NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đinh Đăng Huy

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2009

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Đinh Đăng Huy

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

Chuyên ngành : Hoá phân tích

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS.TS PHẠM HÙNG VIỆT

Hà Nội - Năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM với sự hướng dẫn của GS.TS Phạm Hùng Việt

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Hùng Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2009

Học viên

Đinh Đăng Huy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 4

1.1 Hiện tượng thủy triều đỏ 4

1.2 Độc tố sinh học biển trong thủy sản 6

1.3 Đại cương về axít domoic (DA) 8

1.3.1 Tính chất hóa lý .8

1.3.2 Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: 8

1.3.3 Độc tính của DA 9

1.4 Một số phương pháp phân tích DA 9

1.4.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột 10

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11

1.5 Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA 12

1.5.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột 12

1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng 12

1.6 Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 12

1.6.1 Một số định nghĩa và phương trình cơ bản 13

1.6.2 Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) 15

1.6.3 Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng 23

1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột 23

1.7 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 26

1.7.1 Chiết lỏng - lỏng: 27

1.7.2 Chiết pha rắn SPE: 27

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nội dung nghiên cứu của đề tài 29

2.2 Mô hình thực nghiệm 29

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: 29

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ: 29

2.3.2 Thuốc thử, hóa chất: 30

2.4 Thông tin về mẫu nghiên cứu: 30

2.5 Xác định các thông số tối ưu: 31

2.5.1 Xác định các thông số tối ưu cho MS 31

2.5.2 Cột: 31

2.5.3 Pha động và chế độ gradient: 32

2.5.4 Dung môi chiết: 32

2.5.5 Thiết lập bảng mẫu: 32

2.5.6 Tính toán : 33

2.5.7 Khảo sát khoảng tuyến tính: 33

2.5.8 Giới hạn phát hiện của phương pháp: 33

2.5.9 Độ lặp lại của phương pháp: 34

2.5.10 Độ thu hồi của phương pháp: 34

2.5.11 Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể 35

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 Xác định các thông số tối ưu: 36

3.1.2 Pha động và chương trình chạy gradient .40

3.1.3 Dung môi chiết: 45

3.2 Khoảng tuyến tính: 47

3.3 Giới hạn phát hiện của phương pháp: 49

3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: 49

3.5 Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể .51

3.6 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: 52

3.7 Qui trình phân tích Axít domoic .54

3.7.1 Phạm vi áp dụng: 54

3.7.2 Nguyên tắc: 54

3.7.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 54

3.7.4 Chuẩn bị mẫu: 57

3.7.5 Tiến hành thử nghiệm: 58

3.7.6 Đảm bảo chất lượng 60

3.7.7 Tính toán kết quả: 60

KẾT LUẬN 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN 1

PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU 4

PHỤ LỤC 3 ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH 13

PHỤ LỤC 4 SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ 19

PHỤ LỤC 5 SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ………….BẰNG HPLC –UV 29

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Chromatography

Sắc ký lỏng pha thuận

Chromatography

Sắc ký lỏng pha đảo

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diễn giải Trang

Bảng 01 Một số dung môi sử dụng trong HPLC 26

Bảng 02 Chi tiết mẫu thực nghiệm 30

Bảng 03 Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản 36

Bảng 04 Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone 37

Bảng 05 Kết quả khảo sát năng lượng va chạm 38

Bảng 06 Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm 39

Bảng 07 Điều kiện gradient 1– pha động 1 40

Bảng 08 Bảng gradient 2 – pha động 1 41

Bảng 09 Bảng gradient 1 – pha động 2 42

Bảng 10 Bảng gradient 2 – pha động 2 43

Bảng 11 Bảng gradient 3 – pha động 2 44

Bảng 12 So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm 47

Bảng 13 Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark not defined. Bảng 14 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 49

