pull-down
Từ các kết quảđã thực hiện, chúng tôi thu nhận được 02 loại protein tái tổ hợp gắn với các đuôi khác nhau là His-AtMPK3 (AtMPK3 liên kết với đuôi histidine) và GST-
MYB77 (AtMYB77 liên kết với protein GST). Hai protein này sẽ có ái lực khác nhau khi cho qua các cột sắc ký có thành phần khác nhau, dựa vào nguyên lý này chúng tôi đã tiến hành xác định mối tương tác của chúng. Nguyên liệu cho phản
ứng là các dung dịch protein tái tổ hợp thô (His-AtMPK3 và GST-AtMYB77) thu nhận sau khi siêu âm phá tế bào và ly tâm. Đầu tiên chúng tôi lấy 50µg protein tổng số có chứa His-AtMPK3 cho vào ống eppendorf, bổ sung 1ml dung dịch đệm gắn kết cùng với 10µl Ni-NTA agarose, hỗn hợp này được đảo đều ở điều kiện 40C trong vòng 2h nhằm mục đích cho protein His-AtMPK3 liên kết với Ni-NTA agarose. Sau đó ly tâm thu cặn để loại bỏ toàn bộ các protein không liên kết, rửa sạch cặn 3 lần để đảm bảo hỗn hợp thu được chỉ có Ni-NTA agarose liên kết với His-AtMPK3. Tiếp tục hòa tan cặn này trong 2 ml dung dịch gắn kết và bổ sung 50µg protein thô có chứa GST-AtMYB77, sử dụng ống khác làm đối chứng với protein bổ sung vào là GST. Các hỗn hợp này được đảo đều ởđiều kiện 40C khoảng 12h để đảm bảo các protein trong đó có thể tiếp xúc với nhau, nếu chúng tương tác chúng sẽ liên kết với nhau trong dung dịch. Hỗn hợp này cuối cùng sẽđược ly tâm, rửa sạch và thu cặn. Bổ sung 50 µl đệm điện di protein vào phần cặn, đun sôi 5 phút, để lắng. Sử dụng dịch nổi để chạy điện di protein và thực hiện western-blot với kháng thể thứ nhất là kháng thể kháng GST. Khi tiến hành điện di chúng tôi cũng bổ sung thêm 01 giếng chứa 5µg hỗn hợp protein chứa GST-AtMYB77 làm
đối chứng dương. Trong trường hợp protein nào (GST-AtMYB77 và GST) tương tác với His-AtMPK3 thì nó sẽ không bị loại bỏ trong quá trình rửa và tồn tại trong hỗn hợp cuối cùng và ngược lại. Kết quả western-blot được thể hiện trên hình 3.7.
Hình 3.7 cho thấy, trong giếng số 2 không thấy xuất hiện băng tín hiệu nào
điều đó chứng tỏ protein GST không tương tác với His-ArMPK3. Ngược lại ở trong giếng số 4, chúng ta thấy xuất hiện 01 băng, băng này có kích thước bằng với kích thước của protein GST-AtMYB77 trong giếng số 3. Như vậy trong hỗn hợp cuối
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 cùng của mẫu số 3 (giếng 4) có chứa protein GST- AtMYB77, điều này chứng tỏ
GST- AtMYB77 đã liên kết với protein His-AtMPK3. Từ đây chúng tôi kết luận rằng mối liên kết này được thực hiện giữa 02 protein His-AtMPK3 với AtMYB77 chứ không phải là giữa His-AtMPK3 với GST (vì giếng số 2 không xuất hiện băng). Thông qua kết quả này chúng tôi xác định 02 protein AtMPK3 và AtMYB77 tương tác với nhau trong điều kiện in vitro thông qua kỹ thuật pull-down.
Hình 3.7. Kết quả western-Blot sau khi thực hiện phản ứng pull-down kháng thể kháng His
Giếng 1: Marker
Giếng 2: đối chứng âm với 50µg protein GST và 50µg protein His-AtMPK3 Giếng 3: đối chứng dương với 5µg GST-AtMYB77
Giếng 4: sản phẩm sau khi thực hiện pull-down với 50µg protein GST- AtMYB77 và 50µg protein His-AtMPK3