oxy hóa.
Acid citric có nhiều trong các loại rau quả và được tìm thấy nhiều nhất trong trái chanh. Theo ước tính thì trong trái chanh acid citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô.
Hình 2.5: Công thức cấu tạo acid citric
(http://www.fulkersonwinery.com/product-detail/chemicals/citric-acid-2 oz)
Ở nhiệt độ phòng acid citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc dạng khan hoặc dạng monohydrate có chứa một phân tử nước trong mỗi phân tử của acid citric. Dạng khan của acid citric thì kết tinh trong nước nóng, ngược lại dạng monohydrate thì kết tinh trong nước lạnh, ở nhiệt độ 74C thì dạng monohdrat sẽ chuyển sang dạng khan. Về mặt hóa học thì acid citric cũng có tính chất tương tự như các dạng acid cacboxylic khác, khi nhiệt độ trên 175C thì nó sẽ bị phân hủy tạo thành CO2 và H2O. Theo Bohdziewicz et al., (1994), acid citric có khả năng tạo
phức với nhiều kim loại như sắt, đồng, mangan, magie. Nhờ vậy mà nó có khả năng chống oxy hóa hiệu quả trong các lĩnh vực bảo quản rau quả và nhiều loại thực phẩm khác.
Trong vai trò của một phụ gia thực phẩm, acid citric được sử dụng như là chất tạo hương vị và chất bảo quản trong thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là các loại đồ uống nhẹ, được ký hiệu là E330. Acid citric có tự nhiên trong cơ thể, trong thức ăn thông thường và được coi là không độc. Tuy nhiên nếu dùng nhiều và thường xuyên acid citric có thể làm hỏng men răng. Khi tiếp xúc với mắt nó có thể gây tổn thương mắt (Hoàng Ngọc Hùng và Vũ Chu Hùng, 2006).
Citric acid là một trong các acid được sử dụng rộng rãi nhất cho việc ức chế màu nâu trong các phản ứng hóa nâu do enzyme. Acid citric là một yếu acid hữu cơ tự nhiên thường được tìm thấy trong trái cây cirus và được sử dụng rộng rãi như là một phụ gia thực phẩm. Nó cũng được sử dụng với số lượng nhỏ như là một mềm thịt. Nồng độ acid citric cao hơn cho vị đắng, do đó việc sử dụng phụ gia thực phẩm này được giới hạn bởi liều lượng sử dụng. Acid citric thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm như là một phụ gia thực phẩm do có khả năng tạo cầu nối và khả năng cô lập các enzyme gây phản ứng hóa nâu. Citric acid là một tác nhân ức chế của PPO bằng cách giảm pH và kết hợp với nguyên tố đồng tại trung tâm hoạt động enzyme. Nó thường được dùng như là một tác nhân tạo tạo acid hóa có tác dụng tương tự như acid erythorbic (McCord và Kilara 1983). Acid Citric tạo môi trường acid mạnh với pH thấp có tác dụng ức chế hoạt tính PPO hoạt động mạnh ở pH 5÷7 (Paul & Palmer, 1972).
2.5.2 Acid ascorbic (C6H8O6)
Acid ascorbic là một hợp chất hữu cơ tự nhiên với các đặc tính chống oxy hóa, là chất rắn màu trắng, nhưng các mẫu không tinh khiết có thể xuất hiện màu vàng. Acid ascorbic dễ bị hòa tan trong nước và tạo ra môi trường acid nhẹ. Ascorbic còn có tính chất của vitamin C (L-ascorbic). Trong hóa học, ngoài L-ascobic acid thì acid ascorbic còn có một đồng phân khác là D-ascorbic acid nhưng dạng này không tồn tại trong tự nhiên, có thể được tổng hợp nhân tạo và có khả năng chống oxy hóa giống hệt như L-ascorbic. Tuy nhiên D-ascorbic thì lại không có nhiều hoạt tính vitamin C như là L-ascorbic acid (mặc dù không hoàn toàn là không). Điều này cho thấy khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic chỉ có một phần nhỏ vitamin tham gia hoạt động.
Hình 2.6: Công thức cấu tạo L-ascorbic acid
(http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc-pham/239-vitamin-c.html)
Acid ascorbic cũng có nguồn gốc tương tự như các phân tử đường, mang nhiều nhóm thế chứa oxy. Phân tử ascorbic acid tồn tại ở trạng thái cân bằng với hai dạng ketone và enol, trong đó dạng ketone ổn định hơn dạng enol. Như là một chất bị oxy hóa nhẹ, acid ascorbic bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí. Phản ứng này sẽ xảy ra nhanh chóng khi tiếp xúc thêm với các ion kim loại và ánh sáng, nó có thể bị oxy hóa một phần hoặc hoàn toàn tạo thành dehydroascorbic acid (Steele et al., 1976).
