Theo dự báo của Uỷ ban Dân số và Phát triển của Liên hợp quốc, vào giữa thế kỉ XXI dân số thế giới sẽ tăng thêm khoảng 3 tỉ người. Dân số ngày càng tăng nhanh đã tạo ra gánh nặng cho nền sản suất nông nhiệp lương thực, vì cùng với một diện tích canh tác nhất định và đang có xu hướng bị thu hẹp lại phải cung cấp đủ số lượng lương thực cho số đầu người luôn gia tăng. Để tăng năng suất lao động, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp đan xen như: thâm canh tăng vụ, cải tiến giống…một trong những biện pháp không thể thiếu là sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. 10Hóa chất bảo vệ thực vật (HC BVTV) được coi là một vũ khí có hiệu quả của con người trong việc phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng. Bên cạnh ưu điểm là bảo vệ năng suất cây trồng, HC BVTV còn gây ra nhiều tác hại khác như làm ô nhiễm môi trường, gây độc cho người và gia súc, tăng chi phí sản xuất và nhất là để lại tồn dư trong nông sản gây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe người tiêu dùng. Tác động tiêu cực của HC BVTV càng trở nên nghiêm trọng khi con người sử dụng không đúng cách và quá lạm dụng vào thuốc.Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ có khả năng phân tích cùng một lúc hàng trăm chất cho độ chính xác cao, rất hiệu quả trong phân tích HC BVTV trong các mẫu rau bởi 1 lần bơm mẫu sẽ có sàng lọc được nhiều chất. Phân tích định tính, định lượng chính xác các thành phần của HC BVTV trong mẫu rau bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ là việc rất cần thiết, giúp cho quá trình sàng lọc sản phẩm sạch có giá trị kinh tế cao có được kết quả xét nghiệm chính xác hơn, nhanh hơn. Lượng mẫu phân tích lấy ít hơn do độ nhạy của thiết bị cao.
Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh MỞ ĐẦU Theo dự báo Uỷ ban Dân số Phát triển Liên hợp quốc, vào kỉ XXI dân số giới tăng thêm khoảng tỉ người Dân số ngày tăng nhanh tạo gánh nặng cho sản suất nông nhiệp lương thực, với diện tích canh tác định có xu hướng bị thu hẹp lại phải cung cấp đủ số lượng lương thực cho số đầu người gia tăng Để tăng suất lao động, người ta sử dụng nhiều biện pháp đan xen như: thâm canh tăng vụ, cải tiến giống…một biện pháp thiếu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật [10] Hóa chất bảo vệ thực vật (HC BVTV) coi vũ khí có hiệu người việc phòng chống dịch hại, bảo vệ trồng Bên cạnh ưu điểm bảo vệ suất trồng, HC BVTV gây nhiều tác hại khác làm ô nhiễm môi trường, gây độc cho người gia súc, tăng chi phí sản xuất để lại tồn dư nông sản gây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản sức khỏe người tiêu dùng Tác động tiêu cực HC BVTV trở nên nghiêm trọng người sử dụng không cách lạm dụng vào thuốc Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ có khả phân tích lúc hàng trăm chất cho độ xác cao, hiệu phân tích HC BVTV mẫu rau lần bơm mẫu có sàng lọc nhiều chất Phân tích định tính, định lượng xác thành phần HC BVTV mẫu rau phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ việc cần thiết, giúp cho trình sàng lọc sản phẩm có giá trị kinh tế cao có kết xét nghiệm xác hơn, nhanh Lượng mẫu phân tích lấy độ nhạy thiết bị cao Với lí trên, thực đề tài: “Xác định dư lượng số hóa chất bảo vệ thực vật