Bảng 15 Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp .49

Bảng 16 Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) 51

Bảng 17 So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS 53

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Diễn giải Trang

Hình 01 Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 16

Hình 02 Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp 17

Hình 03 Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 17

Hình 04 Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo .18

Hình 05 Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận .19

Hình 06 Bộ kết nối phun điện tử 20

Hình 07 Bộ ion hóa hóa học 20

Hình 08 Hệ thống đầu dò tứ cực 22

Hình 09 Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS 23

Hình 10 khả năng tách của cột C8 và C18 24

Hình 11 Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất 24

Hình 12 Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký .25

Hình 14 Mô hình thực nghiệm 29

Hình 15 Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV 37

Hình 16 Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V 38

Hình 17 Cách phân mảnh ion của DA 39

Hình 18 Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV 40

Hình 19 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 41

Hình 20 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 42

Hình 21 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 43

Hình 22 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 44

Hình 23 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 45

Hình 24 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 46

Hình 25 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93 46

Hình 26 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 47

Hình 27 Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính 48

Hình 28 Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV 53

Hình 29 Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV 54

MỞ ĐẦU

Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008 Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan trọng tại các nước đang phát triển Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam Sau hơn 1 năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể Đến năm

2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD

Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam

là Liên minh Châu Âu (EU) Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,

để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là tương đương (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU tương đương nhau (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo

vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (iv) Đồng thời thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích

Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh

quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ)

Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo:

Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine đối với họ cá thu ngừ…) Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích

để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC-

UV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa

có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này Vì vậy vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể

áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … )

là rất cần thiết Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu

Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi

phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn

thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Hiện tượng thủy triều đỏ

Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v Phần lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh Tuy vậy, một phần nhỏ trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được phát hiện trên thế giới thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp (Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác

Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước Sự đổi màu nước tự nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hoặc xanh vàng ở các vùng nước rộng lớn diễn ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các sắc tố đỏ phycoerythrin

“Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó gây ra làm đổi màu nước Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm,

cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong

Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác

Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau:

a Các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương

loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium erythraeum (tảo lam)

b Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như:

Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp: Alexandrium acatenella, A catenella, A cohorticula, sản sinh ra

Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp Dinophysis acuta, D acuminata, D fortii, D norvergica, sản sinh ra

Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê Pseudonitzschia multiseries, P pseudodelicatissima, P australis, sản sinh

ra

Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, sản sinh ra

Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài Gymnodinium breve, Gymnodinium G cf.breve (New Zealand), sản sinh

Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở mật độ thấp chưa làm thay đổi màu nước, chẳng hạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP được phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấp hơn 103 tế bào/lít,

Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động vật đáy ở mật độ cao hơn 107

tế bào/lít (Andersen, 1996)

Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn Người ta đã thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal, Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6 người chết ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ độc, trong đó có 101 người chết Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài Gymnodinium sp nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư ở Monte Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides)

Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là

từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt với tổng số thiệt hại là 4.452 triệu yên, v.v

Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng

20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et al., 1996)

1.2 Độc tố sinh học biển trong thủy sản

a Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù

du Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:

Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20 loại là các dẫn xuất của saxitoxin Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới

1 mg Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong nước

Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc

tố có khối lượng phân tử lớn, bao gồm axit okadaic, dinophysis, pectenotoxins và yessotoxin

Độc tố gây mất trí nhớ (Amnesic shellfish poisoning - ASP) gây lên bởi domoic axit Domoic axit thường được phát hiện tại hàm lượng thấp ở trong

rất nhiều loài tảo đỏ (Chondria armata, Alsidium corallinum và Digenea simplex)

Độc tố thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP) bao gồm các đồng phân của brevetoxin Các phân tử này có thể tan trong mỡ

