Trái cây và rau củ trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản thường bị hóa nâu do hoạt động của PPO oxi hóa hợp chất phenol thành quinon tạo màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương làm giảm giá trị kinh tế của nhiều loại rau quả. Để hạn chế hiện tượng hóa nâu trong rau củ và trái cây trong quá trình bảo quản và chế biến thì cần ức chế hoạt động của PPO. Có nhiều phương pháp để ức chế enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp sử dụng nên trong công nghiệp thực phẩm thường sử dụng các phương pháp để ức chế PPO như nhiệt độ, pH và một số acid hữu cơ như acid ascorbic, acid citric,….Một số phương pháp ức chế PPO như nhiệt độ, pH, enzyme, acid hữu cơ được chúng tôi tiến hành trên táo tây và khoai tây cắt.
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ thấp (0-10o
C) có tác dụng kìm hãm hoạt động của enzyme hay nhiệt độ cao (100oC) có tác dụng vô hoạt PPO. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau củ và trái cây được nêu trong mục 2.2.8. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả Nguyên liệu Nhiệt độ (o
C) Thời gian sẫm màu Khoai tây 4 2 giờ 54 phút to phòng (28 – 30) 51 phút 100 Trên 8 giờ Táo tây 4 2 giờ 26 phút to phòng (28 – 30) 16 phút 100 Trên 8 giờ
Kết quả bảng 3.15 thể hiện rằng mẫu được xử lý ở nhiệt độ thấp (0-10o C) hay nhiệt độ cao (100o
C) đều có thời gian sẫm màu chậm hơn mẫu đặt ở nhiệt độ phòng (28 – 30 oC) nên có thể dùng nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao để làm chậm sự sẫm màu của rau củ và trái cây khi cắt gọt.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Mỗi enzyme có pH hoạt động tối ưu, PPO thường có pH hoạt động tối ưu gần pH trung tính, do đó có thể dùng pH thấp (2,3,4) để kiềm chế hoạt động của PPO. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau củ và trái cây được thể hiện trong mục 2.2.8. Kết quả thể hiện trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả
Nguyên liệu
Mẫu không xử lí
Mẫu có xử lí
pH2 pH3 pH4
Thời gian sẫm màu
Khoai tây 45 phút 4 giờ 24 phút 4 giờ 04 phút 3 giờ 34 phút Táo tây 7 phút 4 giờ 55 phút 4 giờ 15 phút 3 giờ 45 phút
Kết quả bảng 3.16 thể hiện rằng khi xử mẫu ở pH thấp (2, 3, 4) đều có thời gian sẫm màu chậm hơn so với mẫu không được xử lí nên có thể dùng pH thấp để làm chậm sự sẫm màu của rau củ và trái cây khi cắt gọt. pH càng thấp khả năng ức chế enzyme càng cao nên thời gian bị sẫm màu càng chậm hơn.
3.4. 3. Sử dụng hóa chất
Hóa chất có thể ức chế hay điều khiển sự hóa nâu do có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme không thể xúc tác phản ứng oxi hóa polyphenol thành quinon hay có khả năng khử o-quinon thành o-diphenol ban đầu hoặc bất hoạt không thuận nghịch PPO nên có thể sử dụng một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric, NaCl để điều khiển sự hóa nâu của rau củ và trái cây. Phương pháp sử dụng một số hóa chất để kiềm chế sự hóa nâu được nêu trong mục 2.2.8 và kết quả thể hiện trong bảng 3.17.
Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả
Nguyên liệu
Mẫu không xử lí
Mẫu có xử lí (100 mM)
Acid ascorbic Acid citric NaCl Thời gian sẫm màu
Khoai tây 43 phút 6 giờ 26 phút 5 giờ 31 phút 3 giờ 34 phút Táo tây 9 phút 6 giờ 36 phút 5 giờ 42 phút 3 giờ 00 phút
Kết quả bảng 3.17 thể hiện rằng mẫu táo tây và khoai tây khi được xử lí với một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric và NaCl đều có thời gian sẫm màu chậm hơn so với mẫu không được xử lí hóa chất, trong đó mẫu xử lí với acid ascorbic có thời gian sẫm màu chậm hơn các chất còn lại, vì vậy acid ascorbic có hiệu quả hơn trong việc điều khiển sự hóa nâu của rau quả và trái cây.
