Định tính và định lượng đồng thời paracetamol và acid mefenamic trong viên nén bao phim pamesic bằng phương pháp HPLC

Chuẩn độ H2S04 dư bằng NaOH 0,1N.- Phương pháp HPLC [9, 10, 11, 17] Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của paracetamol giữa pha tĩnh và pha động, paracetamol sau khi đi qua cột tá

Bộ Y Tê TRƯỜNG ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI

m

BÙI THU HUÊ

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL VÀ ACID MEFENAMIC TRONG VIÊN

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2Í

Ặ /ị.itS Ị r ù ỉh ,

Người hướng dẫn: TS Thái Phan Quỳnh

TS Thái Duy Thìn Nơi thực hiện: - Phòng Hoá Lý 1- Viện Kiểm nghiệm

- Bộ môn Hoá dược- Trường Đại học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: Tháng 10/2003 - 5/2004

Hà Nội - 5/2004

&

'ÍX.LC » 3 /

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý 1 - Viện kiểm nghiệm và bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược Hà Nội trong thời gian từ tháng 10/2003 đến tháng 5/2004 Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các thầy cô trong bộ môn Hoá dược và các cán bộ của phòng Hoá lý 1 - Viện kiểm nghiệm

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đối với:

- TS Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý 1-Viện kiểm

nghiệm)

- TS Thái Duy Thìn (Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược-Trường đại

học Dược Hà Nội)

đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá dược

và các cán bộ kỹ thuật của phòng Hoá lý 1 - VKN đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn thư viện trường đại học Dược Hà Nội đã cung cấp những tài liệu có liên quan

Hà nội, tháng 5/2004 Sinh viên Bùi Thu Huê

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đ ề 1

Phần 1 Tổng quan 3

1.1 Paracetamol .3

1.2 Acid meíenamic 5

1.3 Kỹ thuật HPLC 6

1.3.1 Khái niệm cơ b ả n 6

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng 8

1.3.3 Hệ thống HPLC 11

1.3.4 Pha tĩnh 12

1.3.5 Pha động 13

1.3.6 Cách đánh giá pic 14

1.3.7 Cách tính kết quả 14

Phần 2 Thực nghiệm và kết qu ả 16

2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 16

2.1.1 Hoá chất - Thiết b ị 16

2.1.2 Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu 17

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 19

2.2.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc k ý 19

2.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 22

2.2.3 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 24

2.2.4 Khảo sát độ chính xác của phương pháp 28

2.2.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp 31

2.2.6 ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định tính và định

lượng đồng thời paracetamol và acid meíenamic trong hai mẫu

(mẫu 3 và mẫu 4) viên nén bao phim Pamesic 34

2.3 Bàn lu ận 37

Phần 3 Kết luận và đề xu ất 39

1.Kết luận 39

2 Đề x u ất 40

Tài liệu tham khảo 41

CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỂ

Ngày nay nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ ngày một tăng, cùng với

sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực dược, các nhà công nghiệp dược đang hướng tới mục tiêu nâng cao hiệu quả điều trị và giảm bớt tác dụng không mong muốn của dược phẩm Từ đó nhiều dược chất khác nhau được phối hợp trong một dạng bào chế Nhóm thuốc chống viêm - hạnhiệt - giảm đau dạng phối hợp đang được sản xuất, lưu hành và sử dụng ngàymột rộng rãi, với rất nhiều biệt dược khác nhau, trong đó phần lớn gồm paracetamol phối hợp với một hoặc nhiều dược chất khác như: clorpheniramin maleat, phenylpropanolamin hydroclorid, dextromethorphan hydrobromid, quinin sulíat, cafẹin, codein Gần đây một sự kết hợp mới nhằm làm tăng tác dụng giảm đau và bổ sung tác dụng chống viêm cho chế phẩm đã được sản

V/

xuất với công thức:

Paracetamol : 500 mgAcid meíenamic : 250 mgBiệt dược thuốc trong nước đầu tiên là viên nén bao phim Pamesic của công

ty dược và vật tư y tế Tiền Giang

Trong các dược điển [1, 12, 15, 16, 17] chưa có chuyên luận cho dạng thuốc có chứa hai thành phần này Do độ tan của hai chất tương tự nhau :đều

có tính acid nên dễ tan trong kiềm, khó tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, ether, tan được trong ethanol; vì vậy rất khó chiết tách để định lượng riêng biệt bằng đo quang hay chuẩn độ acid-kiềm, n itrit Việc quản lý, kiểm tra chất lượng thuốc là một đòi hỏi tất yếu cho việc đảm bảo chất lượng thuốc cũng như đảm bảo hiệu quả điều trị Vì vậy phải có một phương pháp kiểm nghiệm nhanh chóng, chính xác và thuận tiện, phù hợp với điều kiện trang thiết bị hiện nay của đa số các phòng và trung tâm kiểm nghiệm