Tất cả các loài nhuyễn thể (loài thân mềm ăn thức ăn bằng phương thức màng lọc) đều có nguy cơ bị nhiễm độc tố Tuy nhiên, chúng thường thấy ở một số loài sau: PSP thường có trong vẹm, nghêu, sò, điệp; DSP thường có trong vẹm, trai, điệp; ASP thường chỉ có trong vẹm, NSP thường có trong trai, vẹm

b Khi con người ăn nhuyễn thể 2 mảnh vỏ đã bị tích tụ độc tố có thể gây

ra nhiều triệu chứng nhưng các triệu chứng này tùy thuộc vào loại độc tố, hàm lượng độc tố trong nhuyễn thể và lượng nhuyễn thể mà chúng ta ăn vào cơ thể Các triệu chứng:

Gây ra bởi PSP: phần lớn sẽ ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bao gồm: tê liệt

cơ, nói ngọng, khó thở, mẩm ngứa, sốt, mệt mỏi

Gây ra bởi DSP: gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa, ví dụ: nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, đối với trẻ em thì kèm theo các dấu hiệu như sốt, đau đầu

Gây ra bởi ASP: tương tự như DSP độc tố ASP cũng gây ra các triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng đồng thời kèm theo các triệu chứng đối với hệ thần kinh (lẫn, mất trí nhớ, tai biến mạch máu, hôn mê)

Gây ra bởi NSP: Giải phóng Na+ trong quá trình vận chuyển ion vào

1.3 Đại cương về axít domoic (DA)

1.3.1 Tính chất hóa lý

DA là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 223-224oC, tan tốt trong nước (8mg/ml), tan ít trong metanol (0.6mg/ml)

Tên đầy đủ: ([2S-[2α,3β,4β

(1Z,3E,5R)]]-2-Carboxy-4-(5-carboxy-1-methyl-1,3-hexadienyl)-3- pyrrolidineacetic acid)

Công thức phân tử: C15H21NO6:

Công thức cấu tạo:

Trọng lượng phân tử: 311.34 g/mol

Độ tan trong nước là 8 mg/ml ở 25oC, trong Metanol là 0.6 mg/ml Nhiệt độ nóng chảy từ 223-224oC

1.3.2 Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể:

DA được phát hiện đầu tiên từ loài tảo đỏ lớn Chondria ớ phía nam Nhật Bản (Take moto and Daigo, 1958) Tuy nhiên đến năm 1987 nó lại bùng phát tại Canada do loài Pseudo-nitzschia sinh ra (Perl et all , 1990)

Pseudo-nitzschia phân bố rộng khắp trong nước biển trên thế giới, ở cả khí hậu ấm và khí hậu lạnh Tảo nở hoa tăng lên khi thời tiết chuyển từ mùa xuân sang mùa thu khi có mưa rào và dồi dào chất giúp cho quá trình tăng trưởng [B Jeffery*, T Barlow, K Moizer, S Paul, C Boyle1] Ngoài ra cùng với việc tốc độ gió và dòng nước thấp giúp cho việc tăng sự tích tụ tảo trên vùng nước mặt ấm

DA được tìm thấy trong các loài nhuyễn thể như sò (Cerastoderma edule), cua (Cancer magister), nghêu (Scrobicularia plana), trai (Mytilus

edulis), razor clams (Siliqua patula) and điệp (Pecten maximus) [Wekell et al., 1994; Rhodes et al., 1998; Vale and Sampayo, 2001]

DA bị tích tụ trong nhuyễn thể do cơ chế ăn kiểu màng lọc nên có thể trực tiếp các loài tảo độc hoặc các vi sinh vật đã có hàm lượng DA bị tích tụ trong NT2MV, hàm lượng độc tố ở hệ thống tiêu hóa của nhuyễn thể cao hơn

so với ở cơ thịt, tốc độ tích tụ DA trong nhuyễn thể cũng rất khác nhau giữa các loài nhuyễn thể [Vale and Sampayo, 2001; Hay et al., 2000], Khả năng chuyển hóa DA trong nhuyễn thể là rất thấp

Khi nhuyễn thể đã bị tích tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu (nuôi ở trong môi trường nước biển sạch) thì có thể làm giảm hàm lượng độc

tố Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm lượng DA trong loài vẹm xanh được rửa giải trong vòng 24 h nuôi lưu, trong khi đó phải mất

