xác định sự tương tác giữa hai protein atmpk3 và atmyb77 trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI MẠNH HÙNG XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN AtMYB77 VÀ AtMPK3 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI MẠNH HÙNG XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN AtMPK3 VÀ AtMYB77 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi. Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác. Tác giả Bùi Mạnh Hùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn, Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh – Trưởng Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh – Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình hướng dẫn dìu dắt trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn. Cuối cùng, xin gửi tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc quan tâm, động viên góp ý cho suốt trình học tập hoàn thành luận văn. Học viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan trình điều hòa phiên mã nhân tố phiên mã 1.1.1 Điều hòa phiên mã 1.1.2 Vai trò nhân tố phiên mã 1.1.3 Cơ chế hoạt động nhân tố phiên mã 1.1.4 Phân loại nhân tố phiên mã 1.2 Giới thiệu họ nhân tố phiên mã MYB 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc, chức phân loại 1.2.2 Giới thiệu chung nhân tố phiên mã MYB77 11 1.3 Chuỗi enzym MAP kinase (MPK cascades) 13 1.3.1 Vai trò 13 1.3.2 Cơ chế hoạt động 13 1.4 Các enzym nhóm MPK 14 1.4.1 Phân loại 14 1.4.2 Một số chức 15 1.4.3 MPK3 19 1.4.4 Các nghiên cứu xác định chất cho MPK 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Hóa chất, thiết bị 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp PCR điện di DNA 25 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.3.2 Tinh sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzym giới hạn phương pháp gel 26 2.3.3 Phương pháp gắn hai đoạn DNA enzym ligase (Ligation) 26 2.3.4 Biến nạp vector vào vi khuẩn E. coli phương pháp sốc nhiệt 26 2.3.5 Phương pháp tách chiết tinh plasmid từ vi khuẩn E. coli 27 2.3.6 Phương pháp kiểm tra biểu protein tái tổ hợp E. coli 27 2.3.7 Phương pháp thu nhận tinh protein tái tổ hợp 28 2.3.8 Phương pháp thử phản ứng phosphoryl hóa điều kiện in vitro 29 2.3.9 Kiểm tra tương tác 02 protein phương pháp pull-down 29 2.3.10 Phân tích khối phổ để xác định điểm phosphoryl hóa 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khuếch đại gen mã hóa protein AtMYB77 từ Arabidopsis 31 3.2 Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77 32 3.3 Chuyển gen mã hóa protein AtMYB77 vào vector biểu pGEX-5X 33 3.4 Kiểm tra lại có mặt gen mã hóa protein AtMYB77 AtMPK3 vector biểu 34 3.5 Kiểm tra biểu protein AtMPK3 vi khuẩn E. coli chủng M15 36 3.6 Kiểm tra biểu protein AtMYB77 vi khuẩn E. coli chủng BL21 37 3.7 Xác định tương tác protein AtMYB77 AtMPK3 kỹ 3.8 thuật pull-down 39 Xác định điểm tương tác protein AtMYB77 40 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani MAPK Mitogen activated protein kinase MYB Myeloblastosis PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate – EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Các nhân tố ảnh hưởng lên trình điều hòa hoạt động biểu gen 1.2 Motif EAR-RNA 1.3 Họ protein MYB Arabidopsis 1.4 Dẫn