Natri chloride (NaCl)

Natri chloride là bột tinh thể màu trắng hay tinh thể không màu, vị mặn, không có mùi. Dung dịch natri chloride trong nước ăn mòn sắt, cũng có thể phản ứng tạo kết tủa với bạc, chì và thủy ngân; bị chất oxy hóa mạnh giải phóng Clo. NaCl có tác dụng ức chế sự hóa nâu. Tuy nhiên, để vô hoạt hoàn toàn phenolase cần NaCl có nồng độ cao. Nồng độ cao của NaCl có vị mặn không thích hợp trong nhiều trường hợp chế biến. Do đó, việc ngâm muối có một giá trị giới hạn. NaCl được biết đến như là tác nhân chống oxy hóa enzyme PPO; khả năng ức chế của enzyme PPO gia tăng khi pH giảm. Ion Cl- là một tác nhân ức chế hóa nâu yếu; một số tác giả đã báo cáo rằng nồng độ ion Cl- yêu cầu cho việc ức chế PPO là cao, và có thể tác động đến mùi vị của sản phẩm (Mayer và Harel, 1991). Trái lại, một vài tác giả tin rằng việc kiểm soát hóa nâu có thể thực hiện bằng cách ngâm dung dịch acid; pH ít nhất 3,5 (Rouet-Mayer và Philippon, 1986)

2.5.4 Calcium chloride(CaCl2)

Vai trò tích cực của dung dịch CaCl2 trong cải thiện cấu trúc đã được ứng dụng đối với nhiều loại rau quả. Sự cải thiện cấu trúc (độ cứng, độ giòn của rau quả) do tác động của việc ngâm nguyên liệu trong dung dịch CaCl2 chủ yếu nhờ vào vai trò của ion Ca2+ trong việc tạo sự ổn định hệ thống màng tế bào và hình thành calcium pectate, làm phiến giữa và vách tế bào trở nên rắn chắc hơn (Lee et al.,1979;

Hình 2.7. Sự tạo thành calcium-pectate ở trên tế bào thực vật

(Duvetter, 2007)

Mặt khác, muối calcium có thể tác động lên mô tế bào góp phần làm tăng tính nguyên vẹn của tế bào và kết quả là giữ vững hay tăng độ cứng của tế bào. Tuy nhiên, việc sử dụng CaCl2 thừa là nguyên nhân làm cho sản phẩm có vị đắng hay có mùi vị không tốt (Luna-Guzman el al., 2000) dư lượng của CaCl2 không thấm vào tế bào sẽ bám bên ngoài sản phẩm. Chính vì vậy, đối với mỗi loại nguyên liệu khác nhau cần phải được khảo sát nhằm xác định nồng độ dung dịch CaCl2 thích hợp.

2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của enzyme PPO đã và đang được nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Rong Bao-hua et al. (2010) đã xác định những ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các chất ức chế tác động lên hoạt tính PPO ngó sen và thiết lập phương trình phản ứng động học. Nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 30oC ở pH bằng 6,0. Hằng số Km và Vmax của phương trình động học tương ứng là 0,0344 mol/L, 172,41 U/mL. Cũng theo nghiên cứu này, enzyme PPO bị vô hoạt khi bị xử lý nhiệt ở 70C trong thời gian 60 phút, đồng thời ngó sen sau khi tiền xử lý 30 phút trong dung dịch 0,2% calcium chloride cho độ cứng của ngó sen duy trì không đổi so với ban đầu. Các nghiên cứu gần đây của Wang et al.

(2009), Xu et al. (2008) đã đưa ra giải pháp cải thiện chất lượng của ngó sen bằng

cách sử dụng bao gói thích hợp và tiền xử lý ngó sen bằng các tác nhân chống hóa nâu. Đồng thời, nghiên cứu của Xu et al. (2008) cũng đề nghị phương thức tiền xử

lý gồm L-cystein (0,3%) kết hợp acid citric (0,5%), acid ascorbic (0,2%) và NaCl (0,5%) kết hợp bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC nhằm ức chế sự hóa nâu và kéo dài thời gian bảo quản ngó sen tươi..