3.4. 4. Sử dụng enzyme
PPO có bản chất cấu tạo là protein nên có thể bị bất hoạt bởi các enzyme khác có khả năng phân giải phần protein của enzyme. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 2 protease là ficin từ sung và bromelin từ thơm để bất hoạt PPO. Phương pháp tách chiết enzyme ficin và bromelin được trình bày trong phần phụ
lục mục 5.5 và phương pháp xác định hoạt độ của ficin và bromelin được trình bày trong phần phụ lục mục 5.6. Phương pháp sử dụng enzyme để kiềm chế sự hóa nâu được nêu trong mục 2.2.8 và kết quả thể hiện trong bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả
Nguyên liệu
Mẫu không xử lí
Mẫu có xử lí (0,3 UI/gNL)
Ficin Bromelin
Thời gian sẫm màu
Khoai tây 53 phút 3 giờ 21 phút 3 giờ 11 phút Táo tây 9 phút 5 giờ 36 phút 3 giờ 24 phút
Kết quả bảng 3.18 thể hiện rằng mẫu khi được xử lí với enzyme ficin và bromelin có thời gian sẫm màu chậm hơn mẫu không được xử lí nên có thể sử dụng enzyme protease có khả năng phân cắt phần protein của PPO để làm chậm sự sẫm màu của trái cây và rau củ khi cắt gọt, chế biến
3.5. Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành tách chiết PPO và tạo chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu lá trà xanh theo phương pháp được nêu trong mục 2.2.9 và kết quả được thể hiện trong bảng 3.19
Bảng 3.19. Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ lá trà nguyên liệu
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Trọng lượng nguyên liệu khô ban đầu (g) 11,22 11,24 11,20 Trọng lượng chế phẩm PPO thô (g) 0,7939 0,7941 0,7900
Tỉ lệ CPE/NL (%) 7,08 7,06 7,05
Tỉ lệ TB CPE/NL (%) 7,06 ± 0,012
Hoạt độ chung CPE (UI/gCPE) 2287,78 2268,86 2277,90 Hoạt độ chung TB CPE (UI/gCPE) 2278,18 ± 9,46
Hàm lượng protein (mg/gCPE) 23,30 24,96 23,52 Hàm lượng protein TB (mg/gCPE) 23,93 ± 0,90
Kết quả bảng 3.19 thể hiện rằng chúng tôi đã thu nhận được chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu với tỉ lệ trung bình của chế phẩm enzyme thô/nguyên liệu khô là 7,06% và enzyme thể hiện hoạt độ chung trung bình là 2278,18 UI/gCPE và hoạt độ riêng là 95,20 UI/mg Pr-E. Chế phẩm PPO có hoạt độ riêng thấp hơn so với hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu do PPO là enzyme oxi hóa khử dễ bị giảm hoạt độ trong quá trình tách chiết và sấy khô để tạo chế phẩm enzyme thô.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ những kết quả thu được trong luận văn đối chiếu với mục tiêu đã đề ra trong đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây:
4.1.1. Đã xác định các đặc tính của PPO từ lá trà như sau:
- Hoạt độ chung của PPO là 2222,64 UI/gNL và hoạt độ riêng 275,76 UI/mg-Pr- NL
- pH tối ưu cho hoạt động của enzyme là 5,0
- Enzyme hoạt động ổn định ở pH tối ưu và kém bền ở pH 3,0 và pH 8,0 sau khi ủ trong thời gian 30 phút
- Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme là 30oC
- Enzyme hoạt động ổn định khi ủ ở 40oC và kém bền khi ủ trong khoảng nhiệt độ từ 60 o
C – 80 oC trong 30 phút
- Nồng độ cơ chất (catechol) tối ưu cho hoạt động của enzyme là 50mM
- Enzyme bị ức chế bởi một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric, NaCl. Trong đó acid ascorbic ức chế hoạt động của PPO mạnh hơn acid citric và NaCl
- Thu được chế phẩm PPO thô từ lá trà với tỉ lệ trung bình của CPE thô/NL là 7,06% và enzyme thể hiện HđC TB là 2287,42 UI/gCPE và HđR là 95,20 UI/mg Pr-E
4.1.2. Ứng dụng được tính chất có lợi của enzyme PPO trong tạo màu cho sản phẩm trà đen do PPO xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon tạo sẫm màu trong sản phẩm trà đen. Ngược lại trong quá trình chế biến trà xanh cần bất hoạt PPO bởi nhiệt độ cao nên không có sự hình thành màu đen và giữ được màu xanh và vị chát trong sản phẩm trà xanh
4.1.3. Đề xuất một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây hiện tượng hóa nâu trong rau củ và trái cây khi cắt gọt như: sử dụng nhiệt độ thấp hơn 4oC hay nhiệt độ cao 100oC, dùng dung dịch đệm acid citric – phosphate 0,1M ở pH thấp 2, 3, 4, sử dụng một số hóa chất ức chế hiện tượng hóa nâu như acid ascorbic, acid citric và NaCl 0,1M hay sử dụng enzyme ficin và bromelin.
