Sau khi xác định gen mã hóa protein AtMYB77 có thể nhân trong điều kiện các nguồn nguyên vật liệu đã có, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách dòng gen này. Vector tách dòng được sử dụng là vector pT257R/T. Sản phẩm PCR được trộn đều với vector tách dòng trong dung dịch đệm gắn kết, sau đó bổ sung thêm enzym gắn ligase để cho tổng thế tích ống phản ứng là 15 µl. Sau 12h phản ứng ở điều kiện 160C, sản phẩm được biến nạp vào vi khuẩn E. coli XL1 Blue bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn sau khi biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có bổ sung
chất chỉ thị Xgal và IPTG để chọn ra các chủng mang vector có chứa gen AtMYB77. Thu nhận một số khuẩn lạc màu trắng trong rên môi trường chọn lọc, nuôi riêng lẻ các chủng này trong ống nghiệm có chứa môi trường LB và chất kháng sinh, nuôi lắc ở 370C trong khoảng 12h. Sau khi nuôi cấy hút 1µl dịch nuôi cấy chuyển sang ống PCR, bổ sung các thành phần phản ứng PCR sao cho tổng thể
tích là 20 µl, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiện cho AtMYB77. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gen agrose 1%, kết quả thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2 cho thấy gen AtMYB77 đã được khuếch đại từ 06 trong số 07 khuẩn lạc đã chọn lọc, như vậy 06 chủng vi khuẩn này mang gen AtMYB77 đã được ghép nối vào vector tách dòng. Phần dịch nuôi cấy còn lại của 06 chủng này được thu nhận để thực hiện quá trình tách plasmid. Việc tách chiết được thực hiện nhờ bộ kit GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit của hãng Fermentas, các mẫu plasmid sau khi tinh sạch được gửi đi đọc trình tự gen tại phòng thí nghiệm của công ty 1stBASE. Sau khi đọc trình tự giữ lại các mẫu có trình tự gen AtMYB77 giống hoàn toàn với trình tự đã công bố. Kết quả là chúng tôi đã tách dòng thành công gen mã hóa protein AtMYB77 trong vector tách dòng, sản phẩm thu nhận được cuối cùng là plasmid có chứa gen AtMYB77.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Hình 3.2. Kiểm tra sự có mặt của gen AtMYB77 trong vector tách dòng bằng phương pháp PCR khuẩn lạc
Giếng 1: Marker
Giếng 2-8: Sản phẩm PCR với các khuẩn lạc khác nhau