86 ngày để rửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al.,

1.4 Một số phương pháp phân tích DA

Dựa vào tính chất và cấu trúc của Axít domoic (DA), hiện nay trên thế giới đã có một số phương pháp xác định trong các nền mẫu khác nhau (nước biển, tảo, nhuyễn thể hai mảnh vỏ ) như: sinh hóa trên chuột (mouse bioassay), sắc ký lỏng với đầu dò UV-VIS, huỳnh quang (HPLC-UV/FLD)

Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện chưa có một tiêu chuẩn hoặc phương pháp nào đề cập đến việc phân tích DA ngoại trừ một số qui trình tự xây dựng của một số phòng kiểm nghiệm

Sau đây là một số phương pháp điển hình, phù hợp đáp ứng được phân tích dư lượng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản:

1.4.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột

Pha loãng dung dịch chuẩn ASP ở một số nồng độ tăng dần bằng nước

vô trùng và tiêm vào màng bụng một số con chuột, tiêm mỗi con 1 ml cho đến khi xác định được nồng độ gây chết chuột trong khoảng thời gian từ 5 đến 7 phút Lưu ý: kiểm tra pH của các dung dịch trước khi tiêm pH của dung dịch phải nằm trong khoảng từ 2-4, không được lớn hơn 4,5

Từ nồng độ được chọn, pha loãng thêm hai nồng độ mới bằng cách thêm hay bớt 1 ml nước vô trùng so với thể tích ban đầu Thí dụ nếu 10ml chuẩn được pha loãng với 25ml nước vô trùng thì khi pha thêm hai dung dịch mới sử dụng thể tích nước vô trùng là 24ml và 26ml

Tiêm mỗi nồng độ chuẩn pha loãng thu được ở bước trên vào một nhóm gồm 10 chuột (10 chuột/ một nồng độ), mỗi con chuột 1ml dung dịch Xác định thời gian gây chết chuột tính từ thời điểm tiêm xong đến thời điểm tim chuột đập lần cuối cùng

Lặp lại qui trình trên 1 hoặc 2 ngày sau đó với dung dịch chuẩn làm việc mới được chuẩn bị

Tính thời gian gây chết trung bình của mỗi nhóm 10 chuột ứng với mỗi

độ pha loãng Loại bỏ các độ pha loãng có thời gian gây chết chuột trung bình nhỏ hơn 5 phút hoặc lớn hơn 7 phút Từ thời gian gây chết chuột thu được, tra bảng Sommer’s, để xác định hàm lượng độc tố tính theo đơn vị MU trong 1ml dung dịch (MU/ml) ứng với mỗi độ pha loãng Tính hệ số chuyển đổi CF (hệ số chuyển đổi giữa lượng độc tố tính bằng µg và tính bằng MU) cho mỗi

độ pha loãng bằng cách chia nồng độ của dung dịch (µg/ml) với số đơn vị độc

Tính giá trị trung bình của các hệ số CF thu được ở trên Sử dụng hệ số

CF này trong tính kết quả

Hệ số chuyển đổi CF cần được kiểm tra thường xuyên, việc kiểm xoát lại hệ số chuyển đổi CF được thực hiện bằng cách chích vào 5 con chuột dung dịch chuẩn đã pha loãng sao cho thời gian gây chuột chết nằm trong khoảng 5-7 phút Xác định hệ số CF và so sánh với CF tham chiếu đã xác định được trước đó Sự sai lệch phải nằm trong khoảng ± 20 % Nếu sự sai lệch vượt khoảng này, tiêm thêm 5 con chuột và bổ sung vào 5 con chuột đã chích trước

đó để có nhóm chuột gồm 10 con, chọn và chích thêm nhóm chuột thứ hai gồm 10 con với cùng nồng độ dung dịch chuẩn như nhóm 1 Tính hệ số CF của 2 nhóm chuột và tính CF trung bình Hệ số CF thu được này được xem như giá trị CF mới sử dụng trong tính kết quả, vì độ lệch nằm ngoài khoảng ±