nhóm Pyrethroid Lân hữu vài loại rau phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ” Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Với mục tiêu thực đề tài là: Tiến hành phân tích định tính xác định dư lượng loại hóa chất bảo vệ thực vật (Cypermethrin, Permethrin, Chlorpyriphos, Metalaxyl, Malathion) mẫu rau Để hoàn thoành mục tiêu trên, tiến hành nghiên cứu nội dung, bao gồm: Đánh giá điều kiện phân tích độ ổn định GC-MS phân tích hóa chất bảo vệ thực vật Đánh giá phương pháp phân tích Tiến hành phân tích thực nghiệm xác định dư lượng số hóa chất bảo vệ thực vật nhóm Pyrethroid Lân hữu có 10 loại rau địa bàn Hà Nội Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hóa chất bảo vệ thực vật 1.1.1 Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên Hiệp Quốc (FAO) đưa định nghĩa hoàn chỉnh hóa chất bảo vệ thực vật (HC BVTV) sau: “ HC BVTV hợp chất hay hỗn hợp dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt kiểm soát tác nhân gây hại bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh người động vật, phận không mong muốn thực vật động vật gây hại ảnh hưởng đến trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi hợp chất phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay đối tượng khác thể chúng HC BVTV dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa ngăn chặn rụng sớm Cũng dùng HC BVTV cho trồng trước sau thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trình vận chuyển” [18] 1.1.2 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật theo nguồn gốc hóa học Có nhiều cách phân loại HC BVTV như: Phân loại theo công dụng, theo nhóm độc, theo thời gian phân hủy… [25] Tuy nhiên phạm vi nội dung Đồ án xin phân loại HC BVTV theo nguồn gốc hóa học Căn vào chất hóa học loại HC BVTV, chúng phân chia thành nhóm khác + Nhóm hợp chất clo hữu (cơ clor): HC BVTV Clo hữu hợp chất hữu hình thành thay nguyên tử hydro phân tử hydrocarbon dẫn xuất nguyên tử clo Trong phân tử hợp chất tồn vòng benzen dị vòng (O, N, S…), thường dẫn xuất clo số hợp chất Diphenylethane, Cyclodiene, Benzene, Hexane… Đặc điểm quan trọng hợp chất độc tính cao, Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh phổ tác động rộng chọn lọc bền vững môi trường, thời gian phân hủy dài, chúng bị đào thải tích lũy vào thể sinh vật qua chuỗi thức ăn Chính dư lượng HC BVTV nông sản, tích lũy đầu độc cao với thể người, động vật mà ngày đa số HC BVTV Clo hữu bị cấm sử dụng Điển hình cho chất bị cấm sử dụng như: DDT, Chlordane, Toxaphene, Dieldrin, Aldrin, Endrin ; số chất dùng giới hạn như: Difocol, Methoxychlor Hình 1.1: Công thức cấu tạo DDT + Nhóm hợp chất Lân hữu (phosphor hữu cơ) HC BVTV nhóm lân hữu chủ yếu hợp chất Photpho hóa trị V, chúng este acid phosphoric (H 3PO4) dẫn xuất Các hợp chất phosphor có độc tính cao nên hiệu lực diệt trừ sâu hại cao nhanh chóng, phổ tác dụng rộng, bền vững môi trường kiềm axit Cơ chế hoạt động nhóm dực nguyên tắc: ức chế enzyme Cholinesterase (ChE) không phục hồi enzyme ChE bị phosphoryl hóa (WHO, 1996) Hậu làm ứ động Acetylcholine gây rối loạn dẫn truyền hệ Cholonergic Nhiễm độc Lân hữu nhiễm độc Acetylcholine nội sinh Acetylcholine số chất dẫn truyền luồng thần kinh quan trọng chi phối truyền dọc xung thần