Bước tiếp theo của nghiên cứu là phải chuyển được gen mã hóa AtMYB77 sang vector biểu hiện. Dựa vào nguồn vật liệu có sẵn cũng như phát triển các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi mong muốn chuyển được gen AtMYB77 sang vector biểu hiện pGEX-5X. Tuy nhiên tất cả các điểm nhận biết cho enzym giới hạn trên vector này đều không phù hợp vì thế chúng tôi đã thực hiện việc ghép nối bổ sung thêm trình tự nhận biết vào vector này, thông tin về hệ vector và trình tự nhận biết bổ
sung được mô tả trong hình 2.2 và 2.3. Chúng tôi sử dụng 02 enzym cắt giới hạn là
Sac I và Pst I để cắt gen AtMYB77 ra khỏi vector tách dòng, đồng thời vector biểu hiện pGEX cũng được mở vòng bằng 02 enzym này. Quá trình cắt được tiến hành ở
370C trong 3h. Các sản phẩm cắt được điện di trên gen agrose 1%, băng chứa sản phẩm mong muốn bao gồm gen AtMYB77 và vector pGEX đã mở vòng được cắt rời khỏi bản gel và tiến hành tinh sạch. Các sản phẩm sau khi tinh sạch được kiểm tra lại trên gel agrose 1% nếu đảm bảo yêu cầu sẽđược sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối gen AtMYB77 vào
∼900 bp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 vector pGEX đã mở vòng với sự xúc tác của enzym ligase. Nguyên lý của việc ghép nối này là 02 đầu của gen cũng như vector đều chứa điểm nhận biết enzym giới hạn tương đồng nhau (Sac I và Pst I) do vậy chúng dễ dàng gắn kết với nhau theo đúng chiều đã xác định. Sản phẩm của phản ứng sau đó được biến nạp vào vi khuẩn E. coli XL1 Blue, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bố sung ampicillin. Sau 12h nuôi cấy, lựa chọn một số khuẩn lạc để tiến hành tách plasmid. Kiểm tra sự có mặt của gen AtMYB77 trong các mẫu plasmid thu nhận được bằng việc xử lý với 02 enzym giới hạn Sac I và Pst I, kết quả thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sản phẩm cắt plasmid pGEX-5X sau khi chuyển gen AtMYB77 bằng enzym giới hạn Sac I và Pst I
Giếng 1: Marker
Giếng 2-4: Sản phẩm cắt với các mẫu plasmid khác nhau
Chúng tôi đã lựa chọn 03 khuẩn lạc để tách plasmid và kiểm tra sự có mặt của AtMYB77. Hình 3.3 cho thấy cả 03 mẫu plasmid sau khi xử lý bằng Sac I và Pst I
đều cho ra 02 băng tương ứng với kích thước của gen AtMYB77 và của vector pGEX. Kết quả này cho thấy gen mã hóa AtMYB77 đã được chuyển thành công vào vector biểu hiện pGEX.
