Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thự

MỞ ĐẦU Polyphenol oxidase PPO là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong các loài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol thành quino

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012

∆OD : Hiệu số giá trị mật độ quang

PPO : Polyphenol oxidase

ΣUI : Tổng đơn vị hoạt độ E

VddE : Thể tích dung dịch enzyme

VEthanol : Thể tích ethanol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau 18

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi 36

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO 41

Bảng 2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford 42

Bảng 3.1 Độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50

Bảng 3.2 Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu 50

Bảng 3.3 Hàm lượng protein trong nguyên liệu 51

Bảng 3.4 Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu 51

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của

PPO 54

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của

PPO 56

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của

PPO theo thời gian 57

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO 59

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian 61

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO 62

Bảng 3.13 Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN) 64

Bảng 3.14 Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN) 65

Bảng 3.15 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả 69

Bảng 3.16 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả 69

Bảng 3.17 Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả 70

Bảng 3.18 Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả 71

Bảng 3.19 Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 71 Bảng 5.1 Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin 83 Bảng 5.2 Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong

nguyên liệu 84 Bảng 5.3 Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO từ nguyên liệu 84 Bảng 5.4 Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động

của PPO 85 Bảng 5.5 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ

bền của PPO 86 Bảng 5.6 Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt

động của PPO 87 Bảng 5.7 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến

độ bền của PPO 88 Bảng 5.8 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ

đến độ bền của PPO theo thời gian 89 Bảng 5.9 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ

chất đến hoạt độ của PPO 92 Bảng 5.10 Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của

PPO theo thời gian 93 Bảng 5.11 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid

ascorbic đến hoạt độ của PPO 94 Bảng 5.12 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric

đến hoạt độ của PPO 95 Bảng 5.13 Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến

hoạt độ của PPO 96 Bảng 5.14 Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen

(mẫu TN) 97 Bảng 5.15 Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh

(mẫu TN) 97

Bảng 5.16 Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô

từ nguyên liệu 98 Bảng 5.17 Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong

CPE – PPO thô 98 Bảng 5.18 Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của

benzoquinon ở bước sóng 420nm 98 Bảng 5.19 Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin 100 Bảng 5.20 Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch

nghiên cứu 100 Bảng 5.21 Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin 101 Bảng 5.22 Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của enzyme

bromelin và ficin 102 Bảng 5.23 Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và

enzyme ficin 102

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH MINH HỌA

Trang

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3 Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của

PPO 62

ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 54

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO 55

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 58

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO 60

Đồ thị 3.7 Động học phản ứng PPO theo thời gian 61

Đồ thị 3.8 Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen

(mẫu TN) 64

Đồ thị 3.9 Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh

(mẫu TN) 66

Đồ thị 5.1 Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin 84

Đồ thị 5.2 Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon 99

Đồ thị 5.3 Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin 101

HÌNH MINH HỌA

Hình 1.1 Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase 9

Hình 1.2 Cấu trúc của tyrosinase 10

Hình 1.3 Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase 12

Hình 1.4 Phản ứng xúc tác của laccase 13

Hình 1.5 Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của laccase 14

Hình 1.6 Cơ chế xúc tác của laccase 15

Hình 1.7 (a) Chu trình xúc tác của laccase (b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator 16

Hình 1.8 Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên 33

Hình 1.9 Cây trà 35

Hình 3.1 Sản phẩm trà xanh 67

Hình 3.2 Sản phẩm trà đen 67

Hình 3.3 Nước trà đen và trà xanh 68

Hình 5.1 Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol 103

Hình 5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây 103

Hình 5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây 104

Hình 5.4 Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây 104

Hình 5.5 Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây 105

Hình 5.6 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây 105

Hình 5.7 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây 106

Hình 5.8 Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây 106

Hình 5.9 Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây 107

Hình 5.10 Chế phẩm PPO thô từ lá trà 107

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ, đồ thị và hình minh họa

Trang

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử 3

1.1.1 Các dehydrogenase 3

1.1.1.1 Dehydrogenase – piridin 3

1.1.1.2 Dehydrogenase – flavin 4

1.1.1.3 Dehydrogenase – ubiquinon (UQ) 5

1.1.2 Các oxydase 6

1.2 Enzyme polyphenol oxidase 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Nguồn thu nhận PPO 8

1.2.3 Phân loại 8

1.2.3.1 Tyrosinase và catechol oxidase 9

1.2.3.2 Laccase 12

1.2.4 Tính chất của PPO 17

1.2.5 Một số công trình nghiên cứu về PPO 22

1.2.6 Chức năng sinh học của PPO 22

1.2.7 Ứng dụng của PPO 23

1.2.7.1 Trong công nghiệp thực phẩm 24

1.2.7.2 Trong các ngành công nghiệp khác 25

1.2.7.3 Trong công nghệ môi trường 26

1.2.7.4 Trong y học và mỹ phẩm 26

1.2.7.5 Trong công nghệ sinh học nano 27

1.2.8 Sự ức chế PPO 27

1.2.8.1 Phương pháp vật lý 28

1.2.8.2 Phương pháp hóa học 29

1.2.8.3 Phương pháp enzyme 32

1.2.8.4 Phương pháp gen 32

1.2.9 Cơ chất của PPO: Phenol 33

1.3 Cây trà và các sản phẩm từ trà 34

1.3.1 Giới thiệu chung về cây trà 34

1.3.2 Các sản phẩm từ trà 36

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

2.1 Vật liệu 39

2.1.1 Nguyên liệu 39

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 39

2.1.3 Hóa chất 39

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm của lá trà 39

2.2.2 Phương pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu 40

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ của PPO 40

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích 41

2.2.5 Xác định hoạt độ riêng của PPO 42

2.2.6 Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của PPO 43

2.2.6.1 Phương pháp xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO 43

2.2.6.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 43

2.2.6.3 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 43

2.2.6.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền

của PPO 44

2.2.6.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 44

2.2.6.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO 45

2.2.6.7 Phương pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian 45

2.2.6.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO 45

2.2.7 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà 46

2.2.7.1 Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà 46

2.2.7.2 Phương pháp chế biến trà đen 46

2.2.7.3 Phương pháp chế biến trà xanh 47

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây 48

2.2.9 Phương pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 49

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50

3.1 Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu 50

3.1.1 Xác định độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50

3.1.2 Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu 50

3.1.3 Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu 51

3.1.4 Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu 51

3.2 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hoạt động của PPO trong lá trà nguyên liệu 52