truyền tín hiệu đáp ứng lại kích thích môi trường thực 10 vật thông qua chuỗi MPK cascades 14 1.5 Hoạt động điều khiển nhân tố phiên mã MPK thực vật 21 2.1 Cấu trúc vector pTZ257R/T dùng để tách dòng gen mã hóa AtMYB77 22 2.2 Sơ đồ cấu trúc hệ thống vector biểu protein pGEX 23 2.3 Đoạn trình tự mang vị trí cắt cho enzym giới hạn (Multi Cloning Site -MCS) vector pGEX5X-1 cải biến nhằm bổ sung thêm vị trí cắt. 23 2.4 Cấu trúc vector pQE sử dụng biểu gen PK3 24 3.1 Khuếch đại gen mã hóa protein AtMYB77 từ cDNA với cặp mồi đặc hiệu 31 3.2 Kiểm tra có mặt gen AtMYB77 vector tách dòng phương pháp PCR khuẩn lạc 3.3 33 Sản phẩm cắt plasmid pGEX-5X sau chuyển gen AtMYB77 enzym giới hạn Sac I Pst I 3.4 34 Kiểm tra có mặt genAtMYB77 AtMPK3 vector biểu phương pháp PCR 35 3.5 Kiểm tra biểu gen AtMPK3 phương pháp điện di SDS-PAGE 36 3.6 Kiểm tra biểu protein AtMYB77 phương pháp điện di SDS-PAGE 3.7 38 Kết western-Blot sau thực phản ứng pull-down kháng thể kháng His 40 3.8 Đặc điểm cấu trúc protein AtMYB77 41 3.9 Kiểm tra sản phẩm sau thực phản ứng phosphoryl hóa điện di SDS-PAGE 3.10 42 Khối phổ polipeptid từ AtMYB77 cắt enzym chymotrypsin sau làm giàu cách cho qua cột Ti2O Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 43 Page vi MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nghiên cứu điều hòa biểu gen diễn mạnh mẽ khắp phòng thí nghiệm toàn cầu để đáp ứng nhu cầu hiểu biết trình điều hòa biểu gen ứng dụng thực tiễn to lớn mà đem lại. Điều hoà hoạt động gen trình điều hoà lượng sản phẩm gen tạo qua trình phiên mã dịch mã tế bào đảm bảo cho hoạt động sống tế bào phù hợp với điều môi trường với phát triển bình thường thể. Điều hoà hoạt động gen trình có tham gia nhiều yếu tố tham gia. Những nhân tố trực tiếp tham gia vào điều hòa hoạt động gen sinh vật nhân chuẩn nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF), có chất protein. Các nhân tố hoạt động riêng lẻ kết hợp thành phức hợp để điều hòa hoạt động gen mức độ khác nhau. Tuy nhiên để thực vai trò nhân tố phiên mã cần kích hoạt nhiều loại tín hiệu khác tế bào. Tham gia vào trình tiếp nhận dẫn truyền tín hiệu bao gồm nhiều thành phần khác nhau, đóng vai trò chủ đạo protein kinase (PK). Trong protein kinase thuộc nhóm mitogenactivated protein kinase (MPKs cascade) biết đến với vai trò trung tâm. Những protein nhóm tham gia vào hầu hết hoạt động sống phân hóa, biệt hóa sinh trưởng phát triển tế bào, dẫn truyền tín hiệu tế bào nhằm thích nghi với tác động môi trường. MPKs cascades gồm ba lớp; protein thuộc nhóm MAPK kinase kinase (MPKKK, MEKK, MAP3K), protein thuộc nhóm MAPK kinase (MAPKK, MEK, MKK, MAP2K) protein thuộc nhóm MAPK (MPK). Việc dẫn truyền tín hiệu thông qua MPKs cascades tương đối bảo thủ, protein kinase lớp hoạt hóa protein lớp thông qua trình phosphoryl hóa (phosphorylation). Sau hoạt hóa MPKKs, MPKs tiếp tục phosphoryl hóa chất mình. Nhóm chất MPKs đa dạng bao gồm nhiều loại protein khác có nhân tố phiên mã (transcription factor). Arabidopsis thaliana biết đến mô hình để thực Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page nghiên cứu chức gen sinh vật nhân chuẩn có số ưu việt như; thực vật bậc cao điển hình, có vòng đời ngắn hệ gen giải mã hoàn toàn. Trong số 20 loại protein