Trên thế giới enzyme PPO được thu nhận, tinh chế và khảo sát đặc tính từ lá trà xanh (Camellia sinensis) được thực hiện bởi nhiều tác giả như Halder, Tamuli và Bhaduri (1998) ; Unal et al. (2011). Ngoài ra PPO còn được thu nhận và khảo sát từ

Patwardhan, 1982), quả bơ (Kahn, 1983 và Lelyveld, 1984), quả khế (Adnan et al.,

1986), táo Amasya (Oktay et al., 1995), lá đậu xanh (Shin et al., 1996), khoai môn

(Yemenicioglu et al., 1997), cây thuốc lá (Richardson và McDougall, 1997), quả

mơ Malatya (Arslan et al., 1998), củ khoai tây (Partington, 1996 và 1999), quả vải (Jiang et al., 1999), cà phê (Mazzafera và Robinson, 2000), mủ cao su

(Wititsuwannakula et al., 2002), lá dâu tằm (Sutay, 2003), quả mảng cầu xiêm

(Bora et al., 2004), cây bạc hà Metha arvensis (Neves et al., 2009), quả anh đào (Jia et al., 2011), hoa dâm bụt (Madani et al., 2011),…

Một số nghiên cứu về PPO ở vi sinh vật cũng được thực hiện ở E.coli (Kim et al.,

2001), Thermomyces Lanuginosus (Astarci, 2003), Thermophilic bacillus sp

(Guray, 2009), … Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về PPO ở một số đối tượng khác như nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của PPO trong quá trình lên men cacao (Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009).

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, đặc điểm của PPO phụ thuộc rất lớn vào nguồn trích ly, cơ chất phản ứng và các điều kiện môi trường. Chính vì vậy, việc khảo sát tính chất của PPO phải được khảo sát một cách cụ thể trên từng đối tượng, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm

Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Cân điện tử Vibra, model DJ - 1000TW, độ chính xác 0,01g, Nhật. - pH kế HANNA, model TOA pH meter HM - 12P, độ chính xác 0,01, Ý. - Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc

- Máy đo quang phổ Spectrophotometer, model U-2800, Hitachi, Nhật - Tủ lạnh Alaska, model LC-633A, Mỹ

- Lò sấy Sanaky, model VH-50HP, nhiệt độ 100 ÷ 250C, Trung Quốc - Bể điều nhiệt Memmert, model WB-10, công suất 1.250 W, Đức

- Nhiệt kế Hanna, model M-7860, -50 ÷ 150°C, độ chính xác 0,1°C, Mauritius - Máy lắc ống nghiệm, model IKA, Đức

- Micropipet 1.000 µL (Isolab, Đức) và 5 (Hirschoman, Đức) - Thiết bị lọc chân không, Trung Quốc

- Máy xay mẫu Kalux, model AK-76, công suất 300 W, Trung Quốc - Một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm.

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Catechol, Merck, độ tinh khiết 99,8%

- Acid ascorbic (C6H8O6), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,7% - Acid citric (C6H8O7), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%

- Calcium chloride anhydrous (CaCl2), Trung Quốc, độ tinh khiết 96%

- Sodium chloride (NaCl), Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%

- Sodium dihydrogen phosphate dehydrate (NaH2PO4.2H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%

- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%

- Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3.6H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%

- Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4.5H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết 99%

- Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết

98%

- Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2.4H2O), Trung Quốc, độ tinh khiết

99%.

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Ngó sen được lấy từ ruộng sen ở xã Thạnh Thới An, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng. Bao gói và bảo quản trong thùng xốp ở nhiệt độ từ 0 ÷ 4oC bằng nước đá, sau đó đem về phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa là 4 giờ.

Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, cắt khúc khoảng 5 ÷ 6 cm. Khối lượng mỗi mẫu xử lý là 100 g.