3.2.1 Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của PPO 52

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53

3.2.3 Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 54

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 57

3.2.6 Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của PPO 59

3.2.7 Khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian 60

3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO 62

3.3 Ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà 63

3.3.1 Sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà 63

3.3.2 Sản phẩm trà xanh 66

3.3.3 Sản phẩm trà đen 67

3.4 Một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO trong sẫm màu rau quả 68

3.4 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 69

3.4.2 Ảnh hưởng của pH 69

3.4 3 Sử dụng hóa chất 70

3.4 4 Sử dụng enzyme 70

3.5 Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 71

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73

Tài liệu tham khảo 75

CHƯƠNG 5 : PHỤ LỤC 82

MỞ ĐẦU

Polyphenol oxidase (PPO) là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong các loài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol thành quinon với sự tham gia của oxi nguyên tử Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về PPO, các kết quả nghiên cứu cho thấy PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau có nhiều tính chất khác nhau PPO có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường

Đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm PPO có hai tác dụng chính: tác dụng

có lợi của PPO là loại hợp chất phenolic trong bia, rượu và nước trái cây, tạo màu

và tăng hương vị cho các sản phẩm cà phê, trà, cacao và đánh giá chất lượng thực phẩm Tác dụng có hại là PPO xúc tác quá trình oxi hóa phenol thành quinon tạo màu nâu trong mô bị tổn thương được xem là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng hóa nâu ở nhiều loại trái cây và rau củ trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến, gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm và giảm khả năng chấp nhận của người tiêu dùng và do đó tác động đáng kể đến nền kinh tế, ảnh hưởng đến nhà sản xuất và ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Ước tính hơn 50% rau quả bị thiệt hại do enzyme gây hiện tượng hóa nâu, trong đó trái cây và rau củ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới dễ xảy ra hiện tượng này

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thực vật” với mục tiêu là khảo sát các đặc tính của PPO trên

cơ sở đó để ứng dụng tính chất có lợi của enzyme trong tạo màu cho thực phẩm và kiềm chế tác hại của enzyme gây hiện tượng sẫm màu ở rau quả

Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm :

- Khảo sát các đặc tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme PPO như nhiệt độ, pH, cơ chất, các chất ức chế enzyme, …

- Khảo sát ứng dụng của enzyme trong việc tạo màu cho sản phẩm thực phẩm

- Khảo sát một số tác nhân kiềm chế tác hại của enzyme như nhiệt độ, pH, hóa chất, enzyme, …

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện luận văn, tôi đã luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ, chỉ bảo từ quý thầy cô, gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp Nhân dịp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến

Cô PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, luôn động viên và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa Trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn

UBND tỉnh Bến Tre, Sở GD&ĐT tỉnh Bến Tre, Quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp Trường THPT Huỳnh Tấn Phát tỉnh Bến Tre đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học vừa qua

Con xin khắc ghi sâu sắc công ơn sinh thành và dưỡng dục của Ba, Mẹ và gia đình đã vất vả nuôi dưỡng cho con có được ngày hôm nay

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị làm ở phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh hóa, các bạn cao học khóa 20 đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012

Nguyễn Hồ Thƣ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử

Quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật do hệ enzyme oxi hóa khử xúc tác Các enzyme này thuộc nhóm chính 1 trong hệ thống phân loại enzyme và có tên gọi chung là oxidoreductase Trong điều kiện sinh học oxi phân tử

có khả năng oxi hóa cơ chất khi được hoạt hóa bởi các enzyme đặc hiệu – các chất hoạt hóa oxi (oxydase) hay các chất hoạt hóa hidro (dehydrogenase) Nhóm enzyme oxi hóa khử rất phổ biến trong tế bào của mọi sinh vật vì phản ứng oxi hóa khử là một trong những quá trình cơ bản nhất của sự sống [10]

1.1.1.Các dehydrogenase [10]

Đa số các phản ứng oxi hóa sinh học là phản ứng tách hidro khỏi cơ chất Enzyme xúc tác quá trình này gọi là dehydrogenase Cơ chế tác dụng của chúng được biểu diễn theo sơ đồ phản ứng :

Dựa vào bản chất của nhóm ngoại, dehydrogenase được chia thành dehydrogenase – piridin, dehydrogenase – flavin, dehydrogenase – ubiquinon

Nhóm ngoại của dehydrogenase – piridin có cấu trúc phức tạp chứa vitamin

PP gọi tắt là NAD (nicotinamit – adenin – dinucleotit) và NADP (nicotinamit – adenin – dinucleotit – photphat) Cấu tạo của NADP chỉ khác NAD là thêm một gốc acid photphoric và có công thức cấu tạo như sau

Sơ đồ phản ứng tổng quát

1.1.1.2 Dehydrogenase - flavin

Nhóm enzyme này còn gọi là men vàng (hay flavon – protein) vì nhóm ngoại

là dẫn xuất của flavin (riboflavin hay vitamin B2) có màu vàng Nhóm ngoại flavin gồm FMN (flavin – mono – nucleotit) và FAD (flavin – adenin – dinucleotit) có công thức cấu tạo như sau

