Ngó sen được lấy từ ruộng sen ở xã Thạnh Thới An, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng. Bao gói và bảo quản trong thùng xốp ở nhiệt độ từ 0 ÷ 4oC bằng nước đá, sau đó đem về phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa là 4 giờ.
Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, cắt khúc khoảng 5 ÷ 6 cm. Khối lượng mỗi mẫu xử lý là 100 g.
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị dịch trích enzyme thô PPO từ ngó sen
Phương pháp chuẩn bị dịch trích ly enzyme thô PPO được tiến hành dựa trên phương pháp của Chikezie (2000). Ngó sen sau khi mua về được rửa sạch, cắt nhỏ, cân khối lượng 100 g. Sau đó cho Na2SO3 lạnh vào đến khi ngập mẫu (1: 2) và ngâm 20 phút, tiến hành rửa với nước cất. Lấy 25 g mẫu ngó sen sau khi khi xử lý nghiền trong cối sứ, sau đó cho 50 mL dung dịch đệm phosphate pH = 7, giữ lạnh khoảng 3 phút. Hỗn hợp được lọc lạnh qua thiết bị lọc chân không, thu dịch lọc và tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 rpm trong thời gian 10 phút. Dung dịch sau khi lọc được dùng để xác định hoạt độ của enzyme polyphenol oxidase. Ghi nhận thể tích dịch trích enzyme V (mL) thu được sau ly tâm. Phần dịch trích sau ly tâm được giữ lạnh xuyên suốt trong quá trình đo quang phổ. Tiến hành xác định hoạt tính của PPO ở bước sóng 540 nm mỗi 30 giây.
3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme PPO
Hoạt tính của PPO (U/g) được tính toán dựa vào phương pháp của Ensimiger và Vamos –Vigyazo (1995, trích dẫn bởi Chikezie, 2000). Pha loãng các nồng độ của catechol theo dãy từ 0,012 M, 0,006 M, 0,003 M, 0,0015 M, 0,00075 M, 0,000375
M, 0,000188 M. Chuẩn bị dung dịch catechol có nồng độ 0,01 M. Mỗi ống nghiệm được thêm vào 1 mL dung dịch catechol 0,01 M . Sau đó bổ sung lần lượt 1 mL 0,1 M đệm phosphate (pH = 7,0), 3 mL nước cất và phản ứng enzyme được bắt đầu bằng việc bổ sung 0,5 mL dịch trích enzyme thô PPO sau khi được tinh sạch. Hỗn hợp này được nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 540 nm sau mỗi 30 giây phản ứng. Hoạt tính PPO tỷ lệ thuận với cường độ hấp thu cực đại của benzoquinones. Một đơn vị enzyme (U) là lượng enzyme cần thiết cho phản ứng oxy hóa quinine tạo thành benzoquinone tại bước sóng 540 nm lên 0,001 đơn vị trong 1 giây trong điều kiện phản ứng 25oC, pH = 7. Như vậy, 1 đơn vị enzyme U = 10-3.OD/ giây (Chikezie, 2000, Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009).
3.2.4 Xác định hoạt tính của enzyme PPO
Hoạt tính của PPO được tính dựa trên khối lượng ngó sen khô, theo công thức
𝐴 U/g ngó sen khô = 𝑎. 𝑉. 100 𝑚 100 − 𝑋
với a: hoạt tính của PPO trong 1 mL dịch trích (U/); V: thể tích dịch trích thu được (mL) ứng với khối lượng ngó sen tươi (m, g), X là độ ẩm của ngó sen trong mẫu khảo sát (%).
