Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu).
Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút.
Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị trường nhập khẩu trên thế giới.
Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS .
- Khảo sát các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp (giới hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặp lại, và so sánh kết quả phân tích trên LC- MS/MS với phương pháp HPLC-UV).
- Thu thập và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở 12 vùng thu hoạch NT2MV tại Việt Nam.
2.2. Mô hình thực nghiệm
Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dưới đây (Hình 1):
Hình 14. Mô hình thực nghiệm 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: Chọn dung môi chiết Chọn phương pháp chiết Chọn các thông số LC, MS/MS Chọn thành phần pha động, gradient Xây dựng qui trình chạy mẫu Xây dựng qui trình chiết mẫu Xây dựng phương pháp Kiểm tra độ lặp lại Kiểm tra độ thu hồi Tìm giới hạn phát hiện Xác định độ đặc hiệu Phân tích một số mẫu thật
2.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C8 kích thước cột 4,6x150mm kích thước hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức.
2.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc. 2.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ .
2.3.1.5. Bểđánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ. 2.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức. 2.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức. 2.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức. 2.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 2.3.1.10.Ống ly tâm 50ml. 2.3.1.11.Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 2.3.1.12.Ống tiêm nhựa loại 5ml. 2.3.1.13.Giấy lọc. 2.3.1.14.Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,...
2.3.1.15.Hệ thống LC-MS/MS, model Micromass API, hãng Waters – Mỹ 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất:
Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích
2.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma). Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh.
2.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC), Merck – Đức. 2.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức.
2.3.2.4. Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. 2.3.2.5. Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức.
Cách thức pha hóa chất, chất chuẩn được thực hiện theo mục 3.7
2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:
Tiến hành thu thập 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu hoạch trong cả nước, chi tiết theo tại Bảng 02:
Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm
TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu
1. Nghêu Bến Tre 03 Giao Thủy – Nam Định 20/7; 18/8; 09/11 2. Nghêu Bến Tre 03 Tiền Hải – Thái Bình 20/7; 18/8; 09/11
TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu
4. Điệp 03 Phan Thiết – Bình Thuận 28/7; 18/8;
10/11
5. Sò anti 03 Tuy Phong – Bình Thuận 28/7; 18/8;
10/11
6. Nghêu Bến Tre 03 Bình Đại – Bến Tre 28/7; 18/8;
10/11
7. Nghêu Bến Tre 03 Ba Tri – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11
8. Sò huyết 03 Thạnh Phú – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11
9. Nghêu Bến Tre 03 Cần Giờ - Hồ Chí Minh 28/7; 18/8; 10/11 10. Nghêu Bến Tre 03 Tân Thành – Tiền Giang 28/7; 18/8; 10/11
11. Sò Lông 03 Bà Lụa – Kiên Giang 20/7; 17/8; 09/11
12. Nghêu lụa 03 Hiệp Thạnh – Trà Vinh 20/7; 17/8; 09/11 Tất cả các mẫu được bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý.
2.5. Xác định các thông số tối ưu:
2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS
Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau:
- Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất.
- Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng.
2.5.2. Cột:
5µm. Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.3. Pha động và chế độ gradient:
Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau:
- Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN
- Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.4. Dung môi chiết:
Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi:
- Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1
- Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93 - Dung môi 3: MeOH: H2O: 2:1.
Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chiết mẫu. Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu. Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm. Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0,45μm vào lọ thủy tinh vial 1,5 ml.
Sau khi có kết quả, phương pháp được chọn phải là phương pháp loại đáng kể nhiễu nền có thể gây ảnh hưởng đến pic DA đồng thời độ thu hồi tốt. Nếu cả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa phương pháp đơn giản, giá thành thấp và phù hợp với điều kiện ở thực tế.
Thiết lập bảng mẫu với thứ tự sau: - Mẫu chạy thử (pre-test). - 5 mẫu chuẩn sắp xếp từ nhỏ đến lớn. - Mẫu trắng và mẫu kiểm soát. - Các mẫu thử nghiệm. - Mẫu chuẩn Chương trình chạy rửa cột (50% MeOH:50%H2O, 1mL/phút, 50 phút) 2.5.6. Tính toán : Việc tính toán kết quả bằng phần mềm trên hệ thống xử lý dữ liệu – Masslynx 4.0. Dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn, lập đường cong chuẩn tuyến tính dựa trên diện tích pic và nồng độ của các mẫu chuẩn sau đó mẫu được tính theo đường hồi quy y=ax+b (xi = (yi-b)/a) với y là diện tích pic của mẫu còn x là nồng độ.
Mẫu trắng, mẫu kiểm soát được dùng để tính toán độ thu hồi của mỗi đợt kiểm và xây dựng giản đồ kiểm soát.
Sau khi xác định được các thông số tối ưu, tiến hành xác định khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện của phương pháp, độ lặp lại, độ thu hồi.
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính:
Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện chạy dãy chuẩn với 5 nồng độ pha từ 0,5 ppm đến 30 ppm trong 3 ngày liên tục. Nếu đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R2 >= 0,99) thì chấp nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiếp tục thu hẹp dải nồng độ cho đến khi nào R2 ≥ 0,99.
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp:
- Trong trường hợp khi tiến hành phân tích mẫu trắng mà có pic tại thời gian lưu hoặc trong vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike)
nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao gấp 10 lần dịên tích pic của mẫu trắng.