Trước yêu cầu đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định tính và định lượng đồng thời paracetamol và acid mefenamic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” với mục tiêu :

- Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời paracetamol và aeid meíenamic

- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn viên nén bao phim Pamesic cho cơ sở sản xuất

Tên khoa học : N - acetyl- para- amino phenol

hoặc: para- hydroxy - acetanilidTên khác : Acetaminophen

- Có khả năng hấp thụ quang, cực đại hấp thụ trong dung môi methanol là 245 nm, trong môi trường kiềm là 257 nm

■ Tác dụng dược lý : Paracetamol ức chế enzym tổng hợp prostaglandin, nên làm giảm nhạy cảm với các chất trung gian gây đau, có tác dụng giảm đau Giảm tổng hợp PGEị, PGE2 làm tăng thải nhiệt và giảm sản nhiệt, nên có tác dụng hạ sốt Paracetamol không có tác dụng chống viêm và chống ngưng kết tiểu cầu

- Chỉ định : Hạ sốt do mọi nguyên nhân gây sốt (sốt do virus, sốt xuất huyết )• Giảm đau, sử dụng cho đau nhẹ, đau ngoại vi

- Thận trọng : Quá liều paracetamol gây hoại tử tế bào gan Không uống rượu và các thuốc gây độc cho gan trong thời gian dùng thuốc

- Liều dùng : Người lớn : 300 đến 500 mg/lần X 3 - 4 lần/ngày.

Tối đa : không quá 4 g /ngày Trẻ em : 60 - 325 mg/lần x3 - 4 lần/ngày

■ Các dạng bào c h ế : Viên nén, viên nén phân tán, viên nén hoà tan, viên nang, viên đạn, dung dịch uống, hỗn dịch uống, các dạng bào chế phối hợp

Các phương ph áp đ ã được áp dụng đ ể định lượng paracetam ol

- Phương pháp đo quang [1, 12, 15, 16, 17]

Nguyên tắc : Paracetamol có khả năng hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ của paracetamol trong dung môi methanol là 245 nm, trong môi trường kiềm là 257 nm Kết quả được tính toán dựa vào giá trị mật độ quang đo được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chuẩn

- Phương pháp chuẩn đô nitrit [8]

Nguyên tắc : Thuỷ phân paracetamol trong môi trường acid (HC1 10%)

và nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một Chuẩn độ bằng dung dịch natri nitrit (NaN02) trong môi trường acid tạo hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá), nhận biết điểm kết thúc bằng chỉ thị tropeolin hoặc điện thế kế

- Phương pháp chuẩn đỏ bàng ceri IV n , 12]

Nguyên tắc : Trong dung dịch acid, paracetamol sau khi thuỷ phân là một chất khử, ceri IV là một chất oxy hoá sẽ bị khử (nhận thêm 1 electron) chuyển thành ceri III, phát hiện điểm kết thúc bằng íerroin (phức chất sắt của o-phenatrolin) sắt ở trong phức này có thể là sắt II hoặc sắt III, phức chất sắt II có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh Tại điểm tương đương khi bắt đầu thừa ceri IV, phức chất sắt II chuyển thành sắt III, làm dung dịch đổi màu từ đỏ sang xanh

- Phương pháo Kieldahl [8]

Nguyên tắc : Phân huỷ các hợp chất chứa nitơ bằng cách đun với H2S04(đặc) với sự có mặt của kali hay natri sulphat Khi đó nitơ bị vô cơ hoá kết hợp với H2S04 thành (NH4)2S04 Thêm NaOH vào hỗn hợp phản ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng vào dung dịch chuẩn H2S04 0,1N dư Chuẩn độ H2S04 dư bằng NaOH 0,1N.

- Phương pháp HPLC [9, 10, 11, 17]

Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của paracetamol giữa pha tĩnh

và pha động, paracetamol sau khi đi qua cột tách sẽ được chuyển đến detector

và cho tín hiệu định lượng là diện tích hoặc chiều cao pic

1.2 ACID MEFENAMIC [4, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17]

■ Công thức cấu tạo :

C15H 15N 0 2 (M = 241,29)Tên khoa học : Acid 2 [ ( 2,3 - dimethyl phenyl) amino ]benzoic

Hoặc: Acid N - (2,3 - xylyl) anthranilic

■ Tính c h ấ t:

