Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thự

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** NGUYỄN HỒ THƯ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH, ỨNG DỤNG VÀ BIỆN PHÁP KIỀM CHẾ TÁC HẠI CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TỪ THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6 sulphobic acid) CPE : Chế phẩm enzyme HđC : Hoạt độ chung HđR : Hoạt độ riêng Hđmax : Hoạt độ cao nhất KC : Kiểm chứng LMS : Laccase mediator system NL : Nguyên liệu OD : Giá trị mật độ quang ∆OD : Hiệu số giá trị mật độ quang PPO : Polyphenol oxidase Pr-E : Protein-enzyme SGZ : Syringaldazine TB : Trung bình TN : Thí nghiệm UI : Đơn vị hoạt độ E ΣUI : Tổng đơn vị hoạt độ E V ddE : Thể tích dung dịch enzyme V Ethanol : Thể tích ethanol vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau 18 Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi 36 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO 41 Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford 42 Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50 Bảng 3.2. Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu 50 Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu 51 Bảng 3.4. Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu 51 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO 54 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 57 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO 59 Bảng 3.11 . Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian 61 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO 62 Bảng 3.13. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN) 64 Bảng 3.14. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN) 65 Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả 69 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả 69 Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả 70 Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả 71 viii Bảng 3.19. Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 71 Bảng 5.1. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin 83 Bảng 5.2. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu 84 Bảng 5.3. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO từ nguyên liệu 84 Bảng 5.4. Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO 85 Bảng 5.5. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 86 Bảng 5.6. Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 87 Bảng 5.7. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 88 Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 89 Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO 92 Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của PPO theo thời gian 93 Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt độ của PPO 94 Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt độ của PPO 95 Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến hoạt độ của PPO 96 Bảng 5.14. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) 97 Bảng 5.15. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) 97 ix Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 98 Bảng 5.17. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong CPE – PPO thô 98 Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của benzoquinon ở bước sóng 420nm 98 Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin 100 Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu 100 Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin 101 Bảng 5.22. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của enzyme bromelin và ficin 102 Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và enzyme ficin 102 x DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH MINH HỌA Trang BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của PPO 62 ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 54 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO 55 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 58 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO 60 Đồ thị 3.7. Động học phản ứng PPO theo thời gian 61 Đồ thị 3.8. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) 64 Đồ thị 3.9. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) 66 Đồ thị 5.1. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin 84 Đồ thị 5.2. Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon 99 Đồ thị 5.3. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin 101 xi HÌNH MINH HỌA Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase 9 Hình 1.2. Cấu trúc của tyrosinase 10 Hình 1.3. Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase 12 Hình 1.4. Phản ứng xúc tác của laccase 13 Hình 1.5. Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của laccase 14 Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của laccase 15 Hình 1.7. (a) Chu trình xúc tác của laccase (b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator 16 Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên 33 Hình 1.9. Cây trà 35 Hình 3.1. Sản phẩm trà xanh 67 Hình 3.2. Sản phẩm trà đen 67 Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh 68 Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol 103 Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây 103 Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây 104 Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây 104 Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây 105 Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây 105 Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây 106 Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây 106 Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây 107 Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà 107 ii MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ, đồ thị và hình minh họa Trang Mở đầu 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử 3 1.1.1. Các dehydrogenase 3 1.1.1.1. Dehydrogenase – piridin 3 1.1.1.2. Dehydrogenase – flavin 4 1.1.1.3. Dehydrogenase – ubiquinon (UQ) 5 1.1.2. Các oxydase 6 1.2. Enzyme polyphenol oxidase 8 1.2.1. Khái niệm 8 1.2.2. Nguồn thu nhận PPO 8 1.2.3. Phân loại 8 1.2.3.1. Tyrosinase và catechol oxidase 9 1.2.3.2. Laccase 12 1.2.4. Tính chất của PPO 17 1.2.5. Một số công trình nghiên cứu về PPO 22 1.2.6. Chức năng sinh học của PPO 22 1.2.7. Ứng dụng của PPO 23 1.2.7.1. Trong công nghiệp thực phẩm 24 1.2.7.2. Trong các ngành công nghiệp khác 25 1.2.7.3. Trong công nghệ môi trường 26 1.2.7.4. Trong y học và mỹ phẩm 26 iii 1.2.7.5. Trong công nghệ sinh học nano 27 1.2.8. Sự ức chế PPO 27 1.2.8.1. Phương pháp vật lý 28 1.2.8.2. Phương pháp hóa học 29 1.2.8.3. Phương pháp enzyme 32 1.2.8.4. Phương pháp gen 32 1.2.9. Cơ chất của PPO: Phenol 33 1.3. Cây trà và các sản phẩm từ trà 34 1.3.1. Giới thiệu chung về cây trà 34 1.3.2. Các sản phẩm từ trà 36 CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 39 2.1. Vật liệu 39 2.1.1. Nguyên liệu 39 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 39 2.1.3. Hóa chất 39 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm của lá trà 39 2.2.2. Phương pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu 40 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ của PPO 40 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích 41 2.2.5. Xác định hoạt độ riêng của PPO 42 2.2.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của PPO 43 2.2.6.1. Phương pháp xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO 43 2.2.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 43 2.2.6.3. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 43 iv 2.2.6.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 44 2.2.6.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian 44 2.2.6.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO 45 2.2.6.7. Phương pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian 45 2.2.6.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO 45 2.2.7. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà 46 2.2.7.1. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà 46 2.2.7.2. Phương pháp chế biến trà đen 46 2.2.7.3. Phương pháp chế biến trà xanh 47 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây 48 2.2.9. Phương pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 49 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50 3.1. Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu 50 3.1.1. Xác định độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50 3.1.2. Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu 50 3.1.3. Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu 51 3.1.4. Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu 51 3.2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của PPO trong lá trà nguyên liệu 52 3.2.1. Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của PPO 52 [...]... này Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thực vật” với mục tiêu là khảo sát các đặc tính của PPO trên cơ sở đó để ứng dụng tính chất có lợi của enzyme trong tạo màu cho thực phẩm và kiềm chế tác hại của enzyme gây hiện tượng sẫm màu ở rau quả 1 Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm... Khảo sát các đặc tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme PPO như nhiệt độ, pH, cơ chất, các chất ức chế enzyme, … - Khảo sát ứng dụng của enzyme trong việc tạo màu cho sản phẩm thực phẩm - Khảo sát một số tác nhân kiềm chế tác hại của enzyme như nhiệt độ, pH, hóa chất, enzyme, … 2 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện luận văn, tôi đã luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ, chỉ bảo từ quý... cofactor của ion đồng tại vị trí CuA và CuB Những nghiên cứu gần đây tại trung tâm xúc tác của protein đồng dạng 3 nhận ra các gốc có liên quan trong việc xác định cơ chất đặc hiệu khác nhau của tyrosinase [33] Hình 1.2 Cấu trúc của tyrosinase [23] c Cơ chế xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [39] Cơ chế xúc tác của tyrosinase và catecholase rất phức tạp, cơ chế này có thể liên quan đến cơ chế dị... tố polyphenolic, có tác dụng bảo vệ bào tử và tế bào vi khuẩn chống lại sự oxi hóa, các gốc tự do và tia UV [41] 1.2.7 Ứng dụng của PPO PPO có khả năng oxi hóa các hợp chất thơm nên enzyme này được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường [41] 23 1.2.7.1 Trong công nghiệp thực phẩm PPO có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực... thời khử phân tử oxi thành nước Enzyme chỉ xúc tác oxi hóa ο-diphenol thành ο-quinon tương ứng được gọi là catechol oxidase và thông qua hoạt tính xúc tác để phân biệt catechol oxidase với tyrosinase [14, 26, 41] Hình 1.1 Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [41] b Cấu trúc phân tử của tyrosinase và catechol oxidase Tyrosinase và catechol oxidase có cấu trúc đặc trưng gồm 3 domain : một... là polyphenol hoặc các axit amin mạch vòng AH2 + H2O2 → A + 2H2O * Catalase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): Xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 tạo O2 theo phản ứng * Polyphenol oxidase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon Enzyme này khá phổ biến trong thực vật và vi khuẩn Polyphenol oxidase không có tính đặc hiệu cơ chất cao Polyphenol. .. enzyme oxi hóa vitamin C (acid ascorbic), có chứa trong hầu hết các mô xanh của thực vật và trong tảo, cơ chế tác dụng có thể biểu diễn theo phản ứng 7 1.2 Enzyme polyphenol oxidase 1.2.1 Khái niệm PPO được phát hiện đầu tiên ở nấm bởi Schoenbein năm 1856, là một metalloprotein có chứa nguyên tử đồng và thuộc vào nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic với sự hiện diện của. .. tạo màu nâu của trái cây và rau củ làm giảm chất lượng của thực phẩm Ngoài tyrosinase, laccase có vai trò quan trọng ở thực vật, chúng tham gia vào quá trình hóa gỗ của vách tế bào thực vật nhờ liên kết các monomer phenolic làm tăng độ cứng của thân và các bộ phận khác của thực vật.[41] Ở nấm, PPO mà đặc biệt là laccase có vai trò quan trọng trong sự phân giải lignin, hình thành bào tử và sắc tố nấm,... nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường Đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm PPO có hai tác dụng chính: tác dụng có lợi của PPO là loại hợp chất phenolic trong bia, rượu và nước trái cây, tạo màu và tăng hương vị cho các sản phẩm cà phê, trà, cacao và đánh giá chất lượng thực phẩm Tác dụng có hại là PPO xúc tác quá trình oxi hóa phenol thành quinon tạo màu nâu trong... được sử dụng trong hệ thống LMS để phân hủy lignin trong bột giấy [12] Hình 1.7 (a) Chu trình xúc tác của laccase (b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator [12] 16 1.2.4 Tính chất của PPO PPO có trọng lượng phân tử khác nhau phụ thuộc vào nguồn enzyme, phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme [48] Trọng lượng phân tử chung của PPO từ thực vật được chấp nhận khoảng 144,000 Da ; của nấm lớn . nghệ sinh học nano 27 1 .2. 8. Sự ức chế PPO 27 1 .2. 8.1. Phương pháp vật lý 28 1 .2. 8 .2. Phương pháp hóa học 29 1 .2. 8.3. Phương pháp enzyme 32 1 .2. 8.4. Phương pháp gen 32 1 .2. 9. Cơ chất của. 8 1 .2. 3.1. Tyrosinase và catechol oxidase 9 1 .2. 3 .2. Laccase 12 1 .2. 4. Tính chất của PPO 17 1 .2. 5. Một số công trình nghiên cứu về PPO 22 1 .2. 6. Chức năng sinh học của PPO 22 1 .2. 7. Ứng. của PPO 23 1 .2. 7.1. Trong công nghiệp thực phẩm 24 1 .2. 7 .2. Trong các ngành công nghiệp khác 25 1 .2. 7.3. Trong công nghệ môi trường 26 1 .2. 7.4. Trong y học và mỹ phẩm 26 iii 1 .2. 7.5.