Sau khi được hoạt hóa, MPK sẽ tham gia vào phản ứng phosphoryl hóa bằng cách gắn nhóm phosphat vô cơ vào vị trí nhất định trên protein cơ chất, các vị trí này thường là Serine hoặc Threonine theo sau là Proline (S/T-P motif). Quá trình này diễn ra ở cả tế bào chất và nhân tế bào, cơ chất đích của MPK là các nhân tố
phiên mã, các protein tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã khác. MPK cũng tham gia phosphoryl hóa và hoạt hóa một số protein kinase như RSK (Ribosomal S6 kinase), MNK (MPK-interacting kinase), MPKAP (MPK-activated protein kinase) MSK (mitogen stress-activated protein kinase) (Sharrocks et al, 2000).
Đã có rất nhiều các nghiên cứu về sự hoạt hóa MPK bởi các nhân tố ngoại bào, tuy nhiên việc xác định cơ chất của chúng trong chuỗi phản ứng còn hết sức giới hạn. Để xác định được các cơ chất cũng như các protein được điều hòa bởi MPK, một số phương pháp nghiên cứu đã được sử dụng như xác định mối tương tác protein-protein, các phản ứng thử nghiệm phosphoryl hóa trong phòng thí nghiệm (in vitro) hoặc kỹ thuật sàng lọc và phân tích protein tổng số. Bằng các kỹ thuật này nhiều protein đã được xác định là cơ chất của MPK, trong số này HsfA3 là nhân tố
phiên mã đầu tiên được mô tả có tham gia vào phản ứng phosphoryl hóa của MPK ở
thực vật. Tiếp sau đó WRKY1 cũng được xác định là cơ chất của SIPK trong dịch nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Link et al, 2002; Menke et al, 2005). Thử nghiệm phosphoryl hóa trong phòng thí nghiệm là công cụ hữu hiệu để xác định cơ chất của từng MPK, tuy nhiên rất khó để sử dụng phương pháp này khi sàng lọc lượng lớn cơ chất cho tất cả MPK trong cây (ởArabidopsis là 20 MPK). Do vậy, các kỹ thuật vi phân tích và sàng lọc protein (protein microarray) đã được phát triển. Trong một nghiên cứu sử dụng phương pháp này, các tác giảđã xác định được 39 protein là cơ
chất của MPK6, 48 protein là cơ chất của MPK3 trong tổng số 1690 protein. Mới
đây bằng phương pháp lai protein với các mẫu dò là 10 MPK đã được hoạt hóa, nhóm tác giả đã xác định được 570 protein có tiềm năng là cơ chất của MPK (Caspersen et al, 2007; Feilner et al, 2005; Larsen et al, 2005; Popescu et al, 2009).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- cDNA của Arabidopsis thaliana WT (wild type) nhận từ phòng nghiên cứu hóa sinh phân tử thực vật, đại học Gyeong sang, Hàn Quốc.
- Vector tách dòng, vector biểu hiện (pTZ257R/T, pGEX5x đã cải biến), gen mã hóa MPK3 đã gắn trong vector biểu hiện pQE30 nhận từ phòng nghiên cứu hóa sinh phân tử thực vật, đại học Gyeong sang, Hàn Quốc.
- Cặp mồi sử dụng trong PCR để tách dòng và chuyển gen AtMYB77 vào vector biểu hiện:
Mồi xuôi: 5’-gagctcATGGCGGATCGTGTTAAAGGTCC
Sac I
Mồi ngược: 5'-ctgcagCTACTCAACCTTAGGTGTTATTACTCC
Pst I
- Cặp mồi sử dụng trong PCR để kiểm tra sự có mặt của gen MPK3 vào vector biểu hiện:
Mồi xuôi: 5’-GCGTCGACATGGACGGTGGTTCAGGTCA Mồi ngược: 5’-GGATCCTTGCTGATATTCTGGATTGAAAGC
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Hình 2.2. Sơđồ cấu trúc hệ thống vector biểu hiện protein pGEX
Hình 2.3. Đoạn trình tự mang các vị trí cắt cho enzym giới hạn (Multi Cloning Site -MCS) ở vector pGEX5X-1 đã được cải biến nhằm bổ sung thêm vị trí cắt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
Hình 2.4. Cấu trúc vector pQE sử dụng trong biểu hiện gen PK3
