Sau khi xác định gen AtMYB77 đã được ghép nối vào vector pGEX, gen MPK đã nằm trong vector pQE, biến nạp chúng vào hai chủng E. coli tương ứng là BL21 và M15. Nuôi vi khuẩn trên đĩa môi trường thạch LB có chứa kháng sinh Ampicillin (với chủng M15) hoặc Ampicillin/ Chloramphenycol (với chủng BL21). Lấy một khuẩn lạc đơn cấy sang 5ml môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh, nuôi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 lắc ở 370C qua đêm. Hút 200µl dịch nuôi cấy này chuyển sang các ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng không chứa kháng sinh, nuôi lắc ở 300C, sau 3-4h kiểm tra mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm. Khi giá trị OD đạt giá trị 0,8-1,0 thì bổ sung vào mỗi ống nghiệm 0,5mM IPTG để cảm ứng sự biểu hiện protein. Sau mỗi khoảng thời gian cảm ứng (0h; 0,5h, 1h, 2h, 3h, 4h) lấy ra một ống nghiệm, hút 1,5ml dịch nuôi cấy cho vào ống eppendorf bảo quản ở 40C trong đá. Các mẫu thu nhận được đem ly tâm ở 12000 vòng/ phút trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi và thu cặn. Hòa tan cặn trong 200µl đệm tách chiết protein (50 mM HEPES, pH 7.5, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 25 mM NaF, 50 mM glycerophosphate, 2 mM DTT, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5% glycerol, 1% Triton X-100, protease inhibitor). Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, ly tâm lạnh
ở 12000 vòng/ phút trong 5 phút, bỏ cặn thu dịch nổi. Dịch nổi là dung dịch gồm hồn hợp các loại protein khác nhau, kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ. Sử
dụng 30µg protein tổng số này để thực hiện quá trình điện di biến tính protein (SDS-PAGE). Quá trình điện di được thực hiện với cường độ dòng điện là 80mA trong khoảng 1h, cho đến khi vạch màu chạy xuống đáy bản gel. Nhuộm gel bằng dung dịch Coomassie brilliant blue R-250. Xác định protein tái tổ hợp biểu hiện thông qua protein marker và so sánh các băng protein biểu hiện trước và sau khi cảm ứng bằng IPTG (Nguyen et al, 2012).