Ascorbat hoạt động như một chất chống oxy hóa, thường phản ứng với các oxy của các gốc tự do, chẳng hạn như các gốc tự do hydroxyl hình thành từ hydrogen peroxide, các gốc tự do này có thể gây tổn thương cho thực vật ở mức độ phân tử. Các hình thức tự oxy hóa của acid ascorbic thường không kèm theo các phản ứng phụ khác và không gây ảnh hưởng đến các mô của tế bào (Kim et al., 2002).
Ascorbic acid là một tác nhân có khả năng làm giảm tác động tạo màu nâu trong phản ứng hóa nâu. Nó tạo thành muối trung tính và tan trong nước. Acid ascorbic được công nhận là an toàn (GRAS) để sử dụng trong trái cây và rau quả và có lẽ là nhất được sử dụng rộng rãi (Lê Ngọc Tú, 2002).
Acid ascorbic và erythorbic đồng phân đã được sử dụng rộng rãi trong các công nghiệp thực phẩm do đặc tính chống oxy hóa của họ. Cả hai loại acid đóng vai trò thay đổi thế oxy hóa khử. Vai trò trong chống màu nâu là giảm o-quinon thành o- diphenols trong phản ứng hóa nâu do enzyme (Golan-Goldhirsh et al., 1984).
2.5.3 Natri chloride (NaCl)
Natri chloride là bột tinh thể màu trắng hay tinh thể không màu, vị mặn, không có mùi. Dung dịch natri chloride trong nước ăn mòn sắt, cũng có thể phản ứng tạo kết tủa với bạc, chì và thủy ngân; bị chất oxy hóa mạnh giải phóng Clo. NaCl có tác dụng ức chế sự hóa nâu. Tuy nhiên, để vô hoạt hoàn toàn phenolase cần NaCl có nồng độ cao. Nồng độ cao của NaCl có vị mặn không thích hợp trong nhiều trường hợp chế biến. Do đó, việc ngâm muối có một giá trị giới hạn. NaCl được biết đến như là tác nhân chống oxy hóa enzyme PPO; khả năng ức chế của enzyme PPO gia tăng khi pH giảm. Ion Cl- là một tác nhân ức chế hóa nâu yếu; một số tác giả đã báo cáo rằng nồng độ ion Cl- yêu cầu cho việc ức chế PPO là cao, và có thể tác động đến mùi vị của sản phẩm (Mayer và Harel, 1991). Trái lại, một vài tác giả tin rằng việc kiểm soát hóa nâu có thể thực hiện bằng cách ngâm dung dịch acid; pH ít nhất 3,5 (Rouet-Mayer và Philippon, 1986)
2.5.4 Calcium chloride(CaCl2)
Vai trò tích cực của dung dịch CaCl2 trong cải thiện cấu trúc đã được ứng dụng đối với nhiều loại rau quả. Sự cải thiện cấu trúc (độ cứng, độ giòn của rau quả) do tác động của việc ngâm nguyên liệu trong dung dịch CaCl2 chủ yếu nhờ vào vai trò của ion Ca2+ trong việc tạo sự ổn định hệ thống màng tế bào và hình thành calcium pectate, làm phiến giữa và vách tế bào trở nên rắn chắc hơn (Lee et al.,1979;
Hình 2.7. Sự tạo thành calcium-pectate ở trên tế bào thực vật
(Duvetter, 2007)
Mặt khác, muối calcium có thể tác động lên mô tế bào góp phần làm tăng tính nguyên vẹn của tế bào và kết quả là giữ vững hay tăng độ cứng của tế bào. Tuy nhiên, việc sử dụng CaCl2 thừa là nguyên nhân làm cho sản phẩm có vị đắng hay có mùi vị không tốt (Luna-Guzman el al., 2000) dư lượng của CaCl2 không thấm vào tế bào sẽ bám bên ngoài sản phẩm. Chính vì vậy, đối với mỗi loại nguyên liệu khác nhau cần phải được khảo sát nhằm xác định nồng độ dung dịch CaCl2 thích hợp.
