Hướng dẫn này qui định phương pháp xác định hàm lượng ASP trong mẫu thủy sản bằng LC-MS/MS.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.5 mg/kg. 3.7.2. Nguyên tắc:
ASP được chiết tách từ mẫu nhuyễn thể bằng hỗn hợp metanol-nước (1:1). Hàm lượng ASP trong dịch chiết mẫu được xác định trên sắc ký ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS).
3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 3.7.3.1. Thiết bị- dụng cụ: 3.7.3.1. Thiết bị- dụng cụ:
3.7.3.1.1. Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS, gồm các bộ phận sau: Bơm pha động, bộ tiêm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cột, đầu dò MS/MS (Micro mass), bộ điều khiển hệ thống (Waters) và phần mềm xử lý.
3.7.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức hoặc tương đương.
3.7.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc hoặc tương đương.
3.7.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ hoặc tương đương. 3.7.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ hoặc tương đương. 3.7.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức hoặc tương đương.
3.7.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 3.7.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 3.7.3.1.11. Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 3.7.3.1.12. ống tiêm nhựa loại 5ml. 3.7.3.1.13. Giấy lọc. 3.7.3.1.14. Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,... 3.7.3.2. Hóa chất, dung dịch:
3.7.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma) hoặc tương đương. Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh.
3.7.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC).
3.7.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC. 3.7.3.2.4. Axít Formic (FA) tinh khiết phân tích
3.7.3.2.5. Dung dịch pha động cho máy HPLC: Trộn đều 100ml ACN và khoảng 900ml nước HPLC trong bình định mức 1000ml, thêm 1.0 ml FA, và
3.7.3.2.6. Dung dịch chiết mẫu : Trộn đều metanol và nước HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:1). Chuẩn bị dung dịch trước mỗi lần sử dụng.
3.7.3.2.7. Dung môi pha chuẩn: Trộn đều axetonitril và nước HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:9). Chuẩn bị dung dịch trước mỗi lần sử dụng.
3.7.3.2.8. Dung dịch chuẩn gốc 1000μg/ml: hút chính xác 950μl Metanol bằng micropipette 1ml vào chai đựng chất chuẩn axít domoic, lắc đều. Bảo quản trong ngăn đông tủ lạnh, Dung dịch được dùng trong 1 năm.
Lưu ý: Thể tích hút metanol trên phải được điều chỉnh hợp lý sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận của nhà sản xuất sau đó tính toán lại nồng độ thực tế đã pha.
3.7.3.2.9. Dung dịch ASP 25μg/ml: Hút chính xác 250μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.10. Dung dịch ASP 10 μg/ml: Hút chính xác 100μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.11. Dung dịch ASP 7 μg/ml: Hút chính xác 70μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.12. Dung dịch ASP 4 μg/ml: Hút chính xác 40μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.13. Dung dịch ASP 2.5 μg/ml: Hút chính xác 1000μl dung dịch chuẩn ASP 25μg/ml vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến
vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.14. Dung dịch ASP 2.0 μg/ml: Hút chính xác 800μl dung dịch chuẩn domoic 25μg/ml và định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.15. Dung dịch ASP 1.0 μg/ml : Hút chính xác 400μl dung dịch chuẩn 25 μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.3.2.16. Dung dịch ASP 0.5μg/ml: Hút chính xác 200μl dung dịch chuẩn 25μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng.
3.7.4. Chuẩn bị mẫu: 3.7.4.1. Chuẩn bị mẫu thô 3.7.4.1. Chuẩn bị mẫu thô
Tách vỏ nhuyễn thể, rửa sạch nước muối. Đồng hóa ít nhất 100g thịt nhuyễn thể trên máy đồng hoá mẫu. Bảo quản ở ít nhất -100C nếu mẫu không được phân tích ngay khoảng 1 tuần.
3.7.4.2. Chuẩn bị mẫu thử nghiệm:
Cân chính xác 2.0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thử nghiệm 1 lần/mẫu
3.7.4.3. Chuẩn bị mẫu trắng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu trắng là mẫu nhuyễn thể đã xác định không có ASP. Chuẩn bị mẫu trắng giống nhưđối với mẫu thử nghiệm.
3.7.4.4.2. Mẫu kiểm soát 4.0mg/kg: đuơc chuẩn bị bằng cách thêm 16μL dung dịch chuẩn 500μg/mL vào 2.0g mẫu trắng. Tiến hành phân tích nhưđối với mẫu thử nghiệm.
