Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định 02 protein có tương tác với nhau hay không, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp pull-down. Phương pháp này dựa trên nguyên lý; 02 protein sẽ được gắn 02 tag-fusion khác nhau, trong trường hợp chúng tương tác thì sẽ tạo ra cấu trúc gồm 02protein và 02 tag-fusion, dựa vào phản ứng western-blot sử dụng kháng thể khác 1 trong 2 tag- fusion đó, chúng ta có thể phát hiện ra protein thứ 2 và ngược lại. Sử dụng 50µg chứa His-tTMPK3 đưa vào 1ml dung dịch đệm gắn kết (binding buffer) với thành phần (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM DTT), bổ sung 10µl Ni-NTA agarose lắc nhẹ trong 2h ở 40C nhằm mục
đích cho His-AtMPK3 liên kết với Ni-NTA agarose. Sau đó ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 1 phút thu cặn, bỏ dịch. Rửa cặn 3 lần bằng đệm rửa. Hòa tan cặn trong 1ml đệm gắn kết, bổ sung 50µg protein có chứa GST-AtMYB77 (hoặc GST
để làm đối chứng), lắc nhẹ trong ở 40C qua đêm. Thu và rửa cặn 05 lần bằng đệm rửa và ly tâm. Cuối cùng bổ sung 50 µl đệm điện di protein vào phần cặn, đun sôi 5 phút, để lắng cặn. Sử dụng dịch nổi để chạy điện di protein và thực hiện western-
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 blot với kháng thể thứ nhất là kháng thể kháng GST. Nếu AtMPK3 tương tác với AtMYB77 thì sẽ xuất hiện băng tương ứng và ngược lại. Trong khi đó GST sẽ không tương tác với AtMPK3 do vậy sẽ không nhìn thấy băng trên kết quả western-blot.
