xác định mức độ ảnh hưởng của thuốc trừ sâu fenobucarb đối với tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MINH MẪN XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MINH MẪN XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2013 XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Lê Minh Mẫn Đặng Thị Hoàng Oanh* Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ * Email: dthoanh@ctu.edu.vn ABSTRACT This study was conducted to determine the impact of substance Fenobucarb through LC50 values and chronic toxicity effects on tissue structure for white shrimp (Litopenaeus vannamei) in P12 phase and 70 day-old shrimp. The results obtained when surveying preliminary experiments lethal concentration of 50% over the last 96 hours of Fenobucarb with concentration to shows mortality appear in formula at concentration of 0.00016 and the death rate the same in formula and 4. However formula mortality rate of 94.54% and the dead in formula 6. With the preliminary results, we conducted a selection experiment concentration range for ranged assert 0.016 to 0,16. In experiments confirmed that the concentration range over processed data showing the concentration of active ingredients Fenobucarb is 0.0526 mg / l to 50% of the shrimp lethality experiments. However, in chronic experiments periodically sampled shrimp 10 day / time to assess the impact structure model shows active Fenobucarb Carbamate group at all formulation treatments are not affecting shrimp during when experiments were analyzed by histological methods. Keywords: Litopenaeus vannamei, Fenobucarb, Histopathological. Title: Indentify the influence of Fenobucarb pesticide on vannamei. TÓM TẮT Đề tài thực nhằm xác định mức độ ảnh hưởng hoạt chất Fenobucarb thông qua trị số LC50 độ độc mãn tính ảnh hưởng lên cấu trúc mô tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giai đoạn P12 mãn tính tới tôm 70 ngày tuổi. Kết thu khảo sát thí nghiệm sơ nồng độ gây chết 50% qua 96h hóa chất Fenobucarb qua nồng độ cho thấy tôm chết xuất công thức với nồng độ 0,00016 có tỉ lệ chết công thức 4. Tuy nhiên công thức tôm chết với tỉ lệ 94,54% chết hết công thức 6. Với kết sợ bộ, tiến hành lựa chọn khoảng nồng độ cho thí nghiệm khẳng định dao động khoảng 0,016 – 0,16. Ở thí nghiệm khẳng định, với dãy nồng độ qua xử lí số liệu cho thấy với nồng độ hoạt chất Fenobucarb 0,0526 mg/l gây chết 50% số tôm thí nghiệm. Còn thí nghiệm mãn tính định kì thu mẫu tôm 10 ngày/lần đánh giá ảnh hưởng cấu trúc mô cho thấy hoạt chất Fenobucarb thuộc nhóm Carbamate tất nghiệm thức có công thức thuốc ảnh hưởng không đáng kể đến tôm suốt trình thí nghiệm phân tích phương pháp mô học. Từ khóa: Tôm thẻ chân trắng, Litopenaeus vannamei, Fenobucarb, mô bệnh học. I. GIỚI THIỆU Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei, 1931) có nguồn gốc từ nước ven bờ Tây Thái Bình Dương, Nam Trung Mỹ. Trên giới tôm thẻ chân trắng nuôi nhiều nước Nam Mỹ, Nam Trung Mỹ. Ở Châu Á tôm chân trắng phân bố tự nhiên, song từ thập niên 80, 90 