nhóm MPK Arabidopsis thaliana, người ta thường tập trung vào 02 protein MPK3/6. Vai trò, chức chế dẫn truyền tín hiệu protein biết đầy đủ, chất protein mà tham gia điều khiển ẩn số mà nhà khoa học tìm lời giải đáp. Để xác định chất MPK vai trò mà tham gia, việc phải xác định xem MPK có khả tương tác với protein sau xác định xem có phosphoryl hóa protein hay không. Chính việc tìm mối tương tác protein cần thiết, từ làm chủ trình biểu gen mong muốn, hay nói rộng tác động cách mạnh mẽ chủ động lên sản phẩm mà mong muốn sinh vật quan tâm. Xuất phát từ vấn đề trên, tiến hành thực đề tài: “Xác định tương tác hai protein AtMYB77 AtMPK3 điều kiện in vitro” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu mối quan hệ hai protein AtMYB77 AtMPK3 từ kiểm tra xác định xem hai protein có tương tác với điều kiện in vitro hay không. Nội dung nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77 Arabidopsis thaliana Biểu hai protein tái tổ hợp AtMYB77 AtMPK3 vi khuẩn E. coli Kiểm tra tương tác hai protein AtMYB77 AtMPK3 điều kiện in vitro Xác định chế tương tác hai protein thông qua việc xác định điểm tương tác protein AtMYB77. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Như protein AtMYB77 tái tổ hợp biểu có kích thước khoảng 60 kDa, tương ứng với băng bên hình điện di (Hình 3.6). Còn băng bên phần protein tái tổ hợp AtMYB77, bị đứt gẫy phân cắt tác động protease. Như kết luận protein AtMYB77 biểu mạnh vi khuẩn E. coli chủng BL21, điều kiện cảm ứng 0,5 mM IPTG với thời gian sau 1h. ∼60 kDa Hình 3.6. Kiểm tra biểu protein AtMYB77 phương pháp điện di SDS-PAGE Giếng 1: Marker Giếng 2: Protein tổng số E. coli trước cảm ứng Giếng 3-6: Protein tổng số E. coli sau cảm ứng 0.5mM IPTG 300 C sau; 0.5, 1, 3h Tiếp sau tiến hành tinh sơ protein thông qua cột sắc ký lực Glutathione Sepharose. Do AtMYB77 biểu với protein GST, protein gắn lực với Glutathione Sepharose nên dễ dàng thu nhận protein tái tổ hợp mong muốn. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 3.7. Xác định tương tác protein AtMYB77 AtMPK3 kỹ thuật pull-down Từ kết thực hiện, thu nhận 02 loại protein tái tổ hợp gắn với đuôi khác His-AtMPK3 (AtMPK3 liên kết với đuôi histidine) GSTMYB77 (AtMYB77 liên kết với protein GST). Hai protein có lực khác cho qua cột sắc ký có thành phần khác nhau, dựa vào nguyên lý tiến hành xác định mối tương tác chúng. Nguyên liệu cho phản ứng dung dịch protein tái tổ hợp thô (His-AtMPK3 GST-AtMYB77) thu nhận sau siêu âm phá tế bào ly tâm. Đầu tiên lấy 50µg protein tổng số có chứa His-AtMPK3 cho vào ống eppendorf, bổ sung 1ml dung dịch đệm gắn kết với 10µl Ni-NTA agarose, hỗn hợp đảo điều kiện 40C vòng 2h nhằm mục đích cho protein His-AtMPK3 liên kết với Ni-NTA agarose. Sau ly tâm thu cặn để loại bỏ toàn protein không liên kết, rửa cặn lần để đảm bảo hỗn hợp thu có Ni-NTA agarose liên kết với His-AtMPK3. Tiếp tục hòa tan cặn ml dung dịch gắn kết bổ sung 50µg protein thô có chứa GST-AtMYB77, sử dụng ống khác làm đối chứng với protein bổ sung vào GST. Các hỗn hợp đảo điều kiện 40C khoảng 12h để đảm bảo protein tiếp xúc với nhau, chúng tương tác chúng liên kết với dung dịch. Hỗn hợp cuối ly tâm, rửa thu cặn. Bổ sung 50 µl đệm điện di protein vào phần cặn, đun sôi phút, để