- Bột kết tinh trắng đến trắng ngà, không mùi, để lại vị đắng nhẹ

- Nhiệt độ nóng chảy : 230 - 231°c

- Độ tan : Rất khó tan trong nước, ít tan trong cloroíorm (1/25),

ít tan trong ether (1/80) Tan hoàn toàn trong dung dịch kiềm

- Có khả năng hấp thụ quang, cực đại hấp thụ ở môi trường acid

là 279 nm, ở môi trường kiềm là 285 nm

■ Tác dụng dược lý : Tác dụng giảm đau , hạ sốt tương tự paracetamol.Ngoài ra giống các NSAID khác, acid meíenamic còn có tác dụng

chống viêm tốt do nó ức chế enym c o x

- Chỉ định : Chống viêm, giảm đau trong các bệnh về xương khớp , đau sau phẫu thuật, chấn thương, các chứng đau nửa đầu, đau răng, đau lưng, đau khi thấy kinh .

- Chú ý khi sử dụng : Acid meíenamic có tác dụng phụ gây loét đường tiêu hoá và kéo dài thời gian chảy máu

- Liều dùng: Người lớn: 250 - 500 m g/lầnx2- 3 lần/ngày, uống sau khi ăn no, tối đa không quá 1,5 g/ngày Hoặc đặt một viên đạn (250mg) vào buổi tối

Trẻ em trên 6 tháng tu ổ i: 6,5 mg/kg/ngày, chia 3 lần

■ Các dạng bào c h ế : Viên nang , viên nén, viên đạn

Các phương ph áp đ ã được áp dụng đ ể định lượng acid mefenamic:

- Phương pháp acid - base r 12, 16]

Nguyên tắc : Acid meíenamic được hoà tan trong dung môi ethanol (ethanol trước đó đã được trung tính hoá), sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1M với chỉ thị phenolphtalein

- Phương pháp HPLC [17]

Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của acid meíenamic giữa pha tĩnh và pha động, acid meíenamic sau khi đi qua cột tách sẽ được chuyển đến detector và cho tín hiệu định lượng là diện tích hoặc chiều cao pic

1.3 KỸ THUẬT HPLC [2, 6, 7,13,17]

1.3.1 Khái niệm cơ bản

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hoá lý dựa vào

ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn

đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các

nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.

• Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc kýphân bố hay sắc ký chiết, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký râyphân tử Cùng với pha tĩnh, để rửa giải chất tan ra khỏi cột cần phải có một pha động Như vậy nếu ta nạp một mẫu phân tích gồm hỗn hợp các chất A,B,C vào cột tách, sau khi bơm dung môi pha động qua cột, các quá trình sắc

ký sẽ xảy ra Kết quả là các chất sẽ được tách khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tương tác:

- Giữa chất tan với pha tĩnh

- Giữa chất tan với pha động

- Giữa pha tĩnh với pha động

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại Các tương tác được mô tả như sau :

Sự lưu giữ của mỗi chất được quy định bởi 3 lực thành phần Fj, F2, F3, trong

đó Fị, F2 là quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn F| là lực giữ chất phân tích trên cột, còn F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột Fj, F2 khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất sắc ký của pha tĩnh, bản chất và tính chất của chất phân tích, bản chất, thành phần và tốc độ dòng pha động Kết quả là lực lưu giữ của

chúng khác nhau, các chất đựơc tách khỏi nhau sau khi đi qua cột, được phát hiện bằng detector và chuyển qua bộ phận xử lý kết quả.

Tín hiệu phân tích định tính của mỗi chất là thời gian lưu của chất đó hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, tín hiệu phân tích định lượng là diện tích hoặc chiều cao pic thu được, phụ thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng.

• Thời gian lun và thể tích lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ

ềigrưd

Hình 1: sắc ký đồ của hai chất và cấc thông sô đặc trưng.

Nếu gọi tR là thời gian lưu giữ của một chất

T h ì: t R = tR —10

Trong đó: t ’R là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

t0 là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn , thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó VI vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất.

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu

• Hê số phân bố

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức :

Trong đó cs, CM là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở

thời điểm cân bằng

• Thừa số dung lương

Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

• Hê số chon loc

Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k ’ khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.

_ K-g _ & g _ tjịg — Í q _ f

^ ,4 k A ^ RA ^ o t 114

ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy a luôn lớn hơn

1, a càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ Thường phân tích trong điều kiện a trong khoảng 1,5 đến 2.