Sơ đồ phản ứng tổng quát

1.1.1.3 Dehydrogenase – ubiquinon (UQ)

Enzyme dehydrogenase – ubiquinon được tìm ra năm 1960 bởi D.E.Green, enzyme có nhóm ngoại là ubiquinon và là enzyme quan trọng xếp thứ tự thứ 3 trong chuỗi hô hấp sau NAD (hay NADP) và FAD (hay FMN) đến UQ, trước khi vào hệ chuyển electron cytocrom trong chuỗi hô hấp

AH2 → NAD → FAD → UQ → hệ cytocrom → O2 → H2O + Q

Nhóm hoạt động có chức năng chuyển và nhận H+

là vòng quinon theo sơ đồ sau

(hay NADP) (hay FMN)

Phương trình tổng quát chuyển hydro của enzyme – ubiquinon

Enzyme trao đổi [H+] với cơ chất AH2 theo sơ đồ sau

1.1.2 Các oxydase [10]

Đây là nhóm enzyme oxi hóa cơ chất, xúc tác phản ứng chuyển hidro (hay electron) trực tiếp từ cơ chất sang oxi phân tử tạo thành H2O hay H2O2

Sơ đồ phản ứng của oxydase như sau

Oxydase là những enzyme phức tạp có cấu tạo gồm 2 cấu tử, có kim loại tham gia trong thành phần cấu tạo (ví dụ: Cu, Fe, )

Nhóm oxydase bao gồm:

* Hệ Cytocrom (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): là các enzyme chuyển electron cho oxi, cytocrom trong chuỗi hô hấp thường là b, c1, c, aa3 xếp lần lượt theo chuỗi hô hấp aa3 đến oxi, hiện nay có trên 20 cytocrom khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên có trong hầu hết các sinh vật

* Peroxidase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): là nhóm enzyme oxi hóa tách oxi từ peroxit (H2O2) hoặc các peroxit hữu cơ khác Cơ chất được oxi hóa nhờ peroxidase ở cơ thể thường là polyphenol hoặc các axit amin mạch vòng

Polyphenol oxidase và polyphenol có trong rau củ và trái cây nên khi rau quả

bị dập, cắt, thái, thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp

bị phá vỡ, các o-quinon được tạo thành do sự oxi hóa các polyphenol có thể trùng hợp với axitamin, amin để hình thành các sản phẩm có màu, đây là nguyên nhân gây hiện tượng thâm đen khi cắt táo, khoai tây, vò lá chè, thuốc lá,

* Ascorbat – oxydase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme oxi hóa vitamin C (acid ascorbic), có chứa trong hầu hết các mô xanh của thực vật

và trong tảo, cơ chế tác dụng có thể biểu diễn theo phản ứng

1.2 Enzyme polyphenol oxidase

1.2.1 Khái niệm

PPO được phát hiện đầu tiên ở nấm bởi Schoenbein năm 1856, là một metalloprotein có chứa nguyên tử đồng và thuộc vào nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic với sự hiện diện của oxi tạo sản phẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương nên PPO được gọi là enzyme hóa nâu [30]

1.2.2 Nguồn thu nhận PPO

PPO được tìm thấy trong phần lớn các mô của thực vật như táo (Harel et al., 1964), nho (Ivanov, 1966), lê (Rivas and Wtaker, 1973), khoai tây (Craft, 1966), trà (Zawistoski et al., 1991), hạt cacao, cà phê… ; trong vi sinh vật bao gồm vi khuẩn

và nấm (Vamas-Vigyazo, 1981) ; trong động vật như côn trùng (Sugumaran, 1988; 1990), động vật chân khớp, động vật có vú và người (Witkop,1985)

Vị trí của PPO trong tế bào thực vật phụ thuộc vào loài, độ tuổi và độ chín của trái cây và rau củ [30] Trong thực vật PPO là enzyme nằm trong thể hạt, tuy nhiên khi trái cây, rau củ bị tổn thương hay lão hóa PPO ở dạng tự do trong tế bào chất Nhiều nghiên cứu cho biết gen mã hóa cho PPO có mức độ biểu hiện cao trong các cơ quan khi còn non và không biểu hiện trong mô trưởng thành PPO có thể tìm thấy trong nhiều dạng thể hạt khác nhau như hạt bột (khoai tây), thể hạt trong biểu bì, thể hạt trong rễ, lục lạp của lá [54]

Ở động vật PPO được tìm thấy trong ti thể của tế bào biểu bì tạo sắc tố, trong tôm hùm PPO được tách chiết từ lớp da nằm giữa cơ và bộ xương ngoài [54]

1.2.3 Phân loại

PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase [41]

1.2.3.1 Tyrosinase và catechol oxidase

a Khái niệm

Tyrosinase (E.C.1.14.18.1, monophenol monooxydase) và catechol oxidase (E.C 1.10.3.1, o-diphenol oxidase) là hai enzyme có cấu trúc tương tự thuộc nhóm

metalloprotein có chứa nguyên tử đồng dạng 3

Tyrosinase xúc tác 2 phản ứng khác nhau : hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol (hoạt tính cresolase hay monophenolase) và sau đó oxi hóa o-diphenol thành o-quinone tương ứng (hoạt tính catecholase hay diphenolase) và đồng thời khử phân tử oxi thành nước Enzyme chỉ xúc tác oxi hóa ο-diphenol thành ο-quinon tương ứng được gọi là catechol oxidase và thông qua hoạt tính xúc tác để phân biệt catechol oxidase với tyrosinase [14, 26, 41]