lắng. Sử dụng dịch để chạy điện di protein thực western-blot với kháng thể thứ kháng thể kháng GST. Khi tiến hành điện di bổ sung thêm 01 giếng chứa 5µg hỗn hợp protein chứa GST-AtMYB77 làm đối chứng dương. Trong trường hợp protein (GST-AtMYB77 GST) tương tác với His-AtMPK3 không bị loại bỏ trình rửa tồn hỗn hợp cuối ngược lại. Kết western-blot thể hình 3.7. Hình 3.7 cho thấy, giếng số không thấy xuất băng tín hiệu điều chứng tỏ protein GST không tương tác với His-ArMPK3. Ngược lại giếng số 4, thấy xuất 01 băng, băng có kích thước với kích thước protein GST-AtMYB77 giếng số 3. Như hỗn hợp cuối Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 mẫu số (giếng 4) có chứa protein GST- AtMYB77, điều chứng tỏ GST- AtMYB77 liên kết với protein His-AtMPK3. Từ kết luận mối liên kết thực 02 protein His-AtMPK3 với AtMYB77 His-AtMPK3 với GST (vì giếng số không xuất băng). Thông qua kết xác định 02 protein AtMPK3 AtMYB77 tương tác với điều kiện in vitro thông qua kỹ thuật pull-down. ∼103 kDa Hình 3.7. Kết western-Blot sau thực phản ứng pull-down kháng thể kháng His Giếng 1: Marker Giếng 2: đối chứng âm với 50µg protein GST 50µg protein His-AtMPK3 Giếng 3: đối chứng dương với 5µg GST-AtMYB77 Giếng 4: sản phẩm sau thực pull-down với 50µg protein GSTAtMYB77 50µg protein His-AtMPK3 3.8. Xác định điểm tương tác protein AtMYB77 Để xác định rõ chế tương tác 02 protein tiến hành xác định điểm tương tác protein AtMYB77. Như giới thiệu AtMPK3 loại protein kinase AtMYB77 nhân tố phiên mã. Chính mối tương tác 02 protein dẫn đến việc thực phản ứng phosphoryl hóa phân tử AtMYB77. Căn vào giả thiết xác định điểm tương tác thông qua điểm phosphoryl hóa AtMYB77. Phân tích đặc điểm cấu trúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 protein AtMYB77 xác định nhân tố phiên mã thuộc nhóm R1R2-MYB, protein có chứa 02 đoạn trình tự lặp lại không hoàn toàn R1 R2 (Hình 3.8), khu vực liên kết với DNA trình điều hòa phiên mã. Điều đặc biệt phân tử protein có chứa 07 điểm phosphoryl hóa giả định cho protein MAP kinase, axit amin serine (S) treonine (T) theo sau prolin (P), vị trí đánh dấu hình 3.8. Hình 3.8. Đặc điểm cấu trúc protein AtMYB77 Để xác định điểm tương tác (điểm phosphoryl hóa), tiến hành phân tích khối phổ, dựa nguyên lý điểm xảy trình phosphoryl hóa điểm bổ sung thêm 01 gốc phosphate khối lượng chúng tăng lên. Trước phân tích khối phổ, thực phản ứng phosphoryl hóa điều kiện in vitro với nguồn nguyên liệu hai protein tinh sơ AtMYB77 AtMPK3. Trộn 5µg protein AtMPK3 20µg protein AtMYB77 đệm phản ứng có bổ sung ATP, thực phản ứng 300C vòng 1h sau dừng phản ứng cách bổ sung 5µl đệm điện di protein ủ 650C 15 phút. Các mẫu sau điện di gel polyacrylamide (hình 3.9). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 10 ∼103 kDa Hình 3.9. Kiểm tra sản phẩm sau thực phản ứng phosphoryl hóa điện di SDS-PAGE Giếng 1: Marker Giếng 2: Protein AtMPK3 Giếng 3-6: Hỗn hợp protein AtMPK3 AtMYB77 mặt ATP Giếng 7-10: Hỗn hợp protein AtMPK3 AtMYB77 có mặt ATP Bản điện di sau gửi phân tích khối phổ MALDI-TOF, kết có bốn đoạn peptide xác định có thay đổi khối lượng sau phản ứng phosphoryl hóa (Hình 3.10). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 Hình 3.10. Khối phổ polipeptid từ AtMYB77 cắt enzym chymotrypsin sau làm giàu cách cho qua cột Ti2O (A) Peptide có trình tự S62PEEDETIVTARAQF (B) Peptide có trình tự RDCGVIT297PKVE (C) Peptide có trình tự MS148PES151PNGIDVSDSSTIPS165PSS168PVAQL (D) Peptide có trình tự SAFAPVDTGLYMS148PES151PNGIDVSD Bốn đoạn peptide xác định có thay đổi khối lượng so sánh trọng lượng phân tử trước sau xảy phản ứng phosphoryl hóa có chứa số điểm gắn gốc phosphate (các vị trí serine treonine), nhiên có vị trí điểm phosphoryl hóa giả định cho MAP kinase (S/TP). Các vị trí serine vị trí 62, 148, 151, 165, 168 treonine vị trí 297. Từ kết kết luận ràng 02 potein AtMYB77 AtMPK3 tương tác với điều kiện in vitro, chúng tương tác với 06 vị trí nằm phân tử protein AtMYB77. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã tách dòng thành công gen mã hóa protein AtMYB77 từ Arabidopsis. - Đã chuyển thành công gen mã hóa protein AtMYB77 sang vector biểu protein pGEX. - Đã biểu thành công 02 protein tái tổ hợp His-AtMPK3 GSTAtMYB77 vi khuẩn E. coli. - Đã xác định 02 protein AtMPK3 AtMYB77 tương tác với điều kiện in vitro. - Đã xác định 06 điểm tương tác cho AtMPK3 nằm protein AtMYB77 vị trí serine 62, 148, 151, 165, 168 treonine 297. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục xác định mối tương tác 02 protein AtMPK3 AtMYB77 điều kiện in vivo. - Xác định vai trò mối tương tác Arabidopsis. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andreasson E, Jenkins T, Brodersen P, Thorgrimsen S, Petersen NH, Zhu S, Qiu JL, Micheelsen P, Rocher A, Petersen M, Newman MA, Bjorn Nielsen H, Hirt H, Somssich I, Mattsson O, Mundy J (2005) The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses. EMBO J 24: 2579-2589 2. Bethke G, Unthan T, Uhrig JF, Poschl Y, Gust AA, Scheel D, Lee J (2009) Flg22 regulates the release of an ethylene response factor substrate from MAP kinase in Arabidopsis thaliana via ethylene signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 80678072 3. Caspersen MB, Qiu JL, Zhang X, Andreasson E, Naested H, Mundy J, Svensson B (2007) Phosphorylation sites of Arabidopsis MAP kinase substrate (MKS1). Biochim Biophys Acta 1774: 1156-1163 4. Chin-Min Hwa X-CY (2008) The AtMKK3 pathway mediates ABA and salts signaling in Arabidopsis. Act Physiol Plant 30: 277-286 5. Colcombet J, Hirt H (2008) Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochem J 413: 217-226 6. Djamei A, Pitzschke A, Nakagami H, Rajh I, Hirt H (2007) Trojan horse strategy in Agrobacterium transformation: abusing MAPK defense signaling. Science 318: 453-456 7. Feilner T, Hultschig C, Lee J, Meyer S, Immink RG, Koenig A, Possling A, Seitz H, Beveridge A, Scheel D, Cahill DJ, Lehrach H, Kreutzberger J, Kersten B (2005) High throughput identification of potential Arabidopsis mitogen-activated protein kinases substrates. Mol Cell Proteomics 4: 1558-1568 8. Gudesblat GE, Iusem ND, Morris PC (2007) Guard cell-specific inhibition of Arabidopsis MPK3 expression causes abnormal stomatal responses to abscisic acid and hydrogen peroxide. New Phytol 173: 713-721 9. Jonak C, Okresz L, Bogre L, Hirt H (2002) Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling. Curr Opin Plant Biol 5: 415-424 10. Jung C, Seo JS, Han SW, Koo YJ, Kim