• Số đĩa lý thuyết và chiểu cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc kỷ được coi như có N tầng lý thuyết,

ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lýthuyết được định nghĩa như là một khu vực của hệ thống phân tách mà trong

đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức :

2

hoặc 5,54 X ì

Trong đó w : Là chiều rộng pic ở đáy pic

Wì/2 : Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức :

n - ế

N

Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích

• Đố phân giải (Rq)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính theo 1 trong 3 công thức sau:

ằ-r'"* M c ‘i 8 4 " , : ' " 1 hoặc

• Phương trình Van-Deemter

Phương trình Van-Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ động dòng pha động

và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc ký

/ / = A 4 b c xu

u

Trong đó H : Chiều cao đĩa lý thuyết

u : Tốc độ dòng pha động A,B,C : Các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký

Trong đó: - A : Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy (eddy diffusion)

- B/u : Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc của các phân tử chất tan theo phương dòng chảy của pha động (longitadinal diffussion)

- c : Mô tả ảnh hưởng của sự chuyển khối (mass transíer)

• Hê số đối xứng (T)

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:

T = Z 2A

-Trong đó Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic

1.3.3 Hệ thống HPLC

Theo thứ tự từ đầu đến cuối của hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau :

• Bình chứa dung môi

• Bơm cao áp : đẩy pha động qua cột sắc ký

• Bộ phận tiêm mẫu : tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

kỹ thuật HPLC

- Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC)

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion

- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)

• Điều kiện đối với một pha tĩnh

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

• Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả

sự tách sắc ký Pha động có thể ảnh hưởng đến :

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu giữ của chất tan

- Hiệu lực của cột tách

- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký

• Điều kiện đối với một pha động

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Hoà tan được chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế và không quá hiếm

• Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:

- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động

• Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá sắc phổ Phương pháp này chỉ áp dụng khi các chỉ số k ’ là hằng định

Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao pic

sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic

1.3.7 Cách tính kết quả

• Phương pháp ngoai chuán : Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn

• Phương pháp nôi chuán : Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử Nó được tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tương tự

• Phương pháp thêm chuẩn : Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ : tá dược) Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích hoặc chiều cao pic.

• Phương pháp tính theo phán trăm diên tích pic : Nồng độ của mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích pic chất thử trên tổng diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nếu không như nhau khi đó với mỗi chất cần có hệ số hiệu chỉnh

Phần 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Hoá chất - Thiết bị

- Chuẩn paracetamol (chuẩn của Viện kiểm nghiệm, hàm lượng 100%)

- Chuẩn acid meíenamic (chuẩn của Viện kiểm nghiệm, hàm lượng 99,68%, độ ẩm 0,02%)

- Acetonitril loại dùng cho HPLC

- Tetrahydroíuran loại dùng cho HPLC

- Acid phosphoric loại tinh khiết phân tích

và các dụng cụ thuỷ tinh khác

2.1.2 Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu

Viên nén bao phim Pamesic do Công ty Dược và Vật tư y tế Tiền Giang sản xuất có công thức :

( Tá dược : Tinh bột mì, HPMC, titan dioxyd, vàng tatrazin, sunset yellow, tal, magie stearat, cồn 95°)

• Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời

paracetamol và acid meíenamic trong hỗn hợp thuốc đa thành phần Để xây dựng chương trình sắc ký thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn :Kiểu sắc ký áp dụng

Cột tách sử dụng

Các điều kiện về pha động (thành phần, tỷ lệ, và tốc độ dòng) để cho kết quả tách tốt nhất

Bước sóng thích hợp phát hiện hai chất

• Để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng được chúng tôi tiến hành:Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất

Khảo sát độ chính xác của phương pháp (tiến hành trên mẫu 1 và mẫu 2)

Paracetamol : 500 mgAcid meíenamic : 250 mg

Tá dược vừa đủ 1 viên

Mẫu 1 có số kiểm so á t: SKS 011102 Mẫu 2 có số kiểm so á t: SKS 021202 Mẫu 3 có số kiểm so á t: SKS 050404 Mẫu 4 có số kiểm so á t: SKS 070404

Khảo sát độ đúng bằng hai phương pháp : Phương pháp thêm chuẩn (tiến hành trên mẫu 1) và phương pháp mẫu tự tạo.

ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng, định tính và định lượng đổng thời paracetamol và acid meíenamic trên mẫu 3 và mẫu 4 của viên nén Pamesic bằng phương pháp ngoại chuẩn

Phương pháp nghiên cứu sử dụng trong khoá luận là phương pháp HPLC Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách hai chất được tốt nhất, sau đó thông qua việc xử lý thống kê các kết quả khảo sát để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng

Các số liệu thực nghiệm thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê thông qua các đặc trưng sau :

- Sai số tương đối £% = -

JL-Trong đó : X; là kết quả của lần xác định thứ i

n là số lần xác định

s x X ta X 1 0 0