20 % có khả năng do kỹ thuật hoặc do sự thay đổi đáp ứng của giòng chuột đối với độc tố Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phương pháp của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009]

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng (UV, DAD, FLD, MS/MS)

LC-Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần) Sau đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS Đối với đầu dò huỳnh quang FLD, sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào đầu dò

Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha thuận) thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc đầu dò khối phổ MS/MS Đối

với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu

tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z Trên cơ

sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợp chất nào đó

1.5 Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA

1.5.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột

Phương pháp sinh hóa trên chuột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơn giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm khẳng định Tuy nhiên đối với các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều hợp chất cùng nhóm) Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật

1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng

Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và

có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí phân tích ở mức trung bình Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển

để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với mức giới hạn cho phép thấp (ppb)

Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết

1.6 Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5]

Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau Kỹ thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng 1.6.1 Một số định nghĩa và phương trình cơ bản

1.6.1.1 Chiều rộng pic

Chiều rộng pic được đo bằng cách mở rộng hai bên pic xuống đường nền và đo chiều rộng ở đường nền Tuy nhiên, người ta thường đo tại bán chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơn

1.6.1.2 Thời gian lưu (tr) và thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’)

Thời gian lưu là tổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh, có đơn vị đo thường dùng là phút Tại một nhiệt độ cột và tốc độ dòng cố định, mỗi hợp chất tốn cùng một thời gian trong pha động Thời gian trong pha động được xác định bằng cách tiêm một hợp chất không bị lưu lại vào hệ thống HPLC và đo thời gian lưu của nó Thời gian lưu này được gọi là thời gian chết của cột và biểu thị là tm hoặc to

Bởi vì mỗi hợp chất tiêu tốn cùng thời gian trong pha động, sự khác nhau trong thời gian lưu là do bởi sự khác nhau thời gian tiêu tốn trong pha tĩnh Nếu lấy thời gian lưu của một hợp chất trừ thời gian chết của cột (tm) ta

sẽ có được thời gian tiêu tốn thật sự của một hợp chất trong pha tĩnh, giá trị này được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’) và được tính bởi:

tr’ = tr - tm (0.1) Trong đó:

tr : thời gian lưu

tm : thời gian của pic không bị giữ lại hay thời gian chết của cột 1.6.1.3 Tỷ số phân bố

m r t

t t

C

Cs: Nồng độ hợp chất trong pha tĩnh

Cm: Nồng độ hợp chất trong pha động Hằng số phân bố rất tiện lợi để mô tả và dự đoán những thay đổi khả năng lưu giữ dựa trên thay đổi kích cỡ và nhiệt độ cột

r

W

t W

t

n 5 , 545 16

2

(0.4)

Wb = 1,699Wh: chiều rộng pic tại đáy

tr : thời gian lưu của pic

Wh: Chiều rộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơn vị với tr) Ngoài ra còn dùng số đĩa lý thuyết hiệu dụng N

2 ' 2

' 16 545

r

W

t W

k1: tỷ số phân bố của pic giải hấp trước

k2: tỷ số phân bố của pic giải hấp sau 1.6.1.7 Độ phân giải (R)

Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất

1 2

18 , 1

h h

r r W W

t t

tr1: thời gian lưu của pic 1

tr2: thời gian lưu của pic 2

Wh1: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 1 (cùng đơn vị với tr)

Wh2: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 2 (cùng đơn vị với tr) Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau 1.6.2 Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters)

Hệ thống gồm 7 phần chính:

ƒ Hệ thống bơm (Pump system)

ƒ Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)

ƒ Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)

ƒ Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)

ƒ Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)

ƒ Đầu dò khối phổ (Detector)