đối tượng du nhập nuôi thực nghiệm thành công đến nhiều nước Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan Việt Nam phát triển mạnh loại tôm này. Đến nay, có nhiều quan điểm khác việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sản xuất nông nghiệp. Thuốc bảo vệ thực vật người nuôi dùng để diệt giáp xác tồn dư từ vùng sản xuất nông nghiệp theo nguồn nước vào vuông tôm tử tôm. Hóa chất sử dụng sản xuất nông nghiệp nuôi trồng thủy sản không cách tồn lưu môi trường, đặt biệt nguồn nước làm đe dọa đến bền vững an toàn ngành nuôi trồng thủy sản nói chung nghề nuôi tôm nói riêng. Fenobucarb hoạt chất thuốc trừ sâu nhóm Carbamate sử dụng rộng rãi cho ruộng lúa. Hoạt chất Fenobucarb có nhiều sản phẩm thương mại khác nhau. Mức độ gây độc cảu hoạt chất lên đối tượng thủy sản, đặt biệt tôm sú thẻ chân trắng nhiều vấn đề nghiên cứu. Vì đề tài “Xác định mức độ ảnh hưởng thuốc trừ sâu Fenobucarb tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)” thực hiện. II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các dụng cụ thí nghiệm: bể composite, đá bọt, sục khí, keo nhựa, ống đong v.v…Tôm thí nghiệm tôm thẻ chân trắng giai đoạn tôm post (Post larvae) P12. Hóa chất Fenobucarb dạng kỹ thuật (Technical grade) pha chế dung dịch chuẩn sau pha nồng độ thuốc cần thí nghiệm. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tôm điều kiện thí nghiệm Tôm chuyển đưa vào sốc Formalyne nồng độ 100ppm 30 phút để loại tôm yếu (khoảng 25 – 30% tôm yếu bị loại), sau bể 0,5m3 – ngày. Sau chuyển sang bể khác pha loãng với nước 1:3 (đối với nước ót có độ mặn 60‰) để đạt độ mặn 20‰ (đo khúc xạ kế). Nhiệt độ biến đổi theo nhiệt độ phòng. Đối với thí nghiệm sơ khẳng định tiến hành theo phương pháp nước tĩnh (APHA, 2001) chấp nhận nồng độ hóa chất tồn thực tế khoảng thời gian thí nghiệm 96h mà không cần kiểm tra hay bổ sung thêm hóa chất trình thí nghiệm. 2.2.2 Phương pháp xử lí hóa chất Hóa chất Fenobucarb sử dụng dạng thuốc kỹ thuật có độ tinh khiết tối thiểu 90% để giảm thiểu kiểm soát tác động phụ dung môi chất phụ gia. Pha hoạt chất vào dung môi phù hợp, ảnh hưởng đến tôm DMF, xylen, saliman theo tỉ lệ sau: hóa chất Fenobucarb:DMF:Xylen:Saliman = 1:1:3:2, sau rung máy siêu âm (3 – phút) để tạo dung dịch đồng nhất. Tổng lượng dung môi chất mang vào phải hạn chế mức tối thiểu để đảm bảo pha vào bể không vượt nồng độ 0,1 ml/l (tức 0.1‰). Sau hòa tan thuốc dung môi, hóa chất pha vào keo nhựa 5L nồng độ thí nghiệm. 2.2.3 Phương pháp lựa chọn hóa chất, nồng độ bố trí thí nghiệm a. Thí nghiệm sơ bộ: Thí nghiệm khảo sát sơ hóa chất Fenobucarb thử nghiệm nồng độ có khoảng phân bố (cách 10 lần). Nồng độ tham chiếu (nồng độ trung bình) trị số LC xác định cho số động vật thủy sinh phổ biến cá chép, cá rô, cá lóc…v.v, kết nghiên cứu độc tính tôm công bố rộng rãi. Nồng độ khảo sát hóa chất gồm nồng độ trung bình; nồng độ thấp nồng độ cao nồng độ trung bình 10, 100, 1000 lần. Với nồng độ đối chứng (không sử dụng hóa chất). Mỗi nồng độ lặp lại lần. Bảng 1. Nồng độ hóa chất Fenobucarb thí nghiệm sơ Công thức Hoạt chất Nồng độ TN (mg/lit) CT1 Fenobucarb 0,000016 CT2 Fenobucarb 0,00016 CT3 Fenobucarb 0,0016 CT4 Fenobucarb 0,016 CT5 Fenobucarb 0,16 CT6 Fenobucarb 1,6 CT7 Fenobucarb 16 CT8 Đối chứng (không xử lý hóa chất) b. Thí nghiệm khẳng định: tiến hành thí nghiệm sơ để xác định nồng độ gây chết 50% số cá thể tôm thí nghiệm nồng độ lân cận, từ xây dựng đường cong biểu diễn mối quan nồng độ hóa chất thí nghiệm với tỉ lệ tôm chết. Trong thí nghiệm khẳng định, có nồng độ thuốc thí nghiệm lựa chọn dãy nồng độ 10%, 20%, 40%, 80%, 160%, 320%, 640% nồng độ gây chết 50% xác định thí nghiệm khảo sát sơ bộ. Mỗi nồng độ lặp lại lần. Bảng 2. Nồng độ hóa chất Fenobucarb thí nghiệm khẳng định Hoạt chất Nồng độ TN (mg/lit) Fenobucarb 10% nồng độ gây chết 50% thí nghiệm sơ (N2) CT2 Fenobucarb x N2 CT3 Fenobucarb x N2 Công thức CT1 CT4 Fenobucarb x N2 CT5 Fenobucarb 16 x N2 CT6 Fenobucarb 32 x N2 CT7 Fenobucarb 64 x N2 CT8 Đối chứng (không xử lý HC) Chỉ tiêu phương pháp đánh giá theo dõi thí nghiệm sơ khẳng định Đo DO, nhiệt độ, độ mặn, PH bể trước thí nghiệm (tức trước xử lý hóa chất) sau thời gian thí nghiệm 24, 48, 72 96 giờ. Đếm số tôm chết tính tỷ lệ tôm chết công thức sau xử lý hóa chất 3, 6, 12, 24, 48, 72 96 giờ. Nhặt bỏ tôm bị chết khỏi bể sau cộng dồn số tôm chết cho lần điều tra sau. Ngày cho ăn lần lúc 8h, 12h 18h(thức ăn P.monodon Nhật Bản). Xác định giá trị LC50 tôm thẻ chân trắng. Việc xác định trị số tiến hành xảy sai khác có ý nghĩa tỷ lệ tôm chết công thức thí nghiệm (xử lý hóa chất) so với công thức đối chứng độ tin cậy 95%. Tính tỉ lệ tôm chết theo công thức Abbott tính giá trị LC50 theo chương trình POLO (LeOra Software, Berkeley, USA) sau: a-b Hiệu % = ---------100-b Trong a: Tỷ lệ tôm chết công thức thí nghiệm; b: Tỷ lệ tôm chết công thức đối chứng c. Thí nghiệm mãn tính: Xác định dấu hiệu bệnh lý độ độc mãn tính hóa chất Fenobucarb (thời gian xuất bệnh lý, thời gian tiềm ẩn bệnh, khả thời gian gây chết v.v ) tôm thẻ chân trắng lên cấu trúc mô. Thí nghiệm tiến hành với lần lặp lại. Toàn phương pháp bố trí thí nghiệm kích thước keo, tạo môi trường nước, tôm thí nghiệm v.v tương tự thí nghiệm xác định LC50. Các hóa chất lây nhiễm nhân tạo nồng độ 10%, 20%, 40%, 80% nồng độ gây chết 50% số cá thể công thức đối chứng không sử dụng hóa chất để xác định nồng độ bắt đầu gây triệu chứng, mức độ gây độc cho tôm. Nồng độ thuốc bổ sung để trì ổn định liên tục suốt trình nuôi. Thay nước định kỳ ngày/1 lần, ngày thay 20% mực nước bể. Khi thay nước bổ sung lượng hóa chất để đạt nồng độ ban đầu. Chỉ tiêu phương pháp theo dõi, đánh giá Đo số liệu môi trường (pH, độ mặn, nhiệt độ nước) 24h/lần. Số cá thể tôm bị nhiễm triệu chứng gan, tụy (giải phẩu mô bệnh, quan sát chụp ảnh), quan sát định kỳ 10 ngày/lần xuất triệu chứng ổn định (khoảng 70 ngày). Mỗi keo nhựa quan sát ngẫu nhiên cá thể, nồng độ với lần nhắc lại, nồng độ giải phẫu mô bệnh cá thể tôm. Ghi nhận số cá thể bị chết tỷ lệ chết thời điểm điều tra. Đánh giá độ độc hóa chất Nồng độ hoá chất không gây hiệu ứng độc cấp tính cho tôm: nồng độ thấp ngưỡng bắt đầu gây chết cho tôm hoá chất nghiên cứu. Phương pháp xác định dựa vào đường cong xác định trị số LC50. Nồng độ không gây hiệu ứng độc mãn tính: nồng độ thấp nồng độ gây độc mãn tính. Nồng độ không gây hiệu ứng nào: nồng độ thấp ngưỡng gây độc cấp tính mãn tính. Đánh giá dựa phương pháp mô bệnh học theo Lightner (1996). 