4.2. Đề nghị
- Tiến hành tinh sạch PPO và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của PPO sau khi tinh sạch
- Khảo sát thêm một số biện pháp khác trong việc ức chế hiện tượng hóa nâu - Nghiên cứu thêm một số ứng dụng của PPO trong chế biến thực phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Đào Thị Ngọc Ánh (2009), Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và
sinh Laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu,
Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.
[2]. Phan Thanh Bình, Nguyễn Văn Thường, Nguyễn Đình Tuyến, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Trần Đình Toại (2009), Nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong quá trình lên men cacao, Tạp chí Hóa Học, T. 47
(6B), trang 281 – 285.
[3]. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín, (2001), Thực tập lớn sinh hóa, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TPHCM.
[4]. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TPHCM
[5]. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), Lại Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Trần Thị Thu Trà (2010), Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản
Đại học Quốc gia TPHCM
[6]. Nguyễn Văn Mùi (2011), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.
[7]. Ngô Đại Nghiệp (2002), Thu nhận, khảo sát một số đặc tính, ứng dụng của enzym ficin từ cây sung giống ficus, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM.
[8]. Lương Hồng Quang (2004), Bài giảng: Các phương pháp bảo quản và chế biến
trà, Khoa công nghệ thực phẩm, Đại học nông lâm TPHCM.
[9]. Đồng Thị Thanh Thu, (2008), Hóa sinh ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM.
[10]. Lê Ngọc Tú và cộng tác, (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa
Tài liệu Tiếng Anh
[11]. Adinarayana Kunamneni, Antonio Ballesteros, Francisco J. Plou and Miguel Alcalde (2007), Fungal laccase – a versatile enzyme for biotechnological applications, Departamento de Biocatalisis, Instituto de Catalisis y Petroleoquimica,
CSIC, 28049 – Madrid, Spain.
[12]. Adinarayana Kunamneni, Francisco J. Plou, Antonio Ballesteros and Miguel Alcalde, Laccases and their applications: A patent review, Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain.
[13]. Ahmet Yemenicioglu, Mehmet Özkan, Bekir Cemeroglu (1997) , Some Characteristics of Polyphenol Oxidase and Peroxidase from Taro (Colocasia antiquorum), Tr. J. of Agriculture and Forestry Vol 23, pp 425-430.
[14]. Alfred M. Mayer and Eitan Harel (1978), Review polyphenol oxidase in plants, phytochemistry, vol 18, pp193-215.
[15]. A.M.C.N. Rocha, C.M.Brochado and A.M.M.B. Morais (1996), Influence of chemical treatment on quality of cut apple (cv. Jonagored), Journal of Food
Quality, 21, pp 13-28.
[16]. A.M.C.N. Rocha and A.M.M.B. DE Morais (2005), Polyphenoloxidase activity of minimally processes „Jonagored‟ apple (Malus Domestica), Journal of
Food Processing and Preservation, Vol 29, pp 8–19.