- Trong trường hợp mẫu trắng không có pic tại vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm dần với nồmg độ để phân tích trong 3 ngày và kiểm tra độ nhạy của pic thông qua tính năng signal-to-noise ratio của chương trình. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic DA ít nhất gấp 3 lần so với nhiễu nền. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic gấp 10 lần so với nhiễu nền.
2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp:
Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán độ lặp lại của kết quả kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩnSr :
1 n d 1 n ) X X ( S 2 2 i r − = − − = ∑ ∑ (0.1) Trong đó: Sr = độ lặp lại Std: độ lệch chuẩn
xi : kết quả thu được trên mẫu thứ i 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:
Để thử nghiệm độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu trắng là nhuyễn thể và 7 mẫu thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán kết quả thu được như sau:
spike uns m C C C R − = (0.2)
Trong đó: ⎯Rm : độ thu hồi trung bình
⎯C : giá trị trung bình của các kết quả kiểm nghiệm, được
XSpike : nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn. 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể.
Tiến hành kiểm nghiệm 36 mẫu thử đã đề cập ở Bảng 01. Quy trình xử lý mẫu thực hiện giống như trong mục 2.5.4. Sau khi có kết quả, tiến hành lấy ngẫu nhiên một số mẫu đem đi phân tích và so sánh kết quả với phương pháp phân tích DA bằng HPLC-UV để đánh giá độ tin cậy của phương pháp đối với mẫu thật cũng như các thông số liên quan khác.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định các thông số tối ưu:
Để tối ưu hóa một quy trình phân tích DA trên thiết bị LC-MS/MS, chúng ta cần tối ưu 03 công đoạn: (i) các thông số cho đầu dò MS/MS, (ii) các thông số cho sắc ký lỏng, (iii) điều kiện tách chiết.
3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS
Chúng ta cần lựa chọn được các thông số để tối ưu ion mẹ bao gồm hiệu điện thế mao quản (capillary) và hiệu điện thế cone (cone volt); tối ưu ion con bằng cách tối ưu giá trị năng lượng va chạm (collision energy). Dưới đây chúng tôi lần lượt tối ưu từn thông sô:
3.1.1.1. Capillary (hiệu điện thế mao quản): tiêm chuẩn DA thẳng vào đầu dò MS/MS và thay đổi các thông số về Capillary từ nhỏ tới lớn (cố định giá trị của các thông số khác) và chọn giá trị tối ưu capillary ứng với kết quả cường độ tín hiệu của ion [M+H]+ thu được là lớn nhất.
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 03 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 1 – Phụ lục 2). Qua bảng 03 ta thấy giá trị hiệu điện thế mao quản ở giá 2 kV là tối ưu nhất do thu được cường độ tín hiệu lớn nhất:
Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản
STT Capillary Cường độ tín hiệu
1. 1 kV 2,93 e5
2. 2 kV 1,00 e6
3. 3 kV 8,13 e5
Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV
3.1.1.2. Hiệu điện thế cone: tương tự như phần tối ưu thông số Capillary, điều chỉnh cone volt sao cho cường độ tín hiệu của ion mẹ 312 lớn nhất. Kết quả khảo sát điện thế cone và giá trị tối ưu hiệu điện thế cone được trình bày ở Bảng 04 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 2 – Phụ lục 2). Qua Bảng 04 ta thấy tại giá trị cone volt 30 eV là giá trị tối ưu do thu được cường độ tín hiệu là lớn nhất.
Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone
STT Cone volt Cường độ tín hiệu
1. 10 V 9,74 e4
2. 20 V 4,78 e5
3. 30 V 4,89 e5
4. 40 V 1,36 e5
Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V 3.1.1.3. Năng lượng va chạm
Chạy ở chếđộ Full-scan của chếđộ ESI (+) đối với ion phân tử [M+H+], đối với DA có m/z = 312: Thay đổi các giá trị năng lượng va chạm, chọn mảnh ion con và giá trị năng lượng va chạm tương ứng với giá trị mà cường độ của Ion con là lớn nhất.
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 05 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 3 – Phụ lục 2):
Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm
Cường độ tín hiệu các ion STT Năng lượng va chạm 184,51 219,31 247,64 266,25 293,78 1. 10 eV 0 0 0 0 0 2. 15 eV 0 0 19793 80749 21573 3. 20 eV 52348 22530 0 0 0 4. 25 eV 0 0 0 0 0 5. 30 eV 21304 0 0 0 0 6. 35 eV 0 0 0 0 0 7. 40 eV 0 0 0 0 0
Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA
Kết quả khảo sát: chúng tôi đã chọn được các mảnh Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của Collision energy tương ứng như sau:
Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm
STT Ion Collision energy (eV)
1. 184,51 20 eV 2. 219,31 20 eV 3. 247,64 15 eV 4. 266, 25 15 eV 5. 293,78 15 eV - H2O 184
Hình 18. Sắc ký đồở điều kiện Collision energy 15 eV
Chúng tôi chọn mảnh Ion 266 dùng đểđịnh lượng do mảnh 266,25 cho cường độ lớn nhất so với các mảnh khác.
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient.
Chúng tôi sử dụng 02 pha động tham khảo theo một số bài báo trên tạp chí ScienDirect như sau:
1. Cặp pha động 1: 0,05% TFA trong ACN (A) và 0,05% TFA trong H20 (B) Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 10,0 90,0 0,400 1 4,90 10,0 90,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 1 6,00 90,0 10,0 0,400 1 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 10,0 90,0 0,400 1
Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1