Để xác định rõ hơn về cơ chế tương tác giữa 02 protein này chúng tôi tiến hành xác định điểm tương tác trên protein AtMYB77. Nhưđã giới thiệu AtMPK3 là một loại protein kinase còn AtMYB77 là một nhân tố phiên mã. Chính vì thế mối tương tác giữa 02 protein này sẽ dẫn đến việc thực hiện phản ứng phosphoryl hóa trên phân tử AtMYB77. Căn cứ vào giả thiết này chúng tôi xác định điểm tương tác thông qua điểm phosphoryl hóa của AtMYB77. Phân tích đặc điểm cấu trúc của
∼103 kDa 1 2 3 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 protein AtMYB77 chúng tôi xác định đây là một nhân tố phiên mã thuộc nhóm R1R2-MYB, protein này có chứa 02 đoạn trình tự lặp lại không hoàn toàn R1 và R2 (Hình 3.8), đây là khu vực sẽ liên kết với DNA trong quá trình điều hòa phiên mã.
Điều đặc biệt là trong phân tử protein này có chứa 07 điểm phosphoryl hóa giảđịnh cho protein MAP kinase, đó là các axit amin serine (S) hoặc treonine (T) theo sau
đó là prolin (P), các vị trí này được đánh dấu trong hình 3.8.
Hình 3.8. Đặc điểm cấu trúc của protein AtMYB77
Để xác định điểm tương tác (điểm phosphoryl hóa), chúng tôi tiến hành phân tích khối phổ, dựa trên nguyên lý điểm nào xảy ra quá trình phosphoryl hóa điểm đó sẽ được bổ sung thêm 01 gốc phosphate do vậy khối lượng của chúng sẽ tăng lên. Trước khi phân tích khối phổ, chúng tôi thực hiện phản ứng phosphoryl hóa trong
điều kiện in vitro với nguồn nguyên liệu là hai protein được tinh sạch sơ bộ
AtMYB77 và AtMPK3. Trộn đều 5µg protein AtMPK3 và 20µg protein AtMYB77 trong đệm phản ứng có bổ sung ATP, thực hiện phản ứng ở 300C trong vòng 1h sau
đó dừng phản ứng bằng cách bổ sung 5µl đệm điện di protein và ủ ở 650Ctrong 15 phút. Các mẫu này sau đó được điện di trên gel polyacrylamide (hình 3.9).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
Hình 3.9. Kiểm tra sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng phosphoryl hóa bằng điện di SDS-PAGE
Giếng 1: Marker
Giếng 2: Protein AtMPK3
Giếng 3-6: Hỗn hợp protein AtMPK3 và AtMYB77 khi không có mặt ATP Giếng 7-10: Hỗn hợp protein AtMPK3 và AtMYB77 khi có mặt ATP
Bản điện di này sau đó được gửi đi phân tích khối phổ MALDI-TOF, kết quả
có bốn đoạn peptide được xác định có thay đổi khối lượng sau phản ứng phosphoryl hóa (Hình 3.10).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Hình 3.10. Khối phổ của các polipeptid từ AtMYB77 được cắt bởi enzym chymotrypsin sau khi làm giàu bằng cách cho qua cột Ti2O
(A) Peptide có trình tự S62PEEDETIVTARAQF (B) Peptide có trình tự RDCGVIT297PKVE
(C) Peptide có trình tự MS148PES151PNGIDVSDSSTIPS165PSS168PVAQL (D) Peptide có trình tự SAFAPVDTGLYMS148PES151PNGIDVSD
Bốn đoạn peptide được xác định có thay đổi khối lượng khi so sánh trọng lượng phân tử trước và sau khi xảy ra phản ứng phosphoryl hóa có chứa một số điểm có thể gắn gốc phosphate (các vị trí serine và treonine), tuy nhiên chỉ có 6 vị
trí là điểm phosphoryl hóa giảđịnh cho MAP kinase (S/TP). Các vị trí này lần lượt là serine ở các vị trí 62, 148, 151, 165, 168 và treonine ở vị trí 297. Từ kết quả này chúng tôi kết luận ràng 02 potein AtMYB77 và AtMPK3 tương tác với nhau trong
điều kiện in vitro, chúng tương tác với nhau tại 06 vị trí nằm trên phân tử protein AtMYB77.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
- Đã tách dòng thành công gen mã hóa protein AtMYB77 từ cây Arabidopsis. - Đã chuyển thành công gen mã hóa protein AtMYB77 sang vector biểu hiện protein pGEX.
- Đã biểu hiện thành công 02 protein tái tổ hợp là His-AtMPK3 và GST- AtMYB77 trong vi khuẩn E. coli.
- Đã xác định được 02 protein AtMPK3 và AtMYB77 tương tác với nhau trong điều kiện in vitro.
- Đã xác định được 06 điểm tương tác cho AtMPK3 nằm trên protein AtMYB77 là các vị trí serine 62, 148, 151, 165, 168 và treonine 297.
4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục xác định mối tương tác của 02 protein AtMPK3 và AtMYB77 trong
điều kiện in vivo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Andreasson E, Jenkins T, Brodersen P, Thorgrimsen S, Petersen NH, Zhu S, Qiu JL, Micheelsen P, Rocher A, Petersen M, Newman MA, Bjorn Nielsen H, Hirt H, Micheelsen P, Rocher A, Petersen M, Newman MA, Bjorn Nielsen H, Hirt H, Somssich I, Mattsson O, Mundy J (2005) The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses. EMBO J 24: 2579-2589