ƒ Hệ thống xử lý dữ liệu

Hình 01 Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 1.6.2.1 Hệ thống bơm

Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:

- Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)

- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min

- Thể tích chết nhỏ

- Trơ với dung môi của pha động

- Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau

1.6.2.2 Hệ thống tiêm mẫu:

a Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu:

- Có tác dụng tiêm mẫu

- Tự động tắt khi áp suất cao

- Có thể bơm tuần hoàn mẫu

b Cấu tạo và sơ đồ hoạt động của van cao áp:

- Vị trí nạp: mẫu được nạp vào ống chứa mẫu Hình 02

- Vị trí tiêm: van cao áp xoay 1 góc 60o và dung môi sẽ đẩy mẫu ở sample loop theo đường ống và đi vào cột (Hình 03)

Hình 02 Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp

Hình 03 Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm

1.6.2.3 Buồng cột

Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích

1.6.2.4 Cột sắc ký

10µm Có 2 loại cột thường dùng trong sắc ký lỏng đó lag cột pha đảo và cột pha thuận

a Cột sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography - RPLC):

Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol (Hình 04)

Các chất phân tích có ái lực khác nhau với nhóm chức không phân cực:

- Chất không phân cực: phần lớn dùng cột C18

- Chất phân cực: một số dùng cột C18

- Chất phân cực: Đa số dùng cột C8

Hình 04 Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo

b Cột sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC)

Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino (Hình 05)

Hình 05 Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận

1.6.2.5 Pha động

Là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm, yêu cầu:

- Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với MeOH/ACN)

- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

- Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc)

1.6.2.6 Đầu dò khối phổ MS

Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký Việc phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường ) Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích)

1.6.2.6.1 Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI)

Hình 06 Bộ kết nối phun điện tử Nguyên tắc của phương pháp ion hóa phun điện là dòng chảy từ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra với tốc độ 1-40ml/phút đi qua 1 ống capillary có đường kính cỡ mm và điện trường cao 1-6kV Chất lỏng được phun ra dưới dạng hạt rất nhỏ mang điện ở áp suất thường Các hạt này đi đến điện cực của nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API) Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơi nhanh biến các hạt rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi đưa đến buồng ion hóa

1.6.2.6.2 Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI)

Hình 07 Bộ ion hóa hóa học

Mao quản Buồng hóa hơi

Áp suất khí quyển

Gia nhiệt

Không khí khô

Bơm chân không

Chân không cao Chất lỏng

Bộ phân phân tích

Điện cực phóng điện

Bộ lọc

Khí nebulizer

Hỗn hợp khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm với 1 dòng ion dương (H2, CH4, H2O ) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các mảnh ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng cao do que Corona tạo ra Mỗi phân

tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học

Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer) Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ:

Vỏ ống dẫn khí

Đầu kim dẫn mẫu

Vùng phun điện (plasma)

Vùng va chạm

Bộ phận phân tích

Block làm bay hơi bằng gia nhiệt Khí nebulizer

Chất phân tích (M)

và hơi dung môi

Diễn giải vùng phun điện (plasma)

Đầu kim dẫn mẫu (hiệu điện thế cao)

Hình 08 Hệ thống đầu dò tứ cực

Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC Chúng làm cho các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm Do đó chỉ các ion nhất định mới tới được bộ góp, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt tới bộ phận thu góp

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy, độ chính xác

Đầu dò khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai

hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ) MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng

để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu

Hình 09 Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS

1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột

Có 3 yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tách trong cột đó là:

Đường kính cột càng nhỏ, lượng tiêu tốn dung môi càng ít, nhưng khó chế tạo Cột càng dài, cỡ hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhưng thời gian chạy càng lâu và áp suất càng phải cao

Hình 11 Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất

- Độ phân cực của dung môi

Độ phân cực của dung môi ảnh hưởng mạnh đến quá trình sắc ký (Hình

Hình 12 Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký

Bảng 01 Một số dung môi sử dụng trong HPLC

Độ phân cực Dung môi Khả năng tan

Dicloro metan Tetra-hydrofuran Dietyl ete

Etyl axetat Axeton Axetonitril Isopropanol Metanol Nước Axít axetic

Không Không Không Không Không Không Không

Có Không

1.7 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:

- Tăng nồng độ lên nhiều lần

- Lượng mẫu không cần nhiều

- Lượng dung môi cần ít

- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu

- Đơn giản, nhanh, giá thành thấp

Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất 1.7.1 Chiết lỏng - lỏng:

Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao

Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ

số nồng độ trong hai pha là một hằng số

[A]hc

KA= (0.9)

[A]n

KA : hằng số phân bố [Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ [An]: nồng độ của chất A trong pha nước

1.7.2 Chiết pha rắn SPE:

Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu)

Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như

các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ

và mẫu thực phẩm

Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:

Bước 1 Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được

Bước 2 Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp

Bước 3 Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi

có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu

Bước 4 Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút

Bước 5 Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích

Bước 6 Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút

Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn

thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị trường nhập khẩu trên thế giới

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS

- Khảo sát các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp (giới hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặp lại, và so sánh kết quả phân tích trên LC-MS/MS với phương pháp HPLC-UV)

- Thu thập và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở 12 vùng thu hoạch NT2MV tại Việt Nam

Xây dựng qui trình chiết mẫu

Xây dựng phương pháp

Kiểm tra độ

lặp lại

Kiểm tra độ thu hồi

Tìm giới hạn phát hiện

Xác định độ đặc hiệu

Phân tích một

số mẫu thật

2.3.1.2 Cột sắc ký lỏng C8 kích thước cột 4,6x150mm kích thước hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức

2.3.1.3 Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc

2.3.1.4 Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ

2.3.1.5 Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ

2.3.1.6 Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức

2.3.1.7 Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức

2.3.1.8 Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức

Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích

2.3.2.1 Chuẩn axít domoic (Sigma) Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông

tủ lạnh

2.3.2.2 Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC), Merck – Đức

2.3.2.3 Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức

2.3.2.4 Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức

2.3.2.5 Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức

Cách thức pha hóa chất, chất chuẩn được thực hiện theo mục 3.7

2.4 Thông tin về mẫu nghiên cứu:

Tiến hành thu thập 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu hoạch trong cả nước, chi tiết theo tại Bảng 02:

Bảng 02 Chi tiết mẫu thực nghiệm

TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy

mẫu

1 Nghêu Bến Tre 03 Giao Thủy – Nam Định 20/7; 18/8; 09/11

2 Nghêu Bến Tre 03 Tiền Hải – Thái Bình 20/7; 18/8; 09/11

TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu

9 Nghêu Bến Tre 03 Cần Giờ - Hồ Chí Minh 28/7; 18/8; 10/11

10 Nghêu Bến Tre 03 Tân Thành – Tiền Giang 28/7; 18/8; 10/11

Tất cả các mẫu được bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý

2.5 Xác định các thông số tối ưu:

2.5.1 Xác định các thông số tối ưu cho MS

Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau:

- Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất

- Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng

2.5.2 Cột:

Để lựa chọn cột sử dụng, chúng tôi tiến hành như sau: sử dụng dụng

5µm Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài

2.5.3 Pha động và chế độ gradient:

Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau:

- Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN

- Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B) Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài

2.5.4 Dung môi chiết:

Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi:

- Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1

- Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93

- Dung môi 3: MeOH: H2O: 2:1

Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân

kỹ thuật vào ống ly tâm Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chiết mẫu Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0,45μm vào

lọ thủy tinh vial 1,5 ml

Sau khi có kết quả, phương pháp được chọn phải là phương pháp loại đáng kể nhiễu nền có thể gây ảnh hưởng đến pic DA đồng thời độ thu hồi tốt Nếu cả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa phương pháp đơn giản, giá thành thấp và phù hợp với điều kiện ở thực tế

2.5.5 Thiết lập bảng mẫu: