Để kiểm tra sự biểu hiện của gen AtMPK3, chúng tôi sử dụng vector pQE-30 có chứa gen mã hóa protein AtMPK3 biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli M15. Sản phẩm biến nạp được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa 50µg/ml ampicillin. Lựa chọn vài khuẩn lạc để kiểm tra lại kết quả biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gen AtMPK3. Sau khi đã chắc chắn vector mang gen đã được biến nạp vào vi khuẩn, chúng tôi nuôi chủng này trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, lắc quan đêm ở 370C. Chuyển 200 µl dịch nuôi cấy này vào các ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường LB, nuôi lắc ở 370C sau 2-4h cho tới khi OD600đạt giá trị 0,8-1,0 thì bổ sung vào các ống này 0,5 mM IPTG
để cảm ứng biểu hiện protein. Dịch nuôi cấy sau cảm ứng được thu nhận ở các thời
điểm khác nhau được ly tâm để thu tế bào. Các tế bào này được rửa và hòa tan trong 200 µl đệm tách chiết protein và xử lý bằng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào. Thu nhận dịch tế bào bằng ly tâm và xử lý để điện di trên gen polyacrylamid, kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Kiểm tra sự biểu hiện gen AtMPK3 bằng phương pháp
điện di SDS-PAGE
Giếng 1: Marker
Giếng 2: Protein tổng số của E. coli trước khi cảm ứng
Giếng 3: Protein tổng số của E. coli sau khi cảm ứng bằng 0.5mM IPTG ở 300 C sau 3h
∼43 kDa 1 2 3
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Hình 3.5 cho thấy sau khi cảm ứng bằng IPTG ở 300C trong vòng 3h, thành phần protein của vi khuẩn xuất hiện thêm một băng mới có kích thước khoảng trên 40kDa khi so sánh với thang protein chuẩn và mẫu protein của vi khuẩn khi chưa cảm ứng. Điều này cho thấy protein tái tổ hợp AtMPK3 đã được biểu hiện thành công trong vi khuẩn E. coli. Quá trình thực hiện cũng như kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã công bố (Nguyen et al, 2012).
Chúng tôi tiếp tục tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp AtMPK3 bằng cột sắc ký ái lực NiTA. Do protein AtMPK3 được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pQE-30 nên protein tạo ra sẽđược dung hợp với 1 trình tự gồm 6 amino axit histidine. Trình tự
His-tag này sẽ giúp protein tái tổ hợp kết bám vào cột sắc ký ái lực NiNTA, trong khi các protein khác sẽ bị loại bỏ bằng dung dịch rửa chứa Imidazol 30 mM. Sau khi đã rửa sạch các protein tạo liên kết không đặc hiệu với cột sắc ký, protein AtMPK3 được đẩy phân đoạn bằng dung dịch đệm chứa Imidazol 250 mM. Dung dịch sau khi qua cột
được thu nhận và bảo quản ở -200C để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.