3.7.5. Tiến hành thử nghiệm:
3.7.5.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu:
- Thêm chính xác 8.0 ml dung dịch chiết mẫu (3.7.3.2.6) vào các ống ly tâm chứa mẫu đã chuẩn bị ở các bước (3.7.4.2), (3.7.4.3), (3.7.4.4). Lắc mẫu trong 20 phút trên máy lắc mẫu.
- Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong 10 phút trên máy ly tâm Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0.45μm vào lọ thủy tinh 1.5 ml.
Xác định hàm lượng ASP trong dịch chiết này trên máy LC-MS/MS. 3.7.5.2. Phân tích mẫu trên HPLC:
3.7.5.2.1. Thông số cài đặt cho HPLC: - Pha động A: 0.1% FA trong H20 - Pha động B: 0.1%FA trong ACN
- Thành phần pha động thay đổi theo thời gian (chế độ gradient) được mô tảở bảng sau: Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 50,0 50,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 3 6,00 90,0 10,0 0,400 3 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 50,0 50,0 0,400 1 - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
3.7.5.2.2. Thông số cài đặt cho đầu dò MS - Chếđộ vận hành: ESI+ - Nguồn ESI (+) - Điện thế mao quản: 1kV - Điện thế extractor: 2,0 V - Điện thế RF: 0,0 V - Nhiệt độ nguồn: 120oC
- Nhiệt độ khử dung môi:400oC - Tốc độ khí cone: 40 l/giờ
- Tốc độ khí khử dung môi: 460 l/giờ - Bộ phân tích
Độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0 Năng lượng ion hoá 1: 0,5
Điện thế cửa vào: -1 Điện thế cửa ra: 1
Độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0 Năng lượng ion hoá 2: 3
Điện thế bộ khuyếch đại: 650 V Áp suất chân không: 4-5e-3 mbar Chế độ vận hành : chuẩn - Các điều kiện phân ly MS/MS: Tên chất ion sơ cấp (m/z) ion thứ cấp (m/z) Thời gian Dwell (s) Điện thế cone (V) Năng lượng cone (eV)
Thứ tự tiêm mẫu:
-Tiêm các dịch mẫu xây dựng đường chuẩn. -Tiêm dịch mẫu trắng.
-Tiêm các dịch mẫu thử nghiệm.Tính Hàm lượng DA trong mẫu thử nghiệm.
3.7.6. Đảm bảo chất lượng
3.7.6.1. Định tính: Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi các yêu cầu về thời gian lưu, mức dung sai cường độ ion tương đối… đáp ứng theo chỉ thị 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu.
3.7.6.2. Định lượng:
- Tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu của các ion thứ cấp trong mẫu phải ≥3:1 - Hệ số hồi qui tuyến tính của đường chuẩn R2 phải≥0.99
3.7.7. Tính toán kết quả:
3.7.7.1. Tính tỉ số ion theo phương trình:
(%) A 100 R 2 1 A × = Trong đó: R: tỉ số ion (%)
A1: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ thấp. A2: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ cao
3.7.7.2. Dựng đồ thị hệ số tín hiệu của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính:
Y = ax + b Trong đó:
b: tung độ góc của đường chuẩn a: hệ số góc của đường chuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.7.7.4. Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu dựa theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành các nhiệm vụ của luận văn đã đề ra với kết quả như sau:
- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS: (i) Phương pháp chiết: lựa chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết là MeOH:H2O tỷ lệ 1:1. (ii) Tối ưu các thông số liên quan đến HPLC: sử dụng cột C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18); lựa chọn và sử dụng pha động là 0.1% FA trong H20 (A) và 0.1%FA trong ACN (B); tốc độ dòng 0,4 ml/phút. (iii) Tối ưu hóa các thông số của đầu dò MS/MS: hiệu điện thế mao quản (capillary = 2 kV), điện thế cone (cone volt = 30 V), năng lượng va chạm (collission energy = 20 eV và 15 eV tương ứng với 02 ion con là 184,51 và 266,25).
- Khảo sát giá trị sử dụng của phương pháp trên mẫu thật và mẫu chuẩn: (i) Khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính có nồng độ từ 0.5 ppm đến 10 ppm (R2 > 0,98). (ii) Độ nhạy của phương pháp: Giới hạn phát hiện LOD: 0,5 ppm. Giới hạn định lượng LOQ: 1,5 ppm. (iii) Độ lặp lại của phương pháp: Độ thu hồi của phương pháp: 101.2%. Độ lặp lại của phương pháp SD = 0.17 hay CV = 6.72%.
- Đã phân tích 36 mẫu nhuyễn thể tại 12 vùng thu hoạch nhuyễn thể của Việt Nam.
- Kiểm đối chứng: lấy xác suất 1 số mẫu nhuyễn thể, mẫu thêm chuẩn (spiked) và mẫu vật liệu chuẩn (CRM).
- Trong khuôn khổ luận văn, với thời gian và điều kiện hạn hẹp nên chúng tôi chỉ mới chỉ nghiên cứu trong phạm vi là phân tích DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Vì vậy mong muốn của chúng tôi là trong thời gian sắp đến
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần ThịĐà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục.
2. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết của HPLC trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
3. Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiển, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản y học, tr. 236-242.
4. Tạ Thị Thảo, Bài giảng chuyên đề “Thống kê trong hóa phân tích”, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, 2005
5. Phạm Hùng Việt (2003), Sắc kí khí, NXB Khoa học Kĩ thuật.
Tiếng Anh
6. H. Dizer, B. Fischer, A.S.A. Harabawy, M.-C. Hennion, P.-D. Hansen (2001), Toxicity of axít domoic in the marine mussel Mytilus edulis, Aquatic Toxicology, Vol.55, pp.194-156.
7. Intergovernmental Oceanographic Commission (1995), Manuals and Guides No. 31, Volume 1.
8. Jean-Philippe Antignac, Bruno Le Bizec, Fabrice Montau, Francois Andre (2003), Validation of Analytical Mehtods Based on Mass Spectrometric Detection according to “2002/657/EC” European Decision: Guideline and Application, Analytica Chimica Acta, Vol. 483, pp. 325-334.
9. Jonathan Clayden,* Benjamin Read and Katherine R. Hebditch (2005),
Chemistry of axít domoic, isoaxít domoics, and their analogues, Tetrahedron report number 720.
10.Marios Maroulis, Ioannis Monemvasiosa, Elisabeth Vardakaa, Pantelis Rigasa (2008) Determination of axít domoic in mussels by HPLC with post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazole (NBD-Cl) and fluorescence detection, Journal of Chromatography B, 876, pp. 245–251.
11.Lefebvre KA, Powell CL, Busman M, Doucette GJ, Moeller PD, Silver JB, Miller PE, Hughes MP, Singaram S, Silver MW, Tjeerdema RS (1999), Detection of axít domoic in northern anchovis and California sea lions associated with an unusual mortality event, Natural toxins , 7(3), pp.85-92.
12.Philipp Hess, Steven Morris, Lesley A. Stobo, Nigel A. Brown, John D.G. McEvoy, Glenn Kennedy, Paul B. Young, Deirdre Slattery, Evin McGovern, Terry McMahon, Susan Gallacher (2005), LC-UV and LC- MS methods for the determination of axít domoic, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 24, No. 4, 2005.
13.Quilliam MA (1995), Seafood toxins, Journal of AOAC International, 78(1), pp. 144-148.
14.Yasumoto T; Fukui M; Sasaki K; Sugiyama K (1995), Determinations of marine toxins in foods, Journal of AOAC International, 78(2), pp. 574-582.
15.Whitney PL, Baden DG (1996), Complex association and dissociation kinetics of brevetoxin binding to voltage-sensitive rat brain sodium channels, Natural toxins, 4, pp. 261-270.
PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN
1. Nhóm ASP Axít domoic
2. Nhóm DSP
2.1 Dinophysis Toxin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2 Okadaic Acid
2.4 Yessotoxin
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU 1. Khảo sát capillary
Hình 32. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 1 kV
Hình 34. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 3 kV
Hình 35. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 4 kV Nhận xét: tại điều kiện capillary = 2 kV là tối ưu nhất.
2. Khảo sát cone volt
Hình 36. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 10 V
Hình 38. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 30 V
Hình 40. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 50 V Nhận xét: Tại điều kiện 30 V là tối ưu nhất và ion mẹ là 312
Hình 42. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 10 eV
Hình 46. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 30 eV
Hình 48. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 40 eV Nhận xét: Tổng hợp tín hiệu của các mảnh ion con (5 mảnh) ta có bảng tóm tắt như sau:
Mass Collision Energy
10 15 20 25 30 35 40 184.51 52348 21304 184.92 16651 184 219.31 22530 219.92 17764 219 247.64 19793 247.84 13518 248.04 11555 247 265.65 40379 265.85 17217 266.05 25038 266.25 80749 266 293.58 14042 293.78 21573 294
PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH
Hình 49. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 0.5 ppm
Hình 53. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 5 ppm
Hình 55. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ 10 ppm 1. Đường tuyến tính của Ion 219
PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV
Hình 76. Đường chuẩn chạy DA bằng HPLC-UV