[17]. A.M.C.N Rocha, A.M.M.B. Morais, Characterization of polyphenol oxidase (PPO) extracted from „Jonagored‟ apple, Escola Superior de Biotecnologia,
Universidade catolica Portuguesa, Rua Dr.Antonio Bernardino de Almeida, 4200- 072 Porto, Portugal.
[18]. Arnnok, P., Ruangviriyachai, C., Mahachai, R., Techawongstien, S. and Chanthai, S. (2010), Optimization and determination of polyphenol oxidase and peroxidase activities in hot pepper (Capsicum annuum L.) pericarb, International
[19]. Bora, P.S. Holschuh, H.J, da Silva Vasconcelos, M.A (2004),
Characterization of polyphenol oxidase of soursop (Annona muricata L.) fruit and a comparative study of its inhibition in enzyme extract and pulp, Cienc. Tecnol. Aliment, Vol 4, No 4, pp 267-273.
[20]. Caodi Fang, Changzheng Wang, Youling L.Xiong, Kirk W. Pomper, (2006),
Extraction and characterization of polyphenol oxidase in Pawpaw (Asimina Triloba) fruit, Journal of Food Biochemistry, 31, pp 603-620.
[21]. Chang-Peng Yang, Shuji Fujita, Koei Kohno, Akiko Kusubayashi, MD. Ashrafuzzaman, and Nobuyuki Hayashi, Partial purification and characterization
of Polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) peel, Laboratory of Food
Science, Faculty of Agriculture, Saga University, Saga 840-8502, Japan.
[22]. Christiane Queiroz, Maria Lúcia Mendes Lopes, Eliane Fialho and Vera Lúcia Valente-Mesquita, (2008), Polyphenol oxidase: Characteristics and mechanisms of browning control, Derpartamento de Nutricao Basica experimental, Food Reviews
International, 24, pp 361-375.
[23]. Claudia POPA, Gabriela BAHRIM (2011), Streptomyces tyrosinase: production and practical applications, Innovative Romanian Food Biotechnology,
Vol 8, pp 1-7
[24]. Claus H, (2004), Laccase: structure, reactions, distribution. Micron Oxford
England, Vol 35, p 93-96.
[25]. Dhirayos Wititsuwannakula, Nopphakaew Chareonthiphakornb, Mario Pacec, Rapepun Wititsuwannakulb (2002), Polyphenol oxidases from latex of Hevea brasiliensis: purification and characterization, Phytochemistry Vol. 61, pp 115–
121
[26]. Didem Sutay, (2003), Isolation, characterization and immobilization of polyphenol oxidase from Muberry (morus alba) leaf tissues, A thesis submitted to
the graduate school of natural and applied sciences of the Middle East Technical University, In partial fulfillment of the requirements for degree of master of science in the department of chemical engineering.
[27]. Edna C. Ramirez, John R. Whitaker and Victoria M. Virador, Polyphenol oxidase, University of California, Davis, Davis, California, U.S.A.
[28]. Emine Ziyan, Sule Pekyardimci (2001), Characterization of Polyphenol Oxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus), Turkey Journal of
Chemistry, Vol 27, pp 217-225
[29]. Erhan Astarci, (2003), Production and biochemical characterization of polyphenol oxidase from Thermomyces Lanuginosus, A thesis submitted to the
graduate school of natural and applied sciences of the Middle East Technical University, In partial fulfillment of the requirements for degree of master of science in the department of biotechnology.
[30]. Fabienne Crumière (2000), Inhibition of enzymatic browning in food products
using bio-ingredients, A thesis submitted to the graduate studies and research in
partial fulfillment of the requirement of the degree of Master of Science, McGill University Montreal, Québec.
[31]. Gisele Polete Mizobutsi, Fernando Luiz Finger, Rosilene Antônio Ribeiro, Rolf Puschmann, Ludmila Lafetá de Melo Neves, Wagner Ferreira da Mota (2010),
Effect of pH and temperature on peroxidase and polyphenoloxidase activities of litchi pericarp, Science of Agricultural (Piracicaba, Brazil), vol 67, pp 213-217.