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm xử lý thống kê phần mềm Excel BioStat. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thí nghiệm sơ Từ kết thí nghiệm sơ tôm thẻ chân trắng (Bảng 3) cho thấy tượng tôm chết xuất từ CT2 với nồng độ hoạt chất Fenobucarb 0,00016 có tỷ lệ chết công thức CT2, CT3, CT4. Tuy nhiên, CT5 tôm chết tới 94,54% chết hoàn toàn CT6. Với kết thí nghiệm sơ đó, tiến hành lựa chọn khoảng nồng độ cho thí nghiệm khẳng định dao động khoảng 0,016 – 0,16 tương ứng với công thức thí nghiệm để tìm gía trị LC50. Bảng 3. Tỷ lệ tôm thẻ chân trắng P12 chết thời gian thí nghiệm Tỷ lệ chết (%) Nồng độ (mg/l) 3h 6h 12h 24h 48h 72h 96h CT1 0,000016 CT2 0,00016 2,22 3,33 CT3 0,0016 1,11 1,11 1,11 2,22 3,33 3,33 CT4 0,016 1,11 2,22 3,33 3,33 CT5 0,16 81,11 88,89 94,45 CT6 1,6 81 97 100 100 100 100 100 CT7 16 100 100 100 100 100 100 100 CT8 ĐC Công thức 3.2 Kết thí nghiệm khẳng định Từ kết thí nghiệm khẳng định Tôm thẻ chân trắng (Bảng 4) cho thấy tượng tôm chết xuất từ CT2, CT3 với nồng độ hoạt chất Fenobucarb 0,016 ,0,032 có tỷ lệ tôm chết mạnh công thức CT4, CT5. Tuy nhiên CT5 tôm chết tới 100% Với kết thí nghiệm khẳng định tiến hành vẽ đường probit tìm giá trị LC50. Bảng 4. Tỷ lệ tôm thẻ chân trắng P12 chết thời gian thí nghiệm Công thức Nồng độ (mg/l) Tỷ lệ chết (%) 3h 6h 12h 24h 48h 72h 96h CT1 0,008 CT2 0,016 1,11 2,2 3,3 4,4 4,4 4,4 4,4 CT3 0,032 2,22 4,4 6,6 7,7 8,8 8,8 8,8 CT4 0,064 12,22 26 40 52 62 76 79 CT5 0,128 17,78 29 64 89 89 89 89 CT6 0,256 42,22 74 87 96 100 100 100 CT7 0,512 100 100 100 100 100 100 100 ĐC Đ/chứng Với bảng tỉ lệ tôm chết thí nghiệm khẳng định ta tiếp tục chạy phần mềm dựng đường Probit dựa tương quan nồng độ thuốc tỉ lệ tôm chết thí nghiệm khẳng định cho kết quả: với nồng độ hoạt chất Fenobucarb 0,0524mg/l gây chết 50% số tôm thí nghiệm. Vậy trị số LC50 Fenobucarb Tôm Thẻ chân trắng P12 0,0524mg/l. 3.3 Kết thí nghiệm mãn tính Kết phân tích mô học gan tụy tôm thí nghiệm trình bày Bảng 5. Ở nghiệm thức đối chứng, tiếu mô bệnh học cho thấy mẫu tôm thu mẫu tôm khỏe, vùng gan tụy dấu hiệu hoại tử biểu bất thường qua lần thu mẫu. Kết thể Hình 3.2. Bảng 5. Kết mô bệnh học thí nghiệm với hoạt chất Fenobucarb Công thức Thu mẫu (CT) Lần Lần Lần Lần Lần CT (-) (-) (-) (-) (-) (0,00052) CT (-) (-) (-) (-) (-) (0,01048) CT (-) (-) (-) (-) (-) 3(0,02096) CT (-) (-) (*) (*) (*) (0,04192) Đối chứng (-) (-) (-) (-) (-) Lần (-) (-) (-) (*) (-) Ghi chú: (+) có dấu hiệu bất thường vùng gan tụy, (-) dấu hiệu bất thường vùng gan tụy, (*) mẫu Quan sát Hình 3.1 cho thấy gan tụy tôm bình thường với ống gan tụy với diện loại tế bào B, R, F, không ghi nhận diện tác nhân gây bệnh truyền nhiễm (virus, vi khuẩn) nào. Kết (lô đối chứng) chứng tỏ tôm ổn định suốt thời gian bố trí thí nghiệm. Diễn biến mô học nghiệm thức thể qua hình, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5. A B Hình 3.1. Mô gan tụy tôm lô đối chứng (A:10X, B:40X) Ở nghiệm thức với 10% nồng độ hoạt chất Fenobucarb qua lần thu mẫu ghi nhận gan tụy tôm bình thường, tập trung tế bào máu, tế bào tổ chức gan tụy tượng bong tróc. Hình 3.2 Kết phân tích mô gan tụy nghiệm thức qua lần thu mẫu Ở nghiệm thức với 20% nồng độ hoạt chất Fenobucarb, lần thu mẫu thứ với mẫu bình thường lại ghi nhận diện tế bào B, R (Hình 3.3B). Các lần thu mẫu lại không ghi nhận kết bất thường gan tụy. A B Hình 3.3. Kết phân tích mô học nghiệm thức (H&E,10X). (A) Mô gan tụy bình thường; (B) Không có diện tế bào B, R Ở nghiệm thức với 40% nồng độ hoạt chất Fenobucarb nhận thấy có mẫu lần thu thứ có tập trung tế bào máu ống gan tụy, lại mẫu lần thu khác không ghi nhận tượng bất thường nào, dấu hiệu hoại tử, tế bào trung tâm tổ chức gan tụy biến đổi cấu trúc. A B Hình 3.4 Kết phân tích mô học nghiệm thức (H&E,10X). (A) Mô khỏe với diện tế bào B, E cấu trúc hình (B) Tế bào máu tập trung bao bọc ống gan tụy. Ở nghiệm thức cuối với 80% nồng độ hoạt chất Fenobucarb thu nhận biến đổi lên cấu trúc gan tụy, phần lớn mô gan tụy qua lần thu cho thấy gan tụy tôm khỏe mạnh Hình 3.5 Kết mô học nghiệm thức qua lần thu thứ cho thấy tế bào máu tập trung gan tụy, gan tụy cấu trúc, diện tế bào B, R) Kết luận Kết phân tích mô học cho thấy khác biệt mẫu tôm thu từ lô thí nghiệm với nồng độ thuốc khác so sánh với nghiệm thức đối chứng có tượng tế bào máu tập trung ống gan tụy hay thiếu diện tế bào B,R lần thu mẫu từ nghiệm thức có biến đổi lại trở lại bình thường giảm dần. Từ cho thấy hoạt chất Fenobucarb gây ảnh hưởng không nhiều tới vùng gan tụy tôm suốt thời gian thí nghiệm. Thảo luận Fenobucarb hoạt chất thuộc nhóm Carbamate chất gây độc thần kinh, gây ức chế hoạt động men acetyl cholineterase (AchE). Cholineterase men xúc tác trình thủy phân acetycholine (1 chất dẫn truyền thần kinh). Ức chế phản ứng đề tế bào neron phụ hồi trở lại thái nghĩ ngơi. Fenobucarb thuốc diệt côn trùng thị trường chứa khoảng 50% khối lượng hoạt chất Fenobucarb sản phẩm thương mại. Và với LC50 hoạt chất Fenobucarb 0,0524mg/l. Theo phân loại độc WHO (1990) hóa chất có LC50[...]... Fenobucarb là thuốc diệt côn trùng và trên thị trường thì chứa khoảng 50% khối lượng hoạt chất Fenobucarb trong các sản phẩm thương mại Và với LC50 của hoạt chất Fenobucarb là 0,0524mg/l Theo phân loại độc của WHO (1990) thì hóa chất có LC50 . LÊ MINH MẪN XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC. THUỶ SẢN LÊ MINH MẪN XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC. PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2013 1 XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Fenobucarb ĐỐI VỚI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Lê Minh Mẫn và Đặng Thị Hoàng Oanh* Bộ