CH, Song SI, Nahm BH, Choi YD, Cheong JJ (2008) Overexpression of AtMYB44 enhances stomatal closure to confer abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis. Plant Physiol 146: 623-635 11. Jung C, Shim JS, Seo JS, Lee HY, Kim CH, Choi YD, Cheong JJ (2010) Non-specific phytohormonal induction of AtMYB44 and suppression of jasmonate-responsive gene activation in Arabidopsis thaliana. Mol Cells 29: 71-76 12. Larsen MR, Thingholm TE, Jensen ON, Roepstorff P, Jorgensen TJ (2005) Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics 4: 873-886 13. Lee JS, Wang S, Sritubtim S, Chen JG, Ellis BE (2009) Arabidopsis mitogen-activated protein kinase MPK12 interacts with the MAPK phosphatase IBR5 and regulates auxin signaling. Plant J 57: 975-985 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 14. Link V, Sinha AK, Vashista P, Hofmann MG, Proels RK, Ehness R, Roitsch T (2002) A heat-activated MAP kinase in tomato: a possible regulator of the heat stress response. FEBS Lett 531: 179-183 15. Liu L, White MJ, MacRae TH (1999) Transcription factors and their genes in higher plants functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem, 262, 247-257. 16. Liu XM, Kim KE, Kim KC, Nguyen XC, Han HJ, Jung MS, Kim HS, Kim SH, Park HC, Yun DJ, Chung WS (2010) Cadmium activates Arabidopsis MPK3 and MPK6 via accumulation of reactive oxygen species. Phytochemistry 71: 614-618 17. Liu Y, Zhang S (2004) Phosphorylation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase by MPK6, a stress-responsive mitogen-activated protein kinase, induces ethylene biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell 16: 3386-3399 18. MAPK-Group (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. TRENDS in Plant Science 7: 19. Menke FL, Kang HG, Chen Z, Park JM, Kumar D, Klessig DF (2005) Tobacco transcription factor WRKY1 is phosphorylated by the MAP kinase SIPK and mediates HR-like cell death in tobacco. Mol Plant Microbe Interact 18: 1027-1034 20. Merkouropoulos G, Andreasson E, Hess D, Boller T, Peck SC (2008) An Arabidopsis protein phosphorylated in response to microbial elicitation, AtPHOS32, is a substrate of MAP kinases and 6. J Biol Chem 283: 10493-10499 21. Mitsuda N, Ohme-Takagi M (2009) Functional analysis of transcription factors in Arabidopsis. Plant Cell Physiol, 50, 1232-1248. 22. Mizoguchi T, Ichimura K, Shinozaki K (1997) Environmental stress response in plants: the role of mitogen-activated protein kinases. Trends Biotechnol 15: 15-19 23. Nguyen XC, Kim SH, Lee K, Kim KE, Liu X-M, Han HJ, Hoang MHT, Lee S-W, Hong JC, Moon YH, Chung WS (2012). Identification of a C2H2-type zinc finger transcription factor (ZAT10) from Arabidopsis as a substrate of MAP kinase. Plant Cell Reports 31(4):737-45. 24. Ortiz-Masia D, Perez-Amador MA, Carbonell J, Marcote MJ (2007) Diverse stress signals activate the C1 subgroup MAP kinases of Arabidopsis. FEBS Lett 581: 1834-1840 25. Popescu SC, Popescu GV, Bachan S, Zhang Z, Gerstein M, Snyder M, Dinesh-Kumar SP (2009) MAPK target networks in Arabidopsis thaliana revealed using functional protein microarrays. Genes Dev 23: 80-92 26. Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 290, 2105-2110. 27. Riechmann JL, Ratcliffe OJ (2000) A genomic perspective on plant transcription factors. Curr Opin Plant Biol, 3, 423-434. 28. Rodriguez MC, Petersen M, Mundy J (2010) Mitogen-activated protein kinase signaling in plants. Annu Rev Plant Biol 61: 621-649 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 29. Romero I, Fuertes A, Benito MJ, Malpica JM, Leyva A, Paz-Ares J (1998) More than 80R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. Plant J, 14, 273-284. 30. Sharrocks AD, Yang SH, Galanis A (2000) Docking domains and substrate-specificity determination for MAP kinases. Trends Biochem Sci 25: 448-453 31. Shin R, Burch AY, Huppert KA, Tiwari SB, Murphy AS, Guilfoyle TJ, Schachtman DP (2007) The Arabidopsis transcription factor MYB77 modulates auxin signal transduction. Plant Cell, 19, 2440-2453. 32. Stracke R, Werber M, Weisshaar B (2001) The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol 4: 447-456 33. Takahashi F, Yoshida R, Ichimura K, Mizoguchi T, Seo S, Yonezawa M, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2007) The mitogen-activated protein kinase cascade MKK3-MPK6 is an important part of the jasmonate signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Cell 19: 805-818 34. Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao S, Shinozaki K (1993) An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell 5: 1529-1539 35. Xing Y, Jia W, Zhang J (2008) AtMKK1 mediates ABA-induced CAT1 expression and H2O2 production via AtMPK6-coupled signaling in Arabidopsis. Plant J 54: 440451 36. Yoo SD, Cho YH, Tena G, Xiong Y, Sheen J (2008) Dual control of nuclear EIN3 by bifurcate MAPK cascades in C2H4 signalling. Nature 451: 789-795 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 [...]... con đường ubiquitin-proteasome và các chất vận chuyển mà điều khiển sự hấp thụ và sự định vị ở cực của auxin Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện gen để đáp ứng lại auxin cũng là một thành phần chủ chốt trong sự điều hòa vô số tác động mà auxin thực hiện trong sự sinh trưởng và phát triển của cây Một vài nhân tố phiên mã được điều hòa bởi auxin, đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của... như các protein được điều hòa bởi MPK, một số phương pháp nghiên cứu đã được sử dụng như xác định mối tương tác protein- protein, các phản ứng thử nghiệm phosphoryl hóa trong phòng thí nghiệm (in vitro) hoặc kỹ thuật sàng lọc và phân tích protein tổng số Bằng các kỹ thuật này nhiều protein đã được xác định là cơ chất của MPK, trong số này HsfA3 là nhân tố phiên mã đầu tiên được mô tả có tham gia vào phản... lại điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng Ngược lại với trường hợp thiếu hụt ni-tơ và phốt- pho, sự thiếu hụt ka-li dẫn đến sự giảm sút trong quá trình sinh trưởng ở cả rễ và ngọn Trong điều kiện thiếu hụt ka-li, sự sinh trưởng và phát triển của rễ phụ giảm Hooc-môn auxin đóng một vai trò trung tâm trong sự phát triển của rễ phụ Hoạt động của auxin phụ thuộc vào các thụ thể auxin đặc hiệu hoạt động trong. .. băng protein biểu hiện trước và sau khi cảm ứng bằng IPTG (Nguyen et al, 2012) 2.3.7 Phương pháp thu nhận và tinh sạch các protein tái tổ hợp Sau khi xác định được sự biểu hiện cũng như điều kiện biểu hiện