3.2.5 Xác định các thông số động học VM, KM của PPO ngó sen
Sử dụng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để xác định các thông số Km và Vmax của enzyme thô PPO trong nguyên liệu ngó sen ban đầu. Sơ đồ phản ứng của polyphenol oxidase ngó sen xúc tác chuyển hóa catechol thành benzoquinones được giả thiết theo cơ chế Michealis – Menten (cho phản ứng hai giai đoạn). Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn bằng phương trình Mischaelis-Menten: 𝐸 + 𝑆 𝑘−1 𝑘+1 𝐸𝑆 𝐸 + 𝑃𝑘2 𝑉 = 𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] 1 𝑉 = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 + 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ 1 [𝑆]
Trong đó : Vmax : vận tốc cực đại của phản ứng (U, 10-3 OD/giây) ; Km : hằng số Michaelis-Menten (M) với cơ chất là catechol;
V: vận tốc phản ứng (U, 10-3 OD/giây) tương ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. Các thông số động học KM, VM được xác định bằng cách vẽ đồ thị theo phương pháp Lineweaver – Burk
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk
(Nguồn: Phan Thanh Bình và ctv, 2009)
Trong đó : Vmax là tốc độ cực đại của phản ứng (U, 10-3 OD/giây) Km là hằng số Michaelis-Menten (M) với cơ chất là catechol.
3.2.6 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Thông số tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho thí nghiệm tiếp theo.
Sử dụng phần mềm Excel, chương trình Statgraphics Centurion 15.1 để tính toán, xử lý các giá trị thí nghiệm và dùng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để xác định các thông số động học Vmax, Km của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen, từ đó làm cơ sở xác định hoạt tính A.
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Ngó sen ↓
Xử lý sơ bộ ← Phân tích độ ẩm, pH ↓
Thí nghiệm 1: Thiết lập các thông số động học cho hoạt động của enzyme PPO ↓
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PPO ↓
↓
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme PPO
trong ngó sen. ↓
↓
Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ ngó sen
↓
↓
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế và hoạt hóa đến hoạt tính của enzyme PPO trong ngó sen
↓
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
A2 A3 A…. A1 A7 …. A8 B2 B3 B…. B1 B9 …. B10 D7.6 D…. D1 D7 D..1 D..2 D..3 D..4 D..5 D..6 D7.1 D7.2 D7.3 D7.4 D7.5 D1.1 D1.2 D1.3 D1.4 D1.5 D1.6 C2 C3 C4. C1 C5 …. C6
3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (catechol) đến hoạt tính PPO trong ngó sen PPO trong ngó sen
* Mục đích: Xác định ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ cơ chất đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme PPO và thiết lập các thông số động học Vmax, Km cũng như hoạt tính enzyme PPO thô ban đầu của nguyên liệu ngó sen.
* Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu được thu nhận từ một số địa phương, vận
chuyển về phòng thí nghiệm, xử lý sơ bộ (rửa sạch, loại bỏ bùn, đất bám bên ngoài) và phân tích độ ẩm nguyên liệu ban đầu. Tiến hành ly trích enzyme PPO thô theo mục 3.2.2 và đo hoạt tính PPO theo phương pháp mô tả ở mục 3.2.3. Hoạt tính PPO được xác định ở các mức nồng độ cơ chất khảo sát từ 0,000188 ÷ 0,012 M. Ở mỗi ống nghiệm cho vào 1,0 mL catechol 0,01 M, 1 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH = 7) và 3 mL nước cất. Phản ứng xảy ra khi bổ sung 0,5 mL enzyme PPO và tiến hành đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 540 nm ở mỗi 30 giây (Chikezie, 2006).
* Kết quả thu nhận:
Vận tốc phản ứng V (U, 10-3 OD/giây) tương ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. Vẽ đồ thị biểu diễn và xác định hệ số góc của đường đo độ hấp thu của PPO theo thời gian. Xác định các thông số động học Km, Vmax, hoạt tính ban đầu của PPO trong ngó sen theo phương pháp Lineweaver – Burk.
3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen
* Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase ở các giá trị pH khác nhau. Đồng thời, xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzyme PPO trích ly từ ngó sen.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố
Nhân tố A: Giá trị pH được bố trí ở các mức độ khác nhau thay đổi ở 8 mức độ: A1: 4,0 A2: 4,5 A3: 5,0 A4: 5,5
A5: 6,0 A6: 6,5 A7: 7,0 A8: 7,5 Tổng số nghiệm thức: 8 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 8 x 3 lần lặp lại = 24 mẫu
Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 24 mẫu x 100 g/mẫu = 2.400 (g)
* Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định các thông số động học, tiến hành thí
ứng với cơ chất trong dung dịch đệm có pH thay đổi từ 4,0 ÷ 7,5. Hỗn hợp được nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu.
* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện pH khảo
sát. Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị pH tối ưu.
* Kết quả: Giá trị pH tối thích cho sự hoạt động của enzyme PPO được trích ly từ ngó sen.
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen. enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen.
* Mục đích: Xác định nhiệt độ tối thích của PPO đến sự hoạt động của enzyme PPO
trích ly từ ngó sen.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp
lại.
Nhân tố B: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm được bố trí ở 10 mức nhiệt độ
B1: 25 B2: 30 B3: 35 B4: 40
B5: 45 B6: 50 B7: 55 B8: 60
B9: 65 B10: 70
Tổng số nghiệm thức: 10 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 10 x 3 lần lặp lại = 30 mẫu
Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 30 mẫu x 100 g/mẫu = 3.000 (g)
* Cách tiến hành: Sau khi xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme, tiến
hành thí nghiệm 3 tương tự thí nghiệm 1 và 2, tuy nhiên sử dụng dung dịch đệm có pH thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm 2. Dịch trích enzyme thô sau khi ly tâm được cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 25 ÷ 70ºC (mẫu xử lý ở 25ºC được điều chỉnh nhiệt độ bằng nước đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 10 phút trước khi tiến hành phản ứng. Xác định cường độ hấp thu của phản ứng ở bước sóng 540 nm.
* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện nhiệt độ
khảo sát. Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối ưu.
3.3.5 Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ ngó sen
* Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme PPO trong các điều kiện xử
lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, (oC):
C1: 4 C2: 30 C3: 40
C4: 50 C5: 60 C6: 70
Tổng số nghiệm thức: 6 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 lần lặp lại = 18 mẫu
Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 18 mẫu x 100 g/mẫu = 1.800 (g)
* Cách tiến hành: Tiến hành ly trích enzyme thô, dịch trích enzyme thô sau khi ly tâm được cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 4 ÷ 70ºC (mẫu xử lý ở 4ºC được điều chỉnh nhiệt độ bằng nước đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 60 phút và tiến hành xác định quang phổ hấp thu bằng thiết bị đo quang phổ ở bước sóng 540 nm.
* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện nhiệt độ ủ.
Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO đã được xác định ở thí nghiệm 3.
* Kết quả thu nhận: Độ bền nhiệt của PPO từ ngó sen.
3.3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế và hoạt hóa đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen
* Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của các acid hữu cơ và muối ở các nồng độ khác
nhau đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase.
* Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với các 7 nhân tố: Nhân tố D1: Nồng độ (mM) FeCl3.6H2O (Fe3+)
D1.1: 1,0 D1.2: 2,0 D1.3: 3,0
D1.4: 4,0 D1.5: 5,0 D1.6: 6,0
Nhân tố D2: Nồng độ (mM) MgCl2.6H2O (Mg2+)
D2.1: 10 D2.2: 20 D2.3: 30
Nhân tố D3: Nồng độ (mM) CuSO4.5H2O (Cu2+) D3.1: 1 D3.2: 2 D3.3: 3 D3.4: 4 D3.5: 5 D3.6: 6 Nhân tố D4: Nồng độ (mM) MnSO4.H2O (Mn2+) D4.1: 1 D4.2: 2 D4.3: 3 D4.4: 4 D4.5: 5 D4.6: 6
Nhân tố D5: Nồng độ (mM) NaCl (Na+)
D5.1: 10 D5.2: 20 D5.3: 30
D5.4: 40 D5.5: 50 D5.6: 60
Nhân tố D6: Nồng độ (mM) acid ascorbic
D6.1: 10 D6.2: 20 D6.3: 30
D6.4: 40 D6.5: 50 D6.6: 60
Nhân tố D7: Nồng độ (mM) acid citric
D7.1: 10 D7.2: 20 D7.3: 30
D7.4: 40 D7.5: 50 D7.6: 60
* Cách tiến hành: Thí nghiệm được thực hiện tương tự các thí nghiệm trên (thí nghiệm 1 và 2). Nhiệt độ phản ứng được lựa chọn từ thí nghiệm 3 và pH tối ưu được xác định từ thí nghiệm 2. Dịch trích enzyme thô thu được cho vào các ống nghiệm, thêm các chất phụ gia riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất - enzyme và xác định cường độ hấp thu.
* Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính tương đối của enzyme PPO thô trong ngó sen sau khi xử lý với các phụ gia ở các nồng độ khảo sát.
* Kết quả: Xác định khả năng hoạt hóa hay ức chế của các loại phụ gia sử dụng đến sự hoạt động của PPO ngó sen.
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC VÀ HOẠT TÍNH ENZYME
BAN ĐẦU CỦA NGUYÊN LIỆ U NGÓ SEN
Mật độ quang (OD) thay đổi của phản ứng hóa nâu trong ngó sen để chuyển hóa catechol (cơ chất) thành benzoquinone (sản phẩm) dưới sự tham gia của PPO là cơ sở để xác định hoạt tính của PPO. Từ giá trị thay đổi mật độ quang OD (bước sóng 540 nm) đo được theo thời gian, thí nghiệm tiến hành xác định tốc độ phản ứng tương ứng với các giá trị nồng độ cơ chất V=f([S]). Kết quả phân tích sự thay đổi mật độ quang nhằm xác định hoạt tính của PPO trong ngó sen được thể hiện trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Sự thay đổi mật độ quang trong quá trình xác định hoạt tính của polyphenol oxidase trong ngó sen
Stt Thời gian (giây) Nồng độ catechol [S], M
0,0120 0,0060 0,0030 0,0015 0,00075 0,000375 0,000188 1 30 0,0657 0,0627 0,0597 0,0527 0,0465 0,0375 0,0353 2 60 0,0852 0,0617 0,0585 0,0480 0,0485 0,032 0,032 3 90 0,0787 0,0597 0,0595 0,0512 0,0452 0,030 0,028 4 120 0,0812 0,0615 0,0577 0,0495 0,0460 0,032 0,0301 5 150 0,0792 0,0597 0,0610 0,0530 0,0450 0,0312 0,0302 6 180 0,0700 0,0607 0,0592 0,1357 0,0452 0,0315 0,0305 7 V, (OD/giây) 0,00093 0,00085 0,00081 0,00078 0,00064 0,00046 0,00044 8 1/V,(OD/giây-1) 989,333 1192,13 1238,44 1291,57 1666,32 2173,91 2272,72 9 1/[S], M-1 83,33 166,66 333,33 666,66 1333,33 2666,66 5333,33
Từ kết quả thu nhận ở Bảng 4.1, đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng của enzyme trong ngó sen ban đầu được thể hiện ở Hình 4.1.a. Các thông số động học Km, Vmax được xác định theo phương pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f (1/[S]) (Hình 4.1.b) dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V (dòng 8) và 1/[S] (dòng 9) được thể hiện trong Bảng 4.1.
Từ đồ thị Hình 4.1.b cho thấy, các thông số động học của PPO như Vmax và Km có thể được xác định thông qua phương trình đường thẳng y (1/[V]) = 0,227x (1/[S]) + 1231 với R2= 0,947 có độ tin cậy ở mức chấp nhận. Nghiên cứu của Rong Bao-hua
et al. (2010) cũng đã sử dụng phương trình đường thẳng từ mô hình Lineweaver–
Burk với giá trị R2 = 0,878 để xác định Vmax và Km của PPO ngó sen. Đồ thị xác định các thông số động học Km và Vmax được thể hiện theo Hình 4.1.
a. Đồ thị Mischealis – Menten b. Đồ thị Lineweaver-Burk
Hình 4.1: Mô hình xác định các thông số động học Vmax, Km của PPO trong ngó sen
Qua kết quả phân tích, các thông số động học của PPO được xác định với hằng số