3.7.7.1. Tính tỉ số ion theo phương trình:
(%) A 100 R 2 1 A × = Trong đó: R: tỉ số ion (%)
A1: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ thấp. A2: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ cao
3.7.7.2. Dựng đồ thị hệ số tín hiệu của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính:
Y = ax + b Trong đó:
b: tung độ góc của đường chuẩn a: hệ số góc của đường chuẩn
3.7.7.4. Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu dựa theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành các nhiệm vụ của luận văn đã đề ra với kết quả như sau:
- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS: (i) Phương pháp chiết: lựa chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết là MeOH:H2O tỷ lệ 1:1. (ii) Tối ưu các thông số liên quan đến HPLC: sử dụng cột C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18); lựa chọn và sử dụng pha động là 0.1% FA trong H20 (A) và 0.1%FA trong ACN (B); tốc độ dòng 0,4 ml/phút. (iii) Tối ưu hóa các thông số của đầu dò MS/MS: hiệu điện thế mao quản (capillary = 2 kV), điện thế cone (cone volt = 30 V), năng lượng va chạm (collission energy = 20 eV và 15 eV tương ứng với 02 ion con là 184,51 và 266,25).
- Khảo sát giá trị sử dụng của phương pháp trên mẫu thật và mẫu chuẩn: (i) Khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính có nồng độ từ 0.5 ppm đến 10 ppm (R2 > 0,98). (ii) Độ nhạy của phương pháp: Giới hạn phát hiện LOD: 0,5 ppm. Giới hạn định lượng LOQ: 1,5 ppm. (iii) Độ lặp lại của phương pháp: Độ thu hồi của phương pháp: 101.2%. Độ lặp lại của phương pháp SD = 0.17 hay CV = 6.72%.
- Đã phân tích 36 mẫu nhuyễn thể tại 12 vùng thu hoạch nhuyễn thể của Việt Nam.
- Kiểm đối chứng: lấy xác suất 1 số mẫu nhuyễn thể, mẫu thêm chuẩn (spiked) và mẫu vật liệu chuẩn (CRM).
- Trong khuôn khổ luận văn, với thời gian và điều kiện hạn hẹp nên chúng tôi chỉ mới chỉ nghiên cứu trong phạm vi là phân tích DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Vì vậy mong muốn của chúng tôi là trong thời gian sắp đến
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần ThịĐà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục.
2. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết của HPLC trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
3. Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiển, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản y học, tr. 236-242.
4. Tạ Thị Thảo, Bài giảng chuyên đề “Thống kê trong hóa phân tích”, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, 2005
5. Phạm Hùng Việt (2003), Sắc kí khí, NXB Khoa học Kĩ thuật.
Tiếng Anh
6. H. Dizer, B. Fischer, A.S.A. Harabawy, M.-C. Hennion, P.-D. Hansen (2001), Toxicity of axít domoic in the marine mussel Mytilus edulis, Aquatic Toxicology, Vol.55, pp.194-156.
7. Intergovernmental Oceanographic Commission (1995), Manuals and Guides No. 31, Volume 1.
8. Jean-Philippe Antignac, Bruno Le Bizec, Fabrice Montau, Francois Andre (2003), Validation of Analytical Mehtods Based on Mass Spectrometric Detection according to “2002/657/EC” European Decision: Guideline and Application, Analytica Chimica Acta, Vol. 483, pp. 325-334.
9. Jonathan Clayden,* Benjamin Read and Katherine R. Hebditch (2005),
Chemistry of axít domoic, isoaxít domoics, and their analogues, Tetrahedron report number 720.
10.Marios Maroulis, Ioannis Monemvasiosa, Elisabeth Vardakaa, Pantelis Rigasa (2008) Determination of axít domoic in mussels by HPLC with post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazole (NBD-Cl) and fluorescence detection, Journal of Chromatography B, 876, pp. 245–251.
11.Lefebvre KA, Powell CL, Busman M, Doucette GJ, Moeller PD, Silver JB, Miller PE, Hughes MP, Singaram S, Silver MW, Tjeerdema RS (1999), Detection of axít domoic in northern anchovis and California sea lions associated with an unusual mortality event, Natural toxins , 7(3), pp.85-92.
12.Philipp Hess, Steven Morris, Lesley A. Stobo, Nigel A. Brown, John D.G. McEvoy, Glenn Kennedy, Paul B. Young, Deirdre Slattery, Evin McGovern, Terry McMahon, Susan Gallacher (2005), LC-UV and LC- MS methods for the determination of axít domoic, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 24, No. 4, 2005.
13.Quilliam MA (1995), Seafood toxins, Journal of AOAC International, 78(1), pp. 144-148.
14.Yasumoto T; Fukui M; Sasaki K; Sugiyama K (1995), Determinations of marine toxins in foods, Journal of AOAC International, 78(2), pp. 574-582.
15.Whitney PL, Baden DG (1996), Complex association and dissociation kinetics of brevetoxin binding to voltage-sensitive rat brain sodium channels, Natural toxins, 4, pp. 261-270.
PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN
1. Nhóm ASP Axít domoic
2. Nhóm DSP
2.1 Dinophysis Toxin
2.2 Okadaic Acid
2.4 Yessotoxin
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU 1. Khảo sát capillary
Hình 32. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 1 kV
Hình 34. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 3 kV
Hình 35. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 4 kV Nhận xét: tại điều kiện capillary = 2 kV là tối ưu nhất.
2. Khảo sát cone volt
Hình 36. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 10 V
Hình 38. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 30 V
Hình 40. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 50 V Nhận xét: Tại điều kiện 30 V là tối ưu nhất và ion mẹ là 312
Hình 42. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 10 eV
Hình 46. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 30 eV
Hình 48. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 40 eV Nhận xét: Tổng hợp tín hiệu của các mảnh ion con (5 mảnh) ta có bảng tóm tắt như sau:
Mass Collision Energy
10 15 20 25 30 35 40 184.51 52348 21304 184.92 16651 184 219.31 22530 219.92 17764 219 247.64 19793 247.84 13518 248.04 11555 247 265.65 40379 265.85 17217 266.05 25038 266.25 80749 266 293.58 14042 293.78 21573 294
PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH
Hình 49. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 0.5 ppm
Hình 53. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 5 ppm
Hình 55. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ 10 ppm 1. Đường tuyến tính của Ion 219
PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV
Hình 76. Đường chuẩn chạy DA bằng HPLC-UV
Hình 78. Kết quả chạy mẫu Spiked 2.5 ppm
Hình 80. Kết quả chạy mẫu Tu hài tại Vân Đồn
Hình 84. Kết quả chạy mẫu CRM trên HPLC
Hình 85. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS