2.2.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm của lá trà (phƣơng pháp sấy khô) [4] * Nguyên tắc :
Phương pháp sấy khô sử dụng sức nóng làm bay hết hơi nước trong nguyên liệu (mẫu), cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy. Trọng lượng mẫu mất đi khi sấy khô tuyệt đối là lượng nước có trong mẫu. Từ đó tính ra phần trăm lượng nước có trong mẫu
* Tiến hành :
Cân khoảng 5 gram mẫu vào đĩa petri đã sấy khô. Cân khối lượng mẫu và đĩa trước khi sấy (m1). Sấy khô ở nhiệt độ 100 – 105oC trong tủ sấy cho đến khi trọng lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân chính xác (m2)
* Tính kết quả :
Độ ẩm của mẫu (X) được tính theo công thức X =
m : khối lượng mẫu trước khi phân tích (g) m1 : khối lượng mẫu và đĩa trước khi sấy (g)
m2 : khối lượng mẫu và đĩa sau khi sấy đến trọng lượng không đổi (g) X : độ ẩm của mẫu (%)
2.2.2.Phƣơng pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu [4,26]
Nghiền khoảng 20 gram lá trà trong 100ml dung dịch đệm photphat pH7 có chứa 15mg/ml PVP (polyvinyl pyrolidone). Hỗn hợp được lọc qua vải thường. Thu dịch lọc và ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Thu dịch nổi chứa PPO. Dịch nổi đem tủa với ethanol 90o
lạnh với tỉ lệ Vdung dịch E/Vethanol là 1: 3. Khi tủa cần cho từ từ ethanol lạnh vào dung dịch enzyme và vừa cho ethanol vào vừa khuấy đều dung dịch, để yên trong tủ lạnh trong 1 giờ để tủa enzyme. Ly tâm thu tủa, tủa được hòa tan trong 20ml dung dịch đệm photphat pH7 thu được dung dịch chứa PPO , dung dịch này được dùng để xác định hoạt độ của enzyme và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme.
2.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ của PPO [19,36]
* Nguyên tắc : PPO xúc tác quá trình oxi hóa cơ chất catechol không màu thành sản phẩm benzoquinon có màu hấp thu ánh sáng cực đại tại bước sóng 420nm.
(m1 - m2) x 100 m
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO
Thành phần Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm
Đệm photphat 0,1M pH7 (ml) 2,0 1,9
Dịch chiết enzyme (ml) 0,0 0,1
Catechol 0,05M (ml) 1,0 1,0
Tổng thể tích (ml) 3,0 3,0
Phản ứng bắt đầu xảy ra khi cho catechol vào hỗn hợp phản ứng. Đo sự tăng độ hấp thu mật độ quang tại bước sóng 420nm tại 5 phút
* Hoạt độ của PPO: Hoạt độ của PPO được xác định bằng phương pháp so màu. Một đơn vị hoạt độ enzyme được xác định là lượng enzyme cần thiết để oxi hóa phenol thành quinon làm tăng độ hấp thu mật độ quang tại bước sóng 420nm lên 0,001/phút/ml trong điều kiện thí nghiệm.
2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein trong mẫu phân tích
Tiến hành xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976). [3, 4, 6]
* Nguyên tắc
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassive Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
* Tiến hành thí nghiệm
Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Dung dịch Albumin 0.01% (ml) 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5
Nồng độ protein(µg/ml) 0 10 20 30 40 50
Hút 0,5 ml dung dịch protein vừa pha loãng như bảng trên, thêm vào 2,5 ml thuốc nhuộm Bradford, lắc đều. Sau 10 phút đem đo OD tại bước sóng 595nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu
Tương tự như trên, hút 0,5 ml dung dịch protein cần phân tích, thêm 2,5 ml thuốc nhuộm Bradford, đển yên 10 phút, đem đo OD tại bước sóng 595nm.
Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích.