kinh qua chỗ nối synaptic số trường hợp qua chỗ nối thần kinh Điển hình nhóm chất bao gồm: Methyl Parathion, Ethyl Parathion, Diethyl phosphorofluoridate, Dimefox, Tetraethyl pyrophosphat (TEPP),…Cho Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh đến có khoảng 100 chất khác đem vào thương mại hóa Đây nhóm thuốc hữu thông dụng dùng Hình 1.2: Công thức cấu tạo Dimefox + Nhóm hợp chất Carbamat Đây nhóm thuốc dùng rộng rãi thuốc tương đối rẻ tiền, hiệu lực cao mà tồn lưu môi trường Thuốc dẫn xuất axit cacbamic Có chứa nhóm phụ Dithiocacbamates, Thiocarbamates mang Lưu huỳnh Ngoài dạng thuốc trừ sâu có thuốc trừ nấm bệnh, trừ cỏ, trừ ốc sên… Đối với động vật, thuốc Carbamat gây tổn thương cho hệ thần kinh số khác gây độc cho động vật có vú bao gồm người Hợp chất nhóm không tích lũy mô mỡ tính độc chúng thường ngắn sinh vật phục hồi Các hóa chất nhóm carbamat thông dụng như: Carbaryl (Sevin), Aldicarb (Temik) Methomyl Ester cacbamat dẫn xuất acid carbamic (H2N-COOH) không bền vững dễ phân hủy thành CO2 NH3 Hình 1.3: Công thức cấu tạo Carbaryl + Nhóm hợp chất Pyrethroid Là thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ tính sát trùng hoa thủy cúc Crysanthemum thường gặp C.cineraraefolium với tính diệt côn trùng Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh mạnh mẽ, Pyrethrin có ưu điểm tồn lưu môi trường Pyrethrin chất Carbamat chất độc kênh muối (sodium channel) màng thần kinh Các Pyrethroids thực chất chất gây độc chức năng, hậu xấu thuốc mang tính thứ cấp hậu kích thích độ hệ thần kinh Một số chất thuộc nhóm như: Allethrin, Barthrin, Bioallethrin, Bioresmethrin, Cismethrin, Fenfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin… Hình 1.4: Công thức cấu tạo Allethrin 1.1.3 Tác hại hóa chất bảo vệ thực vật [10] Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật độc với người động vật máu nóng mức độ khác Theo đặc tính, HC BVTV chia làm hai loại: chất độc cấp tính chất độc mãn tính - Chất độc cấp tính: mức độ gây độc phụ thuộc vào lượng thuốc xâm nhập vào thể Chúng không đủ khả gây tử vong, bị phân giải tiết Loại bao gồm chất: Pyrethroid, hợp chất Photpho hữu cơ, - Carbamat, thuốc có nguồn gốc sinh vật Chất độc mãn tính: có khả tích lũy lâu dài thể chúng bền, khó bị phân giải tiết Những chất gồm nhiều hợp chất chứa Clo hữu cơ, thạch tím (Asen), chì (Pb), thủy ngân (Hg) Đây loại nguy hiểm Hóa chất bảo vệ thực vật xâm nhập vào thể người động vật nhiều đường khác Ba đường là: hô hấp, tiêu hóa tiếp xúc trực tiếp Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật người bị nhiễm độc cấp tĩnh hay mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng thuốc Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh + Nhiễm độc cấp tính: Là nhiễm độc tức thời có lượng đủ lớn hóa chất xâm nhập vào thể Triệu chứng bệnh tỉ lệ với việc tiếp xúc số trường hợp nặng dẫn tới tử vong Biểu bệnh lí nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, buồn nôn, hoa mắt chóng mặt, khô họng, ngủ, tăng tiết nước bọt, yếu cơ, chảy nước mắt, sảy thai, đặc biệt gây tử vong + Nhiễm độc mãn tính: Là nhiễm độc gây tích lũy thể Thông thường biểu sau lần nhiễm Sau thời gian dài, lượng chất độc lớn tích tụ thể gây triệu chứng lâm sàng Biểu bệnh lí nhiễm độc