Chúng tôi tiếp tục thực hiện nghiên cứu kiểm tra sự biểu hiện của protein AtMYB77 trong vi khuẩn E. coli. Vector pGEX mang gen AtMYB77 được biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng BL21, sản phẩm biến nạp được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa 50 µg/ml ampicillin và 34 µg/ml chloramphenycol. Quá trình kiểm tra sự có mặt của gen AtMYB77, nuôi cấy, cảm ứng và phá tế bào được thực hiện như mô tả trong phần phương pháp và tương tự như đối với protein AtMPK3. Kết quảđiện di protein tổng số của vi khuẩn được thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6 cho thấy tại thời điểm 1, 2 và 3h sau khi cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG trong protein tổng số của vi khuẩn E. coli thấy xuất hiện 02 băng đậm nét khi so sánh với protein của vi khuẩn khi chưa cảm ứng (thời điểm 0 h). So sánh với thang protein chuẩn chúng tôi nhận thấy băng bên trên đậm hơn có kích thước trên 60 kDa và băng bên dưới có kích thước khoảng trên 20 kDa. Theo tính toán trên ly thuyết protein AtMYB77 có kích thước khoảng 34 kDa, khi gắn vào vector biểu hiện nó sẽ liên kết với đuôi GST, đây là một protein có kích thước khoảng 26 kDa.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 Như vậy protein AtMYB77 tái tổ hợp khi biểu hiện sẽ có kích thước khoảng 60 kDa, tương ứng với băng bên trên trong hình điện di (Hình 3.6). Còn băng bên dưới có thể là một phần của protein tái tổ hợp AtMYB77, nó bị đứt gẫy hoặc phân cắt dưới tác động của các protease. Như vậy chúng tôi có thể kết luận rằng protein AtMYB77 biểu hiện mạnh trong vi khuẩn E. coli chủng BL21, điều kiện cảm ứng là 0,5 mM IPTG với thời gian sau 1h.
Hình 3.6. Kiểm tra sự biểu hiện protein AtMYB77 bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Giếng 1: Marker
Giếng 2: Protein tổng số của E. coli trước khi cảm ứng
Giếng 3-6: Protein tổng số của E. coli sau khi cảm ứng bằng 0.5mM IPTG
ở 300 C sau; 0.5, 1, 2 và 3h
Tiếp sau đó chúng tôi cũng tiến hành tinh sạch sơ bộ protein này thông qua cột sắc ký ái lực Glutathione Sepharose. Do AtMYB77 sẽ biểu hiện cùng với protein GST, protein sẽ gắn ái lực với Glutathione Sepharose nên chúng ta dễ dàng thu nhận được protein tái tổ hợp mong muốn.
∼60 kDa
1 2 3 4 5 6
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