[32]. Gao Jia, Wang Baogang, Feng Xiaoyuan, Tang Haoru, LI Wensheng and Zhang Kaichun (2011), Partial Properties of Polyphenol Oxidase in Sour Cherry (Prunus cerasus L. CV. CAB) Pulp,World Journal of Agricultural Sciences 7 (4), pp 444-449
[33]. Greta Faccio, (2011), Discovery of oxidative enzymes for food engineering: Tyrosinase and sulfhydryl oxidase, Faculty of Biological and Environmental
Sciences – Division of Genetics, University of Helsinki, Finland.
[34]. Hülya Yağar, Ayten Sağiroğlu (2000), Partially purification and characterization of polyphenol oxidase of quince, Journal of Chemistry, 26, pp 97-
[35]. Ikram Madani, Pat M. Lee, Lee Kong Hung (2011), Partial Purification and Characterisation of Polyphenol Oxidase from Hibiscus rosa–sinensis L.,
International Conference on Biotechnology and Food Science IPCBEE, vol.7 (2011) IACSIT Press, Singapore.
[36]. Jianhui Wang, Weibo Jiang, Baogang Wang, Shijian Liu, Zhengli Gong and Yunbo Luo (2006), Partial properties of polyphenol oxidase in mango (mangifera indica L. CV. “Tainong”), Journal of Food Biochemistry, Vol 31, pp. 45–55.
[37]. James K. Palmer (1963), Banana Polyphenoloxidase: Preparation and Properties, Central Research Laboratories, United Fruit Company, Norwood,
Massachusetts.
[38]. Jyotsnabaran Halder, Prodip Tamuli and A.N. Bhaduri (1998), Isolation and characterization of polyphenol oxidase from indian tea leaf (Camellia sinensis),
Nutritional Biochemistry, 9, pp 75-80.
[39]. Keisuke Ikehata (1999), Characterisation of tyrosinase for the treatment of aqueous phenols, Department of Civil Engineering and Applied Mechanics McGill
University, Montreal.
[40]. Loera Corral Octavio, Perez Perez Ma. Cristina Irma Barbosa Rodriguez Juan Ricardo and Villasenor Ortega Francisco (2006), Laccases, Departmento de Ingenieria Bioquimica, Instituto Tecnologico de Celaya Av. Tecnologico esq. A. Garcia Cubas S/N, Col. Fovissste C.P.38010 Celaya Guanajuato, Mexico.
[41]. Melda Zeynep Guray, (2009), Partial purfication and characterization of polyphenol oxidase from thermophilic bacillus sp, A thesis submitted to the
graduate of engineering and sciences of Izmir Institute of Technology in Partial Fulfillment of requirements for degree of master of science in biotechnology.
[42]. M. Oktay, I. Kufrevioglu, I. Kocacaliskan and H. Sakiroglu (1995),
Polyphenoloxidase from Amasya apple, Journal of food science, Vol 60, No 3. pp
[43]. M. Umit Unal, Selin N. Yabaci, Aysun Sener (2011), Extraction, partial purification and characterization of polyphenol oxidase from tea leaf (Camellia sinensis), GIDA 36 (3), pp. 137-144
[44]. Oktay Arslan, Arzu Temur and I˙ srafil Tozlu (1998), Polyphenol Oxidase from Malatya Apricot (Prunus armeniaca L.), Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 46, pp 1239−1241.
[45]. Oktay Arslan, Mahmut Erzengin, Selma Sinan, Ozen Ozensoy, Purification of
mulberry (Morus alba L.) polyphenol oxidase by affinity chromatography and investigation of its kinetic and electrophoretic properties, Balikesir University
Science and Art Faculty, 10100 Balikesir, Turkey
[46]. Per E. M. Siegbahm (2004), The catalytic cycle of catechol oxidase, J. Biol
.Inorg Chemi, 9, pp 577-590.
[47]. Robert B. Barrett (2002), Characterisation of apricot polyphenol oxidase during fruit development, Thesis submitted for the degree of master of applied
science in the university of Adelaide.
[48]. Ron Shin, Tim Froderman and William H. Flurkey (1996), Isolation and characterization of a mung bean leaf polyphenol oxidase, Phytochemistry, Vol 45,