Hình 1.1 Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [41]

b Cấu trúc phân tử của tyrosinase và catechol oxidase

Tyrosinase và catechol oxidase có cấu trúc đặc trưng gồm 3 domain : một domain đầu N, một domain trung tâm xúc tác chứa một cặp ion đồng (CuA và CuB)

và một domain đầu C nối với domain xúc tác bởi vùng liên kết phi cấu trúc Mỗi ion đồng ở trung tâm xúc tác gắn với ba gốc histidine (His) là nơi tương tác của tyrosinase với cả phân tử oxi và cơ chất phenolic [33] Tyrosinase được mô tả là

enzyme monomeric, trong khi phân tích cấu trúc của tyrosinase từ Bacillus megaterium phát hiện cấu trúc dimeric [33]

Những phân tích về trình tự và cấu trúc của protein đồng dạng 3 cho phép nhận ra các đặc trưng về cấu trúc và sự hoạt động của tyrosinase Cầu nối thioether

được tìm thấy trong vùng gần vị trí gắn với cofactor, liên kết này được tìm thấy giữa gốc cystein và gốc histidine thứ 2 ở vị trí CuA của tyrosinase Đặc trưng về trình tự của protein đồng dạng 3 của tyrosinase là sự hiện diện của hai nhóm của ba histidin trong vùng motif bảo tồn, những gốc này liên quan đến sự gắn hai cofactor của ion đồng tại vị trí CuA và CuB Những nghiên cứu gần đây tại trung tâm xúc tác của protein đồng dạng 3 nhận ra các gốc có liên quan trong việc xác định cơ chất đặc hiệu khác nhau của tyrosinase [33]

Hình 1.2 Cấu trúc của tyrosinase [23]

c Cơ chế xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [39]

Cơ chế xúc tác của tyrosinase và catecholase rất phức tạp, cơ chế này có thể liên quan đến cơ chế dị lập thể (allosteric) gồm 2 vị trí gắn riêng biệt của oxi và cơ chất (Duckworth 1970 và Jolley 1974) Tuy nhiên Wilcox và cộng sự (1985) đề nghị cơ chế xúc tác toàn diện với một vị trí gắn cho cả oxi và cơ chất Trạng thái oxi hóa của Cu trong tyrosinase không hoạt động là dẫn xuất Met có chứa nguyên tử đồng Cu(II) ở trung tâm Khi bắt đầu chu trình xúc tác, tác nhân khử phản ứng với

2 nguyên tử đồng (II) của met-tyrosinase và khử chúng thành deoxy-tyrosinase theo

sơ đồ phản ứng sau

E met + H+ → E deoxy + H2O

Khi o-diphenol hiện diện trong hệ thống phản ứng, sự oxi hóa xảy ra tạo ra

o-quinone tương ứng Nhưng nếu monophenol được sử dụng là cơ chất, hoạt động

của enzyme xuất hiện khi có tác nhân khử Phân tử oxi kết hợp với deoxy-tyrosinase và oxi hóa nó thành oxy-tyrosinase

E deoxy + O2 → E oxy Bước tiếp theo của quá trình oxi hóa khử là sự cạnh tranh của monophenol

và o-diphenol Khi cơ chất monophenol trội hơn trong hỗn hợp phản ứng, oxy-tyrosinase kết hợp với monophenol và oxi hóa nó thành o-diphenol Sản phẩm

o-diphenol trong chu trình này thì tiếp tục bị oxi hóa thành o-quinone

E oxy + monophenol → E oxy – M + H+Eoxy – M → E met – D

E met – D + H+ → E deoxy + o-quinone + H2O Chu trình này của phản ứng được gọi là chu trình monophenolase (hay cresolase) Trong thực tế trạng thái nghỉ của tyrosinase chứa 10 – 15%

oxy-tyrosinase và cơ chất monophenolic có thể phản ứng với thành phần oxi này

Nhưng phản ứng xảy ra rất chậm và thời kì lag tương đối dài trước khi đạt được giai

đoạn ổn định của phản ứng khi phức hợp monophenol được sử dụng như là cơ chất

Khi phức hợp o-diphenolic trội hơn trong hỗn hợp phản ứng, oxy-tyrosinase

kết hợp với o-diphenol và oxi hóa thành o-quinone Dạng oxi của enzyme biến đổi

đồng thời thành dạng met

E oxy + o-diphenol → Eoxy – D + 2H+Eoxy – D + 3H+ → Emet + o-quinone + H2O Met-tyrosinase bị khử thành dạng deoxy và o-diphenol khác được sử dụng

như là chất khử tại thời điểm này và được phóng thích như là o-quinone thứ hai

Deoxy-tyrosinase bị oxi hóa thành dạng oxy với phân tử oxi

E met + o-diphenol → E met –D

E met –D + H+

→ E deoxy + o-quinone + H2O Chu trình này được coi như chu trình diphenolase (hay catecholase) [39]

Hình 1.3 Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và

oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase (M=monophenol và D=diphenol) (Solomon et al 1996) [39]

1.2.3.2 Laccase

a Khái niệm

Laccase (E.C 1.10.3.2, oxygen oxidoreductase) thuộc nhóm enzyme oxidase

có phổ cơ chất rất đa dạng, xúc tác loại bỏ hydro từ nhóm hydroxyl của monophenol, diphenol, polyphenol, dẫn xuất phenol, hợp chất phi phenol,…, để hình thành các gốc tự do [26, 41]

Hình 1.4 Phản ứng xúc tác của laccase [41]

b Cấu trúc phân tử và trung tâm hoạt động của laccase

Phân tử laccase là một glycoprotein (dimeric hay tetradimeric), mỗi monomer chứa khoảng 550 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 50 – 100 kDa Lacase có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác, các nguyên tử đồng được chia làm ba nhóm thành ba vùng oxi hóa khử là vùng nguyên tử đồng T1, T2, T3 Vùng nguyên tử đồng T1 liên kết với đoạn peptid gồm hai gốc histidine và một gốc cystein hấp thụ mạnh bước sóng 610nm nên có màu xanh Vùng nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin và không có màu xanh Vùng nguyên tử đồng T3 gồm hai nguyên tử đồng nối với nhau bằng cầu nối hydroxyl nằm gần nhau hấp thụ tia cực tím yếu ở bước sóng 330nm [24]

