Phương pháp PCR để khuếch đại một đoạn gen được thực hiện theo nguyên lý của Kary Mullis. Thành phần phản ứng: Đệm phản ứng (10x) 5 µl dNTPs (10 mM mỗi loại) 2 µl Mồi xuôi (100 pM) 1 µl Mồi ngược (100 pM) 1 µl
Taq DNA polymerase (5u/µl) 0,5 µl DNA khuôn (cDNA hoặc plasmid) 1 µl
Nước khử ion 39,5 µl
Tổng cộng 50 µl
Tùy vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi. Khi đó thể tích của các thành phần được điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy C1000 Touch Thermal Cycler với chu trình nhiệt thích hợp.
Tiến hành nhân gen AtMYB77 từ cDNA bằng kĩ thuật PCR được thực hiện với chu trình gia nhiệt như sau:
Biến tính 94°C trong vòng 2 phút
Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 30 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính
ở 94°C trong vòng 01 phút, gắn mồi ở 62°C trong 1 phút và kéo dài ở 72°C trong 1 phút.
Các sản phẩm DNA sau khi chạy PCR hoặc cắt bằng enzym giới hạn được
điện di trên gel agarose 1% với dung dịch đệm là TAE 1X . Để chuẩn bị gel điện di, agarose được làm tan trong đệm TAE bằng lò vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 50-70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại
ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm. Dùng micropipette hút 2 µl sản phẩm sau PCR trộn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 đều với 1µl Loading Dye nhỏ vào các giếng của bản gel, một giếng nhỏ 1 µl Marker. Điện di DNA được thực hiện với hiệu điện thế 100V.