của protein tái tổ hợp, tiến hành sản xuất lượng lớn và tinh sạch sơ bộ thông qua các liên kết ái lực giữa tag-fusion của protein và cột sắc ký Vi khuẩn có chứa plasmid mang gen mong muốn được nuôi trong. .. phosphoryl hóa và hoạt hóa một số protein kinase như RSK (Ribosomal S6 kinase), MNK (MPK-interacting kinase), MPKAP (MPK-activated protein kinase) MSK (mitogen stress-activated protein kinase) (Sharrocks et al, 2000) Đã có rất nhiều các nghiên cứu về sự hoạt hóa MPK bởi các nhân tố ngoại bào, tuy nhiên việc xác định cơ chất của chúng trong chuỗi phản ứng còn hết sức giới hạn Để xác định được các cơ... một phần trong tập hợp gen đặc hiệu cho mekk1, bởi vì MEKK1 tương tác trực tiếp với WRKY53 và làm thay đổi hoạt động của nhân tố phiên mã này Sự tương tác giữa MKK1-MPK4 và MKK2-MPK4 gần đây đã được xác nhận trong cơ thể và các Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 phức hợp nằm ở màng plasma và ở trong nhân Ba protein WRKY33, WRKY25 và MKS1 đã được xác định là... và sàng lọc protein (protein microarray) đã được phát triển Trong một nghiên cứu sử dụng phương pháp này, các tác giả đã xác định được 39 protein là cơ chất của MPK6, 48 protein là cơ chất của MPK3 trong tổng số 1690 protein Mới đây bằng phương pháp lai protein với các mẫu dò là 10 MPK đã được hoạt hóa, nhóm tác giả đã xác định được 570 protein có tiềm năng là cơ chất của MPK (Caspersen et al, 2007;... không chứa DNAbinding domain mà có thể tương tác với các protein bám DNA để tạo thành các phức hợp phiên mã cũng được coi là các nhân tố phiên mã Vào năm 2000, toàn bộ trình tự hệ gen của Arabidopsis thaliana đã được xác định và người ta dự đoán rằng bộ gen này chứa 25.498 gen mã hóa cho protein Dựa vào các trình tự bảo thủ với các DNA-binding domain đã đc biết đến, Riechmann và cộng sự (2000) đã báo... chóng và mạnh mẽ của MPK3, MPK4 và MPK6 MPK4 và MPK6 cũng được hoạt hóa bởi protein harpin, protein này được mã hóa bởi gen hrp (hypersensitive response and pathogenicity) trong rất nhiều vi khuẩn gây bệnh ở thực vật Sự hoạt hóa này được theo sau bởi sự cảm ứng các gen liên quan tới tác nhân gây bệnh, mã hóa cho các protein có hoạt tính kháng khuẩn Tương tự, rất nhiều NLPs (necrosis and ethyleneinducing... quan trọng trong sự phát triển của rễ phụ Các nghiên cứu trên điều hòa gen trong đáp ứng với auxin tập trung chủ yếu vào các lớp gen được điều hòa bởi auxin và các nhân tố đáp ứng auxin (ARFs) mà có khả năng tương tác với các protein Aux/IAA Cả Aux/IAAs và ARFs đóng những vai trò quan trọng trong sự phát triển của rễ phụ MYB77 được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây là bị giảm khả năng Học viện . 3.8 Xác định điểm tương tác trên protein AtMYB77 40 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4. 1 Kết luận 44 4. 2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc. 13 1.3.1 Vai trò 13 1.3.2 Cơ chế hoạt động 13 1 .4 Các enzym nhóm MPK 14 1 .4. 1 Phân loại 14 1 .4. 2 Một số chức năng 15 1 .4. 3 MPK3 19 1 .4. 4 Các nghiên cứu xác định cơ chất cho MPK 20 Chương. nhau ở bốn cơ sở dữ liệu này. Trong lần lượt 4 hệ thống cơ sở dữ liệu trên thì có 51, 51, 64 và 67 họ (tổng số 72 họ) và 1.965, 1.837, 1.9 14 và 1. 949 vị trí (tổng số 2,620 vị trí). Những sự khác