Vùng nguyên tử đồng T1 tham gia chủ yếu trong việc nhận điện tử và truyền đến các vị trí khác Vùng nguyên tử đồng T2, T3 hình thành trung tâm gồm 3 nguyên

tử đồng làm nhiệm vụ kích hoạt liên kết và chuyển điện tử tới O2 tạo thành nước [24]

Hình 1.5 Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của Laccase

(theo Claus và cộng sự, 2004)

c Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxi hóa khử sử dụng oxi làm chất nhận điện tử Sự phù hợp giữa cơ chất và laccase được quyết định bởi hai nhân tố chính là sự phù hợp giữa cơ chất với vùng nguyên tử đồng T1 và sự chênh lệch thế oxi hóa khử giữa cơ chất và enzyme [24]

Enzyme laccase oxi hóa cơ chất bằng cách loại electron và tạo ra các gốc tự

do có khả năng trùng hợp Enzyme giữ electron của các phản ứng oxi hóa riêng lẻ

và trạng thái khử hoàn toàn chứa tổng cộng bốn electron, enzyme này vận chuyển electron đến phân tử oxi tạo thành nước Trung tâm đồng T1 là nơi diễn ra phản ứng khử cơ chất Cơ chất chuyển electron cho nguyên tử đồng T1 biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) thành dạng (Cu+) Sau đó điện tử được truyền đến nguyên tử đồng T2 và

T3 hình thành phân tử laccase có 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+

) Như vậy một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ cơ chất đến nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu nối tripeptit His-Cys-His Phân tử oxi sau đó oxi hóa laccase dạng khử tạo thành hợp chất trung gian peroxy và cuối cùng bị khử thành nước [1,40]

Hình 1.6 Cơ chế xúc tác của laccase [40]

Ngoài ra, các phân tử cơ chất có cấu tạo lớn không thể tiếp cận trực tiếp được trung tâm hoạt động của laccase nên cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator) Mediator là hợp chất có trọng lượng phân tử thấp nhưng có thế oxi hóa khử cao (>900mV) có thể oxi hóa phần phi phenolic của lignin hay các hợp chất khác Mediator có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxi hóa thành dạng khử và đi đến cơ chất Sau đó mediator ở dạng bị oxi hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở lại dạng ban đầu để tiếp tục tham gia chu trình xúc tác Laccase sau khi nhận điện tử từ mediator thì điện tử được chuyển tới oxi tạo thành nước và tham gia chu trình tiếp theo Sự tham gia của mediator làm tăng phổ cơ chất và tính không đặc hiệu của enzyme Trong các mediator thì ABTS là mediator nhân tạo đầu tiên được sử dụng trong hệ thống LMS để phân hủy lignin trong bột giấy [12]

Hình 1.7 (a) Chu trình xúc tác của laccase

(b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator [12]

1.2.4 Tính chất của PPO

PPO có trọng lượng phân tử khác nhau phụ thuộc vào nguồn enzyme, phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme [48] Trọng lượng phân tử chung của PPO từ thực vật được chấp nhận khoảng 144,000 Da ; của nấm lớn khoảng 128,000 Da Trong khi đó một số loại nấm khác có trọng lượng phân tử vào khoảng 46,000 – 88,000 Da Ở động vật có vú rất ít tương đồng về trọng lượng phân tử của PPO [29]

pH tối ưu cho hoạt động của PPO tùy thuộc vào nguồn của enzyme có giá trị thay đổi từ 4 – 8 Nhiều thông số ảnh hưởng đến giá trị pH tối ưu bao gồm : dung dịch đệm, độ tinh sạch enzyme, các giai đoạn phát triển và nguồn gốc của trái cây

và rau củ Nghiên cứu pH tối ưu cho hoạt động của PPO có thể cung cấp những thông tin cho việc nhận biết sự hoạt hóa và các gốc ion quan trọng cho sự ngưng kết

cơ chất và biến dưỡng (Kuby, 1991) Sự thay đổi pH trong dung dịch phản ứng gây bất hoạt PPO do sự thay đổi trong trạng thái ion của chuỗi amino acid liên quan trong phản ứng xúc tác, sự thay đổi trạng thái ion của cơ chất, sự thay đổi trạng thái cân bằng của phản ứng liên quan đến H+

hay OH- [54]

PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau được nghiên cứu về pH tối ưu, nhiệt

độ tối ưu, trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện và đặc tính động học của enzyme [26] Một vài tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1 1 Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau

Trọng lƣợng phân tử (kDa)

Quả anh đào

(Prunus cerasus

L.CV.CAB)

Quả mơ (Prunus

6,6 (catechol) 12,5 (L-dopa)

20 (gallic acid)

833

500 1,5

- - Oktay Arslan, et al

Quả dâu tằm

(Morus alba L.)

5,0 (4-methyl catechol) 7,0 (catechol) 7,5 (pyrogallol)

20 (4-methyl catechol và pyrogallol)

45 (catechol)

et al (2010) [31]

Cây bạc hà

(Mentha arvensis)

4,5 (caffeic acid) 5,0 (4-methyl catechol 6,5 (catechol)

30 (caffeic acid và catechol)

15 methyl catechol)

(4-7,41 (catechol) 0,825 (caffeic acid) 0,928 (4-methyl catechol)

- - 72 Halder, et al (1998) [38]

Hibiscus

19,23 (catechol) 21,98 (4 methyl-catechol)

5,09 (vỏ) 4,03 (thịt) (catechol)

41 Zhang et al (1999)

Azospirillum

48,9 ; 97,8 và 179,3

Diamantidis, et al (2000) [41]

Streptomyces

Lerch và Ettinger (1972) [41]

1.2.5 Một số công trình nghiên cứu về PPO

PPO là enzyme có nhiều trong thực vật, trong vi sinh vật và động vật nên có

nhiều công trình nghiên cứu về PPO đã được công bố

Trên thế giới PPO được thu nhận, tinh chế và khảo sát đặc tính từ lá trà xanh

(Camellia sinensis) bởi nhiều tác giả như Halder, Tamuli và Bhaduri (1998) ;

Unal, Yabaci và Sener (2011)

Ngoài ra PPO còn được thu nhận và khảo sát từ nhiều loài thực vật khác như chuối (Galeazzi và cộng sự, 1981), vỏ quả xoài (Prabha và Patwardhan, 1982), quả bơ (Kahn, 1983 và Lelyveld, 1984), quả khế (Adnan và cộng sự, 1986), táo Amasya (Oktay và cộng sự, 1995), lá đậu xanh (Shin và cộng sự, 1996), khoai môn (Yemenicioglu và cộng sự, 1997), cây thuốc lá (Richardson và

McDougall, 1997), quả mơ Malatya (Arslan và cộng sự, 1998), củ khoai tây

(Partington, 1996 và 1999), quả vải (Jiang và cộng sự, 1999), cà phê (Mazzafera và Robinson, 2000), mủ cao su (Wititsuwannakula và cộng sự, 2002), lá dâu tằm

(Sutay, 2003), quả mảng cầu xiêm (Bora và cộng sự, 2004), cây bạc hà Metha arvensis (Neves và cộng sự, 2009), quả anh đào (Jia và cộng sự, 2011), hoa dâm bụt

1.2.6 Chức năng sinh học của PPO

PPO phân bố rộng rãi trong tự nhiên được tìm thấy trong hầu hết các loài sinh vật gồm động vật, thực vật, nấm và vi khuẩn PPO thể hiện nhiều chức năng quan trọng trong cơ thể sinh vật

Ở động vật, tyrosinase có vai trò trong tạo sắc tố của da, tóc, mắt bởi sự tổng hợp melanin Ở người PPO hoạt động quá nhiều hay quá ít là nguyên nhân của các bệnh quan trọng như bệnh bạch tạng, bệnh đốm lang trắng hay khối u ác tính [41]

Ở côn trùng sự hóa cứng của biểu bì là quá trình quan trọng trong mỗi giai đoạn phát triển để làm cứng và ổn định bộ xương ngoài Một lượng lớn protein và chitin tham gia vào thành phần cấu tạo của lớp biểu bì và sự tương tác hóa học của chúng với các hợp chất quinone tạo tính bền và đàn hồi cho bộ xương khi trưởng thành Hoạt động laccase xúc tác cho sự oxi hóa các hợp chất catechol với các protein màng đóng vai trò quan trọng trong hình thành bộ xương ngoài [ 41]

Ở thực vật, hoạt động của tyrosinase có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở thực vật bao gồm hệ thống chữa lành vết thương Khi thực vật bị tổn thương, enzyme oxi hóa hợp chất phenolic hình thành cấu trúc polymer bảo vệ thực vật chống lại côn trùng và vi sinh vật là nguyên nhân tạo màu nâu của trái cây và rau củ làm giảm chất lượng của thực phẩm Ngoài tyrosinase, laccase có vai trò quan trọng ở thực vật, chúng tham gia vào quá trình hóa gỗ của vách tế bào thực vật nhờ liên kết các monomer phenolic làm tăng độ cứng của thân và các bộ phận khác của thực vật.[41]

Ở nấm, PPO mà đặc biệt là laccase có vai trò quan trọng trong sự phân giải lignin, hình thành bào tử và sắc tố nấm, phân giải chất độc, ….[41]

Ở vi khuẩn, PPO có vai trò quan trọng trong hình thành melanin Melanin, một sắc tố polyphenolic, có tác dụng bảo vệ bào tử và tế bào vi khuẩn chống lại sự oxi hóa, các gốc tự do và tia UV [41]

1.2.7 Ứng dụng của PPO

PPO có khả năng oxi hóa các hợp chất thơm nên enzyme này được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường [41]

1.2.7.1 Trong công nghiệp thực phẩm

PPO có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như hình thành màu khi nướng bánh, tăng hương vị và màu sắc cho trà, ca cao, cà phê, ổn định bia, rượu, nước trái cây, ….[29]

- Trong công nghiệp chế biến trà, PPO có vai trò quan trọng làm tăng hương

vị, màu sắc của trà Trong quá trình chế biến polyphenol bị oxi hóa bởi hoạt động của PPO có sẵn trong lá trà và sản phẩm oxi hóa tạo nên màu sắc, độ đậm và hương

vị cho sản phẩm trà đen Do đó hoạt động của PPO trong lá trà và sản phẩm oxi hóa của nó có vai trò quan trọng trong quá trình chế biến trà đen.[29]

Trong quá trình chế biến trà đen giai đoạn làm héo trà tanin bị giảm đi

1 - 2%, các chất có màu được tạo thành, hương thơm được hình thành (do catechin

bị oxi hóa rồi kết hợp với polyphenol hoặc alanin, hoặc asparagic), protein biến đổi sâu sắc để tạo thành các acid amin hòa tan Một số chất khác như vitamin C, diệp lục, tinh bột giảm đi, cafein có tăng lên một ít Giai đoạn quan trọng nhất trong chế biến trà đen là giai đoạn lên men, các quá trình xảy ra ở giai đoạn này là quá trình

lên men, quá trình tự oxi hóa do hoạt động của hệ enzyme oxi hóa khử trong lá trà, quá trình có tác dụng của vi sinh vật (quá trình này rất thứ yếu) và quá trình tác

dụng của nhiệt (có tác dụng rút ngắn thời gian lên men) góp phần hình thành màu trong sản phẩm trà đen [9]