mãn tính là: kích thích tế bào ung thư phát triển gây quái thai, dị dạng, suy giảm trí nhớ khả tập trung, suy nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận não 1.1.4 Tình hình tồn dư loại HC BVTV rau Theo báo cáo cục bảo vệ thực vật, có 23% số hộ dân vi phạm quy định sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, dẫn đến tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật nông sản Một số loại hóa chất bị cấm có nhiều người tìm cách đưa nông thôn Số mẫu rau tươi có lượng hóa chất chiếm 30-60%, số mẫu có dư lượng vượt giới hạn cho phép chiếm từ 4-16%, số HC BVTV bị cấm sử dụng Methamidophos dư lượng rau [7] Trong năm 2013, Cục Bảo vệ thực vật lấy 25 mẫu rau mẫu tỉnh phía bắc (TP Hà Nội tỉnh Vĩnh Phúc) để kiểm định Kết có 11 mẫu rau có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật mức độ khác Ở tỉnh phía Nam, 35 mẫu rau mẫu Tp Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tiền Giang kết 50% mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật mức độ khác Tại TP Hồ Chí Minh đầu năm 2013, kết kiểm nghiệm 2.200 mẫu rau, chợ đầu mối (Bình Điền, Hóc Môn, Thủ Đức) phát 50 mẫu dương tính (tỉ lệ 2,4%) cao so với kì năm 2012 1,3% Còn Bình Dương, phân Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh tích 310 mẫu rau lấy chợ, vùng sản xuất, bếp ăn tập thể tám tháng đầu năm 2013 có gần 80 mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật [11] Trên giới, Ấn Độ, điều tra Bộ Nông nghiệp Ấn Độ tiến hành tiến hành năm từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 10 năm 2014 toàn đất nước Ấn Độ Kết 18% rau 12% nội địa nhập có dư lượng thuốc trừ sâu, kể loại thuốc trừ sâu bị cấm, 4% lượng rau 2% lượng có dư lượng thuốc trừ sâu cao mức cho phép Khoảng 18% (664 mẫu) tổng số 3.648 mẫu rau mướp tây, cà chua, bắp cải súp lơ có dư lượng thuốc trừ sâu Các loại rau bắp cải, cà chua có dư lượng thuốc trừ sâu lớn Các loại thuốc trừ sâu tìm thấy chủ yếu Chlorpyriphos, Monocrotophos, Profenophos Cypermethrin [1] 1.2 Tổng quan HC BVTV nghiên cứu 1.2.1 Nhóm hợp chất Pyrethroid 1.2.1.1 Cypermethrin [4,10] Theo IUPAC, Cypermethrin có tên gọi khác Cyano-(3- phenoxyphenyl)methyl]3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1carboxylate, có công thức phân tử C22H19Cl2NO3, khối lượng phân tử: 416,3 g/mol Có công thức cấu tạo sau: Hình 1.5: Công thức cấu tạo Cypermethrin Đặc tính kỹ thuật: Ít tan nước, tan tốt dung môi hữu aceton (620g/L), xylen (351 g/L) cyclohexanone (515 g/L) 25 0C Tương đối bền môi trường trung tính axit nhẹ, thủy phân môi trường kiềm, quang giải kém; không ăn mòn kim loại; thuộc nhóm độc II Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Cypermethrin tác dụng gây độc nhanh với hệ thần kinh côn trùng Cơ chế tác động Cypermethrin gây ảnh hưởng đến vận chuyển Na qua màng tế bào thần kinh Cypermethrin làm tăng độ thấm của Na qua màng tế bào thần kinh, kết gây nên lặp lặp lại kéo dài xung động thần kinh quan cảm giác làm đình trệ xung động sợi thần kinh Ngoài ra, cypermethrin gây nên tượng xung huyết (congestion), xuất huyết (haemorrhage), hoại tử (necrosis), teo nhân (pyknosis) số quan não, gan, thận mang cá 1.2.1.2 Permethrin Theo IUPAC, Permethrin có tên gọi khác 3-Phenoxybenzyl (1RS)cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate, có công thức phân tử C21H20Cl2O3, khối lượng phân tử 391,29 g/mol Có công thức cấu tạo sau: Hình 1.6: Công thức cấu tạo Permethrin Permethrin dạng tinh thể không màu, nóng chảy 34oC, sôi 200oC không tan nước, tan tốt dung môi không phân cực Hexane, Xylene Bền môi trường axit, thủy phân môi trường kiềm Permethrin hóa chất diệt côn trùng thông dụng, sinh vật ký sinh Hóa chất chất gây độc tố cho thần kinh, làm tăng độ thấm Na qua màng tế bào thần kinh, kết gây nên lặp lặp lại kéo dài xung động thần kinh quan cảm giác làm đình trệ xung động sợi thần kinh Hóa chất không gây hại nhanh động vật có vú chim, hóa chất độc mèo cá [23] Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh 1.2.2 Nhóm hợp chất Lân hữu 1.2.2.1 Chlorpyriphos [4,10] Theo IUPAC, Chlorpyriphos có tên gọi khác là: O,O-Diethyl O-3,5,6trichloropyridin-2-yl phosphorothioate, có công thức phân tử C 9H11Cl3NO3PS, khối lượng phân tử 350,59 g/mol Có công thức cấu tạo hình vẽ: Hình 1.7: Công thức cấu tạo Chlorpyriphos Chlorpyriphos tồn dạng tinh thể, nóng chảy 42 oC, mật độ 1,4 g/cm3 Chlopyriphos tác động lên hệ thần kinh côn trùng thông qua việc ức chế men ChE (Cholinesterase), ngăn cản trình hình thành nên Acetylcholinesterase gây nhiễm độc côn trùng chủ yếu phosphoryl hóa Acetylcholinesterase (AChE) đầu tận thần kinh Liều gây độc LC50 với cá vàng 0,18 mg/l 1.2.2.2 Metalaxyl Theo IUPAC, Metalaxyl có tên gọi khác là: 2-[(2,6-dimethylphenyl)- (2methoxy-1-oxoethyl) amino]propanoic acid methyl ester, có công thức phân tử C15H21NO4, khối lượng phân tử 279,33 g/mol Công thức cấu tạo hình vẽ: Hình 1.8: Công thức cấu tạo Metalaxyl Metalaxyl có màu nâu nhạt, tồn nhiều dạng khác như: bột mịn, đông đặc, dạng tuyết hay dạng viên; nóng chảy 295,9oC, mật độ 1,20g/cm3 Hoạt chất Metalaxyl có tác dụng nội hấp lưu dẫn mạnh, thuốc hấp thu qua lá, thân, rễ trồng, sau vận chuyển, lưu dẫn cây, ức chế tổng hợp Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 10 Đồ án tốt nghiệp + GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn Tiến hành khảo sát điểm nồng độ khác nhau: 50, 200, 500, 1000, 2000, 2500 ng/ml, sau thu diện tích peak nồng độ tiến hành vè đồ thị phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Quan sát xác định khoảng tuyến tính tiến hành xây dựng đường chuẩn cho mẫu chuẩn + Giới hạn phát LOD Chúng tiến hành xác định LOD sau: Phân tích mẫu chuẩn nồng độ thấp xuất tín hiệu chất phân tích Sau xác định tỉ lệ tín hiệu chất phân tích chia cho tín hiệu (S/N) LOD chấp nhận nồng độ mà S/N=3 + Giới hạn định lượng LOQ Vì LOQ xác định nồng độ chất phân tích mà chiều cao peak khoảng 10 lần chiều cao nhiễu đường (S/N=10) Do xác định LOQ từ LOD theo công thức: LOQ = 10/3* LOD + Xác định độ xác (độ lặp lại) phép đo Tiến hành pha chất chuẩn nồng độ đầu khoảng tuyến tính gồm: 50, 200, 500 ppb Tiên hành đo diện tích chất chuẩn nồng độ lặp lại lần xác định độ xác phép đo + Khảo sát độ lặp lại quy trình phân tích Độ lặp lại quy trình phân tích đanh giá thông qua việc phân tích mẫu rau thêm chuẩn nồng độ chất 500ng/g rau 2000ng/g rau Quá trinh xử lý mẫu phân tích dược thực theo quy trình nêu mục 2.3.3 mục 2.3.4 Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 30 Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Phương pháp chiết tách mẫu theo AOAC Quy trình: Mẫu rau (15g) ) 15ml dd 1% acid acetic acetonitrile Ống li tâm 2,5g NaOAc.3H2O Lắc vortex+ Ly tâm Bã Hút 1ml dịch 2ml hh PSA+MgSO4 Lắc vortex+ Ly tâm Thu mẫu chiết Phân tích GC-MS Hình 2.1: Quy trình chiết tách mẫu theo AOAC Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 31 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Thuyết minh quy trình Cân xác khoảng 15g mẫu vào ống ly tâm 50 ml - Mẫu QC: Thêm 150 µl chuẩn hỗn hợp nồng độ 10 µg/ml - Thêm 15 ml dung dịch 1% acid acetic acetonitril vào mẫu thử, mẫu QC, lắc trộn tay, Vortex 30s - Cho từ từ hỗn hợp muối chiết chuẩn bị sẵn (6g MgSO4 khan 1,5 g NaOAc khan 2,5 g NaOAc.3H2O) - Lắc trộn tay phút, Vortex 30s, đem ly tâm 6000 rpm phút - Hút ml dịch phía vào ống ly tâm ml có hỗn hợp 0,05 g PSA 0,15 g MgSO4 khan chuẩn bị sẵn - Lắc trộn máy lắc vortex 30s, đem ly tâm 13000 rpm phút - Hút dịch sau ly tâm vào vial, đo GC – MS 2.3.4 Phương pháp sắc ký khí khối phổ - Máy sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS QP 2010 hãng Shimazu Pha tĩnh GC cột mao quản DB-5ms, dài 30m, đường kính 0,25mm Điều kiện GC: - Cột sắc ký DB-5ms (30m*250μm*0,25μm) - Khí mang: Helium Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 32 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh - Tốc độ khí mang: Đẳng dòng, ml/phút - Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 2500C - Aux Heaters: 2800C - Thể tích tiêm mẫu: 1μl - Chế độ tiêm mẫu: không chia dòng - Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban đầu 50 oC (giữ 1phút), tăng 25oC/phút lên 125oC, sau tăng 10oC/phút lên 300oC (giữ 5phút) Tổng thời gian phân tích 26,4phút Điều kiện MS : - Nguồn ion hóa: EI Năng lượng ion hóa 70ev Nhiệt độ buồng ion: 230oC Thời gian cắt dung môi: 5phút Chế độ phân tích SIM Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 33 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát điều kiện phân tích GC/MS Từ kết phân tích SIM xác định thời gian lưu mảnh phổ cần phân tích, tỷ lệ mảnh phổ bảng sau: Bảng 3.1: Kết khảo sát mảnh phổ, thời gian lưu HC BVTV dùng để phân tích định tính, định lượng STT Tên chất Chlorpyripos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin m/z 258; 260; 314; 316 91; 217;163 127; 163; 168; 183 146; 234; 249; 190 99; 127;173 Thời gian lưu (phút) 14.330 21.321 13.683 14.182 20.591 Kết phân tích mẫu hỗn hợp sắc kí đồ hình 3.1 cho ta thấy chất phân tích tách hoàn toàn Hình 3.1: Sắc kí đồ hỗn hợp nồng độ 50ppb 3.2 Kết khảo sát độ ổn định GC/MS ngày Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 34 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Kết khảo sát độ ổn định GC/MS ngày đánh giá thông qua việc phân tích điểm nồng độ 50ppb 2000ppb, điểm phân tích lần điều kiện sắc kí người phân tích Kết đánh giá thông qua tín hiệu thời gian lưu diện tích peak bảng 3.2; 3.3; 3.4; 3.5 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối thiết bị tốt Bảng 3.2: Kết đánh giá độ ổn định GC/MS thông qua thời gian lưu (tR) nồng độ 50ppb Lần bơm mẫu STT Tên chất Chlorpyripos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin 14,336 21,311 13,676 14,175 20,580 14,325 21,330 13,690 