2.2.5.Xác định hoạt độ riêng của PPO[4]
Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme được tính theo công thức sau:
Hoạt độ riêng (HđR) = = E mg UI Pr
Hoạt độ chung (ΣUI/g hay /ml CPE) Hàm lượng Protein (mg/g hay /ml CPE)
2.2.6. Phƣơng pháp xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của PPO 2.2.6.1. Phƣơng pháp xác định pH tối ƣu cho hoạt động của PPO [26,36]
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO được khảo sát trong các dung dịch đệm với pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8 (pH 3, 4, 5 với dung dịch đệm acid citric – Na2HPO4 0,1M; pH 6, 7, 8 với dung dịch đệm Na2HPO4 - NaH2PO4 0,1M). Các yếu tố khác như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định. Hoạt độ của PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của pH từ 3,0 – 8,0.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc hoạt độ của PPO vào pH, từ đó ta xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme tương ứng với hoạt độ cao nhất.
2.2.6.2. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của pH đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ trong các dung dịch đệm với pH khác nhau (3,0 – 8,0) trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất của enzyme.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào pH, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các giá trị pH khác nhau.
2.2.6.3. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của PPO[43]
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO được khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80oC. Hỗn hợp phản ứng gồm : 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol 0,05M. Đặt hỗn hợp vào nhiệt độ thích hợp cần khảo sát. Sau khi đạt được nhiệt độ cần thiết cho 0,1ml dịch chiết enzyme vào hỗn hợp phản ứng. Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 với sự thay đổi của nhiệt độ từ 20 – 80o
C, các yếu tố khác như pH, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ ở những nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nhiệt độ, từ đó ta xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO tương ứng với hoạt độ cao nhất.
2.2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 80o
C trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất. Hỗn hợp phản ứng gồm: 0,1ml dịch chiết enzyme trong 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu. Hỗn hợp được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát trong 30 phút. Sau thời gian ủ cho ngay hỗn hợp vào nước đá lạnh. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được thêm vào để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào nhiệt độ, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau.
2.2.6.5. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian [13, 19, 36]
Enzyme trong dung dịch đệm 0,1 M ở pH tối ưu được ủ trong các nhiệt độ khác nhau từ 60 đến 80oC trong các khoảng thời gian khác nhau từ 5 đến 40 phút. Hỗn hợp phản ứng gồm enzyme với dung dịch đệm 0,1M với pH tối ưu được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát. Sau khoảng thời gian 5 phút, 2ml hỗn hợp được lấy ra và cho ngay vào trong nước đá. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được cho vào hỗn hợp để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3. Lặp lại phản ứng trong mỗi 5 phút đến 40 phút.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ ban đầu sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng trong các khoảng thời gian
khác nhau, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme vào nhiệt độ theo thời gian so với hoạt độ ban đầu của enzyme, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian.
2.2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO[18, 32]
Hoạt độ của enzyme được khảo sát với các nồng độ cơ chất (catechol) từ 10 đến 100mM. Các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng được giữ ổn định. Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của nồng độ cơ chất từ 10 – 100mM.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ cơ chất tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nồng độ cơ chất, ta xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzyme.
2.2.6.7. Phƣơng pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian
Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol ở nồng độ tối ưu; 0,1ml dịch chiết enzyme. Đo sự tăng độ hấp thu mật độ quang tại bước sóng 420nm ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 phút với nhiệt độ tối ưu. Xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng.
Sau khi tiến hành xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng của PPO.
2.2.6.8. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO[ 36]
Enzyme PPO bị ức chế bởi nhiều chất khác nhau. Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt động của enzyme, các chất ức chế gồm acid ascorbic, acid citric, NaCl ở các nồng độ 1, 5, 10, 50, 100 mM. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1ml dịch chiết enzyme được ủ với 1,8 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu và 0,1ml chất ức chế ở các nồng độ khác nhau trong 10 phút, sau khi ủ 1ml
catechol với nồng độ tối ưu được thêm vào để xác định hoạt độ của PPO theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa phần trăm hoạt độ mất đi của enzyme so với hoạt độ ban đầu và nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta xác định được nồng độ ức chế mạnh nhất đến hoạt động của enzyme.
2.2.7. Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng enzyme trong tạo màu cho sản phẩm trà trong công nghệ chế biến trà
Quá trình chế biến trà là sự vận dụng linh hoạt và tài tình hệ enzyme oxi hóa khử có sẵn trong nguyên liệu ban đầu. Từ búp trà, lá trà người ta có thể sản xuất các loại trà đen, trà xanh, trà nâu, …, với màu sắc và hương vị khác nhau.
2.2.7.1. Phƣơng pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà
* Trong công nghệ chế biến trà đen: Nghiền 2 gram lá trà trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
* Trong công nghệ chế biến trà xanh: Xử lý 2 gram lá trà trong nước đun sôi trong 5 phút để bất hoạt PPO. Nghiền lá trà sau khi xử lí trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
2.2.7.2. Phƣơng pháp chế biến trà đen [5, 8, 9]
* Nguyên tắc: Cơ sở sinh hóa quan trọng trong chế biến trà đen là tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzyme oxi hóa mà chủ yếu là PPO oxi hóa hợp chất tanin thành quinon có màu đen sẫm của trà thành phẩm
* Quá trình chế biến trà đen có thể tóm tắt như sau
2.2.7.3. Phƣơng pháp chế biến trà xanh [5, 8,9]
* Nguyên tắc: Khác với quá trình chế biến trà đen, quá trình chế biến trà xanh không có giai đoạn làm héo và lên men. Tất cả hoạt động của enzyme oxi hóa được đình chỉ ngay giai đoạn đầu tiên của qui trình bằng phương pháp sử dụng nhiệt độ cao nên quá trình oxi hóa tannin không xảy ra.
* Quá trình chế biến trà xanh có thể tóm tắt như sau
Nguyên liệu trà Làm héo trà Vò trà Lên men trà Sấy khô trà
Phân loại và đóng gói trà
Độ ẩm không khí 60 – 70% Nhiệt độ 44 – 45o
C Thời gian 3 – 4 giờ
Độ ẩm không khí 90 – 92% Nhiệt độ 20 – 25o C Thời gian 45 phút Nhiệt độ 90 – 105o C Thời gian 30 – 40 phút Độ ẩm không khí 98% Nhiệt độ 24 – 26o C Thời gian 3 – 3,5 giờ
Nhiệt độ 95 – 100o C Thời gian 5 – 7 phút Độ ẩm không khí 90 % Nhiệt độ 22 – 24o C Thời gian 30 - 45 phút Nhiệt độ 90 – 105o C Thời gian 30 – 40 phút Nguyên liệu trà Cố định trà Vò trà Sấy khô trà
2.2.8. Phƣơng pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây [7, 15,16]
* Nguyên tắc
Trong tế bào rau củ, trái cây có chứa hợp chất phenol và PPO. Khi rau củ, trái cây bị tổn thương hay khi cắt gọt, các tế bào vỡ ra ở mặt cắt cơ học của rau củ, trái cây PPO oxi hóa hợp chất phenol thành quinon, làm sẫm màu rau củ trái cây trong điều kiện có oxi. Sử dụng nhiệt độ, pH acid, một số hóa chất hay enzyme protease để kiềm chế hoạt động của PPO sẽ hạn chế sự sẫm màu của rau củ, trái cây khi cắt gọt và bảo quản.
* Tiến hành
Táo tây, khoai tây cắt lát kích thước 1cm x 5cm x 0,5 cm, sau đó tiến hành thí nghiệm những tác nhân ức chế hoạt động của PPO
- Sử dụng nhiệt độ để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: 3 mẫu thí nghiệm cho mỗi loại nguyên liệu khoai tây và táo tây, mẫu 1 giữ ở nhiệt độ phòng (28 – 30oC), mẫu 2 đun sôi ở 100o
C trong 1 phút, mẫu 3 giữ ở nhiệt độ lạnh 4o
C. Ghi nhận và so sánh thời gian sẫm màu của 3 mẫu nêu trên.
- Sử dụng pH thấp (2, 3, 4) để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: Nhúng mẫu táo tây và khoai tây vào các dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 0,1M với pH khác nhau 2, 3, 4 trong 5 phút. Lấy ra đặt vào đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Ghi nhận thời gian sẫm màu của mẫu xử lý với pH so với mẫu không xử lý.
- Sử dụng hóa chất để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: Nhúng mẫu táo tây và khoai tây vào dung dịch acid ascorbic, acid citric, NaCl nồng độ 100mM trong 5 phút. Lấy ra đặt vào đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Ghi nhận