- Ổn định rượu vang là một trong những ứng dụng chính của laccase trong công nghiệp thực phẩm thay thế cho chất hấp phụ lý hóa Nước ép nho và rượu vang là một hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hóa học khác nhau như ethanol, acid hữu cơ, muối và hợp chất phenolic Loại bỏ polyphenol chọn lọc để tránh sự thay đổi không mong muốn trong các đặc tính cảm quan của rượu vang Laccase thể hiện nhiều ưu điểm khi sử dụng để loại bỏ polyphenol trong rượu như ổn định trong môi trường acid và ức chế thuận nghịch với sulphite Ngoài ra, laccase còn được sử dụng để cải tiến thời gian bảo quản của bia, quá trình bảo quản bia phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như sự hình thành vẩn đục, lượng oxi và nhiệt độ Trong bia luôn tồn tại một lượng nhỏ anthocyanidin, polyphenol, chúng sẽ làm cho protein bị

kết tủa và hình thành vẩn đục trong quá trình đóng gói và bảo quản Việc sử dụng laccase cho quá trình oxi hóa polyphenol là phương pháp thay thế phương pháp truyền thống ngăn cản sự hình thành vẩn đục trong chế biến và bảo quản bia [12,53]

- Ngoài ra PPO còn được sử dụng trong bảo quản thực phẩm để loại bỏ oxi hòa tan ngăn chặn quá trình oxi hóa làm hư sản phẩm, kiểm soát mùi hôi và loại bỏ một số thành phần không mong muốn trong thực phẩm Laccase còn được thêm vào bột trong quá trình làm bánh để oxi hóa một số thành phần trong bột và tăng cấu trúc gluten trong bột tạo độ mềm, giảm độ dính và tăng độ đàn hồi của bột Laccase được sử dụng hình thành mối liên kết của acid feruic và pectin trong củ cải đường qua quá trình oxi hóa hình thành dạng gel trong thực phẩm [12,53]

1.2.7.2 Trong các ngành công nghiệp khác

- Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, giai đoạn chuẩn bị cần loại bỏ lignin từ mô gỗ và tẩy trắng bột giấy Thông thường bột giấy được tẩy trắng bằng tác nhân chlorine hoặc oxi hóa dựa trên sự oxi hóa hóa học tuy nhiên những tác nhân này thường gây ô nhiễm độc hại cho môi trường Ứng dụng laccase trong xử

lý lignin và tẩy trắng sinh học đã đem lại một chiến lược sản xuất sạch, an toàn hơn

và không làm thay đổi tính chất của cellulose [11,41,53] Laccase có thể phân hủy lignin trong bột giấy khi được sử dụng cùng với các mediator (một phức hợp nhỏ trọng lượng phân tử thấp với điện thế khử cao) Mediator bị oxi hóa bởi laccase và phân tử mediator bị oxi hóa sẽ tiếp tục oxi hóa tiểu đơn vị của lignin (lignin không phải là cơ chất của laccase nhưng nhờ các mediator nó trở thành cơ chất gián tiếp của laccase) Ngoài ra laccase còn được sử dụng để loại mực và tẩy trắng giấy in, sử dụng để liên kết các cấu tử gỗ trong sản xuất tấm sợi ép, ván ép,….[12]

- Trong công nghiệp dệt may laccase được sử dụng để cải tiến độ trắng trong tẩy trắng bông, vải với ưu điểm là tiết kiệm hóa chất, năng lượng và nước Laccase

có thể sử dụng để chuyển đổi tiền chất của thuốc nhuộm để nhuộm vải tốt hơn và hiệu quả hơn Laccase có thể sử dụng để tẩy mùi hôi trên vải, bề mặt sofa, màn hoặc

sử dụng là chất tẩy để khử mùi tạo ra trong giặt vải [12]

- Gần đây, laccase còn được ứng dụng như là chất xúc tác sinh học mới trong tổng hợp chất hữu cơ Laccase xúc tác phản ứng liên kết của các chất tương tự urushiol để tạo “urushi nhân tạo” (một loại sơn truyền thống của Nhật Bản) Trong một số nghiên cứu laccacse có khả năng trùng hợp các hợp chất amino, phenolic và các gốc tự do của acrylamide khi có hoặc không có mediator Ngoài ra laccase còn được sử dụng để tổng hợp các chất hữu cơ có chức năng như các polyme phục vụ cho cơ khí, điện, quang học, thuốc nhuộm, màu mỹ phẩm, thuốc trừ sâu.[12]

1.2.7.3 Trong công nghệ môi trường

Sự hiện diện các hợp chất phenolic và dẫn xuất của chúng có tính chất độc hại trong nước thải công nghiệp từ công nghệ chuyển hóa than, lọc dầu, bảo quản

gỗ, công nghiệp dệt, giấy, thực phẩm, hóa chất là vấn đề rất lớn hiện nay Quy định của pháp luật rất nghiêm ngặt ở những nước phát triển về việc loại bỏ các chất độc hại khỏi nước thải trước khi chúng được thải ra môi trường Sự quan tâm gần đây tập trung vào sử dụng peroxidase và PPO trong việc loại bỏ hợp chất phenolic từ nước thải công nghiệp Laccase cố định có khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm phenol và chlorophenol [11, 41]