14,189 20.584 RSD(%) 14,323 21,309 13,688 14,190 20,605 14,336 21,332 13,678 14,173 20,596 0,049 0,057 0,047 0,063 0,055 Bảng 3.3: kết đánh giá độ ổn định GC/MS thông qua thời gian lưu (tR) nồng độ 500ppb STT Tên chất Chloryripos Cypermethri n Metalaxyl Malathion Permethrin 14,310 21,279 Lần bơm mẫu 14,353 14,321 21,363 21,281 14,336 21,361 0,151 0,218 13,667 14,160 20,550 13,701 14,203 20,628 13,663 14,163 20,556 0,150 0,165 0,212 13,700 14,201 20,629 RSD (%) Kết phân tích định lượng chất có từ đồng phân trở nên thường đưa dạng tổng số đồng phân đánh giá độ ổn định thiết bị thông qua diện tích peak tín hiệu diện tích đánh giá dạng tổng đồng phân Kết bảng 3.4; 3.5 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối khảo sát độ ổn định thiết bị hai nồng độ 50ppb 2000ppb có giá trị từ 1,11%1,64% Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 35 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Bảng 3.4: Kết đánh giá độ ổn định GC/MS thông qua diện tích peak (Si) nồng độ 50ppb STT Tên chất Lần bơm mẫu 1 Chloryripos Cypermethri n Metalaxyl Malathion Permethrin RSD (%) 25023 64568 25178 65231 24088 66598 25783 66967 2,8 1,5 11186 26978 40987 11983 25825 42112 12586 25972 41672 10825 27609 41514 6,8 3,2 3,6 Bảng 3.5: Kết đánh giá độ ổn định GC/MS thông qua diện tích peak (Si) nồng độ 500ppb STT Tên chất 1 Chloryripos Cypermethri n Metalaxyl Malathion Permethrin Lần bơm mẫu RSD (%) 245708 931783 241872 949853 240921 945318 241363 940178 0,9 0,8 127351 361918 540118 128325 363597 541323 127730 364147 538330 127198 362118 541421 0,4 0,3 0,3 3.3 Kết đánh giá phương pháp phân tích 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn Lập đường chuẩn yêu cầu phương pháp phân tích Từ đường chuẩn ta biết khoảng tuyến tính chất phân tích, từ đưa nồng độ mẫu thực nằm khoảng tuyến tính Chúng xây dựng đường chuẩn sau: pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 50, 200, 500, 1000, 2000, 2500ppb Các dung dịch chuẩn pha dung môi acetonitril Sau đem đo điều kiện trên, kết thu bảng sau: Bảng 3.6: Sự phụ thuộc diện tích peak lên nồng độ chất Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 36 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Nồn g độ (ppb) Diện tích Cypermethri n (2) 65841 Metalaxyl (3) Malathion (4) 50 Chlopyripho s (1) 25018 9645 26596 Permethri n (5) 40578 200 96906 315941 47052 128281 192482 500 242466 941783 127651 362945 540048 1000 484852 1883568 255138 725858 1019765 2000 969860 3790765 530928 1344879 2200185 2500 1077897 4298567 612634 2077453 2409289 Bảng 3.7: Kết xây dựng đường ngoại chuẩn STT Tên chất Chlopyriphos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin Phương trình hồi quy, hệ số tương quan Y= 484,72X+ 278,89; r2=0,9998 Y= 1914X- 34019; r2=0,9998 Y= 256,67X- 1958,2,1; r2=0,9999 Y= 723,85X-7111,9; r2=0,9998 Y= 1111,5X-18532 ; r2=0,9999 Hình 3.2: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Chlorpyripos đường chuẩn Hình 3.3: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Cypermethrin đường chuẩn Hình 3.4: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Metalaxyl đường chuẩn Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 37 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Hình 