2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN
Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của enzyme PPO đã và đang được nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Rong Bao-hua et al. (2010) đã xác định những ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các chất ức chế tác động lên hoạt tính PPO ngó sen và thiết lập phương trình phản ứng động học. Nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 30oC ở pH bằng 6,0. Hằng số Km và Vmax của phương trình động học tương ứng là 0,0344 mol/L, 172,41 U/mL. Cũng theo nghiên cứu này, enzyme PPO bị vô hoạt khi bị xử lý nhiệt ở 70C trong thời gian 60 phút, đồng thời ngó sen sau khi tiền xử lý 30 phút trong dung dịch 0,2% calcium chloride cho độ cứng của ngó sen duy trì không đổi so với ban đầu. Các nghiên cứu gần đây của Wang et al.
(2009), Xu et al. (2008) đã đưa ra giải pháp cải thiện chất lượng của ngó sen bằng
cách sử dụng bao gói thích hợp và tiền xử lý ngó sen bằng các tác nhân chống hóa nâu. Đồng thời, nghiên cứu của Xu et al. (2008) cũng đề nghị phương thức tiền xử
lý gồm L-cystein (0,3%) kết hợp acid citric (0,5%), acid ascorbic (0,2%) và NaCl (0,5%) kết hợp bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC nhằm ức chế sự hóa nâu và kéo dài thời gian bảo quản ngó sen tươi..
Trên thế giới enzyme PPO được thu nhận, tinh chế và khảo sát đặc tính từ lá trà xanh (Camellia sinensis) được thực hiện bởi nhiều tác giả như Halder, Tamuli và Bhaduri (1998) ; Unal et al. (2011). Ngoài ra PPO còn được thu nhận và khảo sát từ
Patwardhan, 1982), quả bơ (Kahn, 1983 và Lelyveld, 1984), quả khế (Adnan et al.,
1986), táo Amasya (Oktay et al., 1995), lá đậu xanh (Shin et al., 1996), khoai môn
(Yemenicioglu et al., 1997), cây thuốc lá (Richardson và McDougall, 1997), quả
mơ Malatya (Arslan et al., 1998), củ khoai tây (Partington, 1996 và 1999), quả vải (Jiang et al., 1999), cà phê (Mazzafera và Robinson, 2000), mủ cao su
(Wititsuwannakula et al., 2002), lá dâu tằm (Sutay, 2003), quả mảng cầu xiêm
(Bora et al., 2004), cây bạc hà Metha arvensis (Neves et al., 2009), quả anh đào (Jia et al., 2011), hoa dâm bụt (Madani et al., 2011),…
Một số nghiên cứu về PPO ở vi sinh vật cũng được thực hiện ở E.coli (Kim et al.,
2001), Thermomyces Lanuginosus (Astarci, 2003), Thermophilic bacillus sp
(Guray, 2009), … Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về PPO ở một số đối tượng khác như nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của PPO trong quá trình lên men cacao (Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009).
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, đặc điểm của PPO phụ thuộc rất lớn vào nguồn trích ly, cơ chất phản ứng và các điều kiện môi trường. Chính vì vậy, việc khảo sát tính chất của PPO phải được khảo sát một cách cụ thể trên từng đối tượng, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm
Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm
- Cân điện tử Vibra, model DJ - 1000TW, độ chính xác 0,01g, Nhật. - pH kế HANNA, model TOA pH meter HM - 12P, độ chính xác 0,01, Ý. - Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc
- Máy đo quang phổ Spectrophotometer, model U-2800, Hitachi, Nhật - Tủ lạnh Alaska, model LC-633A, Mỹ
- Lò sấy Sanaky, model VH-50HP, nhiệt độ 100 ÷ 250C, Trung Quốc - Bể điều nhiệt Memmert, model WB-10, công suất 1.250 W, Đức
- Nhiệt kế Hanna, model M-7860, -50 ÷ 150°C, độ chính xác 0,1°C, Mauritius - Máy lắc ống nghiệm, model IKA, Đức
- Micropipet 1.000 µL (Isolab, Đức) và 5 (Hirschoman, Đức) - Thiết bị lọc chân không, Trung Quốc
- Máy xay mẫu Kalux, model AK-76, công suất 300 W, Trung Quốc - Một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm.