1.2.7.4 Trong y học và mỹ phẩm

- Trong y học, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy PPO có khả năng ức

chế sự bám dính của Streptococcus sobrinu, vi khuẩn gây hư hỏng răng PPO được

sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson do PPO xúc tác phản ứng chuyển đổi L-tyrosine thành L-DOPA cung cấp đủ lượng dopamine cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson PPO được sử dụng trong ứng dụng lâm sàng như là dấu hiệu của bệnh đốm bạch tạng, bệnh tự miễn dịch, ức chế khối u [41]

Laccase được sử dụng để tổng hợp các hợp chất phức tạp trong y tế như thuốc gây mê, kháng viêm, thuốc an thần, kháng sinh…Ngoài ra, hệ thống laccase mediator sử dụng để xác định kháng thể đơn dòng của azelic acid từ oleic acid, Laccase có khả năng ức chế hoạt động phiên mã ngược của HIV-1 Một laccase được chứng minh là có khả năng chống lại chứng aceruloplasminemia (một rối loạn

do sắt tích tụ dần trong não hay cơ quan khác do thiếu ceruloplasmin – một

ferroxidase hoạt động điều hòa nội cân bằng sắt) Một phương pháp enzyme mới sử dụng laccase để phát hiện đồng thời cocain và morphine trong các mẫu thuốc.[12]

- Lĩnh vực ứng dụng mới của laccase là trong mỹ phẩm Thuốc nhuộm tóc chứa laccase ít gây kích thích và dễ sử dụng hơn thuốc nhuộm tóc hiện tại Gần đây các chế phẩm mỹ phẩm và sản phẩm chăm sóc da có chứa protein laccase làm cho

da sáng cũng được phát triển Laccase được sử dụng trong sản phẩm vệ sinh cá nhân gồm kem đáng răng, nước súc miệng, chất tẩy rửa, xà phòng, khăn vệ sinh,….[12]

1.2.7.5 Trong công nghệ sinh học nano

Khoa học Nano phát triển rất nhanh trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào ứng dụng công nghệ nano bởi vì công nghệ nano ảnh hưởng đến tất cả các lĩnh vực của hoạt động con người (môi trường, kinh tế, công nghiệp, điều trị bệnh, …) Vật liệu nano được sử dụng rộng rãi như vật liệu mang trong cảm biến sinh học (biosensor) và pin sinh học (biofuel cell) [12]

Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng đầu dò sinh học – thành phần kết hợp với một bộ chuyển đổi điện tử, do đó chuyển đổi một tín hiệu sinh hóa thành tín hiệu điện có thể nhận biết, truyền tải và ghi nhận thông tin liên quan đến những thay đổi sinh lí hoặc sinh hóa Một cảm biến sinh học chứa laccase được phát triển trong phương pháp miễn dịch, xác định glucose, amine thơm, hợp chất phenolic.[12]

Ngoài ra laccase có thể được giữ cố định trên cực âm của pin sinh học, là một enzyme oxi hóa laccase có khả năng chuyển bốn điện tử đến oxi tạo nước thông qua quá trình oxi hóa các hợp chất phenolic và chất thơm, có tiềm năng ứng dụng trong các tế bào nhiên liệu sinh học để sản xuất điện thông qua phản ứng hóa học [12]

1.2.8 Sự ức chế PPO

Sự hóa nâu do tác động của PPO làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng thực phẩm, làm giảm giá trị kinh tế của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trái cây tươi như táo, lê, chuối, nho, táo tây và rau củ như rau diếp, nấm rơm, khoai tây,…, và hải sản như tôm, cua Sự hóa nâu làm giảm giá trị cảm quan do đó làm giảm giá trị

thương mại và sự chấp nhận của người tiêu dùng (do sự thay đổi màu sắc, mùi vị,

độ mềm và giá trị dinh dưỡng) đối với trái cây và rau củ bị hóa nâu [30]

Ức chế PPO gây hiện tượng hóa nâu trong phần lớn các sản phẩm thực phẩm tươi là mục tiêu của nhiều ngành công nghiệp thực phẩm Có nhiều phương pháp để

ức chế enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp lựa chọn [54]

1.2.8.1 Phương pháp vật lý

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Nhiệt độ lạnh (0 – dưới 10oC) làm giảm hoạt động của enzyme hóa nâu, tuy nhiên sự thay đổi màu vẫn xảy ra ở nhiệt độ lạnh và sản phẩm dễ bị hỏng do sự tạo thành các tinh thể đá Trong điều kiện lạnh hoạt động enzyme hóa nâu bị ức chế hoàn toàn khi lưu giữ ở nhiệt độ khoảng - 18 o

C [30]

- Xử lý ở nhiệt độ cao là phương pháp thường sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để ngăn cản sự hư hỏng của thực phẩm với mục tiêu làm giảm hoạt tính của enzyme bởi sự bất hoạt không thuận nghịch enzyme và giảm sự nhiễm khuẩn

Xử lý nhiệt độ cao là phương pháp dễ sử dụng để ức chế enzyme hóa nâu trong rau quả, trái cây, tôm, tôm hùm, ….Tuy nhiên, thời gian và nhiệt độ xử lý phải phù hợp với tính chất của sản phẩm Những bất lợi của xử lý nhiệt là hình thành mùi và màu không mong muốn do phản ứng Maillard.[54]

- Phương pháp xử lý nhiệt kết hợp với sóng siêu âm cũng được sử dụng để

ức chế PPO Ưu điểm của phương pháp này là giảm nhiệt độ xử lý, thường được ứng dụng để xử lý các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt [54]

* Sử dụng carbon dioxide siêu tới hạn

Carbon dioxide siêu tới hạn được ứng dụng để bất hoạt PPO trong vỏ khoai tây, tôm, tôm hùm,….Xử lý enzyme với CO2 áp suất cao (58 atm) trong 30 phút làm giảm 91% hoạt tính của PPO [30]