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị dịch trích enzyme thô PPO từ ngó sen

Phương pháp chuẩn bị dịch trích ly enzyme thô PPO được tiến hành dựa trên phương pháp của Chikezie (2000). Ngó sen sau khi mua về được rửa sạch, cắt nhỏ, cân khối lượng 100 g. Sau đó cho Na2SO3 lạnh vào đến khi ngập mẫu (1: 2) và ngâm 20 phút, tiến hành rửa với nước cất. Lấy 25 g mẫu ngó sen sau khi khi xử lý nghiền trong cối sứ, sau đó cho 50 mL dung dịch đệm phosphate pH = 7, giữ lạnh khoảng 3 phút. Hỗn hợp được lọc lạnh qua thiết bị lọc chân không, thu dịch lọc và tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 rpm trong thời gian 10 phút. Dung dịch sau khi lọc được dùng để xác định hoạt độ của enzyme polyphenol oxidase. Ghi nhận thể tích dịch trích enzyme V (mL) thu được sau ly tâm. Phần dịch trích sau ly tâm được giữ lạnh xuyên suốt trong quá trình đo quang phổ. Tiến hành xác định hoạt tính của PPO ở bước sóng 540 nm mỗi 30 giây.

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme PPO

Hoạt tính của PPO (U/g) được tính toán dựa vào phương pháp của Ensimiger và Vamos –Vigyazo (1995, trích dẫn bởi Chikezie, 2000). Pha loãng các nồng độ của catechol theo dãy từ 0,012 M, 0,006 M, 0,003 M, 0,0015 M, 0,00075 M, 0,000375

M, 0,000188 M. Chuẩn bị dung dịch catechol có nồng độ 0,01 M. Mỗi ống nghiệm được thêm vào 1 mL dung dịch catechol 0,01 M . Sau đó bổ sung lần lượt 1 mL 0,1 M đệm phosphate (pH = 7,0), 3 mL nước cất và phản ứng enzyme được bắt đầu bằng việc bổ sung 0,5 mL dịch trích enzyme thô PPO sau khi được tinh sạch. Hỗn hợp này được nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 540 nm sau mỗi 30 giây phản ứng. Hoạt tính PPO tỷ lệ thuận với cường độ hấp thu cực đại của benzoquinones. Một đơn vị enzyme (U) là lượng enzyme cần thiết cho phản ứng oxy hóa quinine tạo thành benzoquinone tại bước sóng 540 nm lên 0,001 đơn vị trong 1 giây trong điều kiện phản ứng 25oC, pH = 7. Như vậy, 1 đơn vị enzyme U = 10-3.OD/ giây (Chikezie, 2000, Phan Thanh Bình và cộng sự, 2009).

3.2.4 Xác định hoạt tính của enzyme PPO

Hoạt tính của PPO được tính dựa trên khối lượng ngó sen khô, theo công thức

𝐴 U/g ngó sen khô = 𝑎. 𝑉. 100 𝑚 100 − 𝑋

với a: hoạt tính của PPO trong 1 mL dịch trích (U/); V: thể tích dịch trích thu được (mL) ứng với khối lượng ngó sen tươi (m, g), X là độ ẩm của ngó sen trong mẫu khảo sát (%).

3.2.5 Xác định các thông số động học VM, KM của PPO ngó sen

Sử dụng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để xác định các thông số Km và Vmax của enzyme thô PPO trong nguyên liệu ngó sen ban đầu. Sơ đồ phản ứng của polyphenol oxidase ngó sen xúc tác chuyển hóa catechol thành benzoquinones được giả thiết theo cơ chế Michealis – Menten (cho phản ứng hai giai đoạn). Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn bằng phương trình Mischaelis-Menten: 𝐸 + 𝑆 𝑘−1 𝑘+1 𝐸𝑆 𝐸 + 𝑃𝑘2 𝑉 = 𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] 1 𝑉 = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 + 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ 1 [𝑆]

Trong đó : Vmax : vận tốc cực đại của phản ứng (U, 10-3 OD/giây) ; Km : hằng số Michaelis-Menten (M) với cơ chất là catechol;

V: vận tốc phản ứng (U, 10-3 OD/giây) tương ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. Các thông số động học KM, VM được xác định bằng cách vẽ đồ thị theo phương pháp Lineweaver – Burk

Hình 3.1: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk

(Nguồn: Phan Thanh Bình và ctv, 2009)

Trong đó : Vmax là tốc độ cực đại của phản ứng (U, 10-3 OD/giây) Km là hằng số Michaelis-Menten (M) với cơ chất là catechol.

3.2.6 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Thông số tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho thí nghiệm tiếp theo.

Sử dụng phần mềm Excel, chương trình Statgraphics Centurion 15.1 để tính toán, xử lý các giá trị thí nghiệm và dùng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để xác định các thông số động học Vmax, Km của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen, từ đó làm cơ sở xác định hoạt tính A.