3.1.3 Hóa chất sử dụng
- Catechol, Merck, độ tinh khiết 99,8%
- Acid ascorbic (C6H8O6), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,7% - Acid citric (C6H8O7), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%
- Calcium chloride anhydrous (CaCl2), Trung Quốc, độ tinh khiết 96%
- Sodium chloride (NaCl), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%
- Sodium dihydrogen phosphate dehydrate (NaH2PO4.2H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%
- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%
- Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3.6H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%
- Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4.5H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%
- Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết
98%
- Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2.4H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết
99%.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Ngó sen được lấy từ ruộng sen ở xã Thạnh Thới An, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng. Bao gói và bảo quản trong thùng xốp ở nhiệt độ từ 0 ÷ 4oC bằng nước đá, sau đó đem về phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa là 4 giờ.
Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, cắt khúc khoảng 5 ÷ 6 cm. Khối lượng mỗi mẫu xử lý là 100 g.
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị dịch trích enzyme thô PPO từ ngó sen
Phương pháp chuẩn bị dịch trích ly enzyme thô PPO được tiến hành dựa trên phương pháp của Chikezie (2000). Ngó sen sau khi mua về được rửa sạch, cắt nhỏ, cân khối lượng 100 g. Sau đó cho Na2SO3 lạnh vào đến khi ngập mẫu (1: 2) và ngâm 20 phút, tiến hành rửa với nước cất. Lấy 25 g mẫu ngó sen sau khi khi xử lý nghiền trong cối sứ, sau đó cho 50 mL dung dịch đệm phosphate pH = 7, giữ lạnh khoảng 3 phút. Hỗn hợp được lọc lạnh qua thiết bị lọc chân không, thu dịch lọc và tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 rpm trong thời gian 10 phút. Dung dịch sau khi lọc được dùng để xác định hoạt độ của enzyme polyphenol oxidase. Ghi nhận thể tích dịch trích enzyme V (mL) thu được sau ly tâm. Phần dịch trích sau ly tâm được giữ lạnh xuyên suốt trong quá trình đo quang phổ. Tiến hành xác định hoạt tính của PPO ở bước sóng 540 nm mỗi 30 giây.
3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme PPO
Hoạt tính của PPO (U/g) được tính toán dựa vào phương pháp của Ensimiger và Vamos –Vigyazo (1995, trích dẫn bởi Chikezie, 2000). Pha loãng các nồng độ của catechol theo dãy từ 0,012 M, 0,006 M, 0,003 M, 0,0015 M, 0,00075 M, 0,000375
M, 0,000188 M. Chuẩn bị dung dịch catechol có nồng độ 0,01 M. Mỗi ống nghiệm được thêm vào 1 mL dung dịch catechol 0,01 M . Sau đó bổ sung lần lượt 1 mL 0,1 M đệm phosphate (pH = 7,0), 3 mL nước cất và phản ứng enzyme được bắt đầu bằng việc bổ sung 0,5 mL dịch trích enzyme thô PPO sau khi được tinh sạch. Hỗn hợp này được nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 540 nm sau mỗi 30 giây phản ứng. Hoạt tính PPO tỷ lệ thuận với cường độ hấp thu cực đại của benzoquinones. Một đơn vị enzyme (U) là lượng enzyme cần thiết cho phản ứng oxy hóa quinine tạo thành benzoquinone tại bước sóng 540 nm lên 0,001 đơn vị trong 1 giây trong điều kiện phản ứng 25oC, pH = 7. Như vậy, 1 đơn vị enzyme U = 10-3.OD/ giây (Chikezie, 2000, Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009).
3.2.4 Xác định hoạt tính của enzyme PPO
Hoạt tính của PPO được tính dựa trên khối lượng ngó sen khô, theo công thức
𝐴 U/g ngó sen khô = 𝑎. 𝑉. 100 𝑚 100 − 𝑋
với a: hoạt tính của PPO trong 1 mL dịch trích (U/); V: thể tích dịch trích thu được (mL) ứng với khối lượng ngó sen tươi (m, g), X là độ ẩm của ngó sen trong mẫu khảo sát (%).
3.2.5 Xác định các thông số động học VM, KM của PPO ngó sen
Sử dụng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để xác định các thông số Km và Vmax của enzyme thô PPO trong nguyên liệu ngó sen ban đầu. Sơ đồ phản ứng của polyphenol oxidase ngó sen xúc tác chuyển hóa catechol thành benzoquinones được giả thiết theo cơ chế Michealis – Menten (cho phản ứng hai giai đoạn). Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn bằng phương trình Mischaelis-Menten: 𝐸 + 𝑆 𝑘−1 𝑘+1 𝐸𝑆 𝐸 + 𝑃𝑘2