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Ngó sen ↓

Xử lý sơ bộ ← Phân tích độ ẩm, pH ↓

Thí nghiệm 1: Thiết lập các thông số động học cho hoạt động của enzyme PPO ↓

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PPO ↓

↓

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme PPO

trong ngó sen. ↓

↓

Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ ngó sen

↓

↓

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế và hoạt hóa đến hoạt tính của enzyme PPO trong ngó sen

↓

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

A2 A3 A…. A1 A7 …. A8 B2 B3 B…. B1 B9 …. B10 D7.6 D…. D1 D7 D..1 D..2 D..3 D..4 D..5 D..6 D7.1 D7.2 D7.3 D7.4 D7.5 D1.1 D1.2 D1.3 D1.4 D1.5 D1.6 C2 C3 C4. C1 C5 …. C6

3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (catechol) đến hoạt tính PPO trong ngó sen PPO trong ngó sen

* Mục đích: Xác định ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ cơ chất đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme PPO và thiết lập các thông số động học Vmax, Km cũng như hoạt tính enzyme PPO thô ban đầu của nguyên liệu ngó sen.

* Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu được thu nhận từ một số địa phương, vận

chuyển về phòng thí nghiệm, xử lý sơ bộ (rửa sạch, loại bỏ bùn, đất bám bên ngoài) và phân tích độ ẩm nguyên liệu ban đầu. Tiến hành ly trích enzyme PPO thô theo mục 3.2.2 và đo hoạt tính PPO theo phương pháp mô tả ở mục 3.2.3. Hoạt tính PPO được xác định ở các mức nồng độ cơ chất khảo sát từ 0,000188 ÷ 0,012 M. Ở mỗi ống nghiệm cho vào 1,0 mL catechol 0,01 M, 1 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH = 7) và 3 mL nước cất. Phản ứng xảy ra khi bổ sung 0,5 mL enzyme PPO và tiến hành đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 540 nm ở mỗi 30 giây (Chikezie, 2006).

* Kết quả thu nhận:

Vận tốc phản ứng V (U, 10-3 OD/giây) tương ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. Vẽ đồ thị biểu diễn và xác định hệ số góc của đường đo độ hấp thu của PPO theo thời gian. Xác định các thông số động học Km, Vmax, hoạt tính ban đầu của PPO trong ngó sen theo phương pháp Lineweaver – Burk.

3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen

* Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase ở các giá trị pH khác nhau. Đồng thời, xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzyme PPO trích ly từ ngó sen.

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố

Nhân tố A: Giá trị pH được bố trí ở các mức độ khác nhau thay đổi ở 8 mức độ: A1: 4,0 A2: 4,5 A3: 5,0 A4: 5,5

A5: 6,0 A6: 6,5 A7: 7,0 A8: 7,5 Tổng số nghiệm thức: 8 nghiệm thức

Tổng số mẫu thí nghiệm: 8 x 3 lần lặp lại = 24 mẫu

Tổng khối lượng mẫu thí nghiệm: 24 mẫu x 100 g/mẫu = 2.400 (g)

* Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định các thông số động học, tiến hành thí

ứng với cơ chất trong dung dịch đệm có pH thay đổi từ 4,0 ÷ 7,5. Hỗn hợp được nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu.

* Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tương ứng với từng điều kiện pH khảo

sát. Hoạt tính PPO được xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị pH tối ưu.

* Kết quả: Giá trị pH tối thích cho sự hoạt động của enzyme PPO được trích ly từ ngó sen.

3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen. enzyme polyphenol oxidase trong ngó sen.

* Mục đích: Xác định nhiệt độ tối thích của PPO đến sự hoạt động của enzyme PPO

trích ly từ ngó sen.

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp

lại.

Nhân tố B: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm được bố trí ở 10 mức nhiệt độ

B1: 25 B2: 30 B3: 35 B4: 40

B5: 45 B6: 50 B7: 55 B8: 60

B9: 65 B10: 70

Tổng số nghiệm thức: 10 nghiệm thức

Tổng số mẫu thí nghiệm: 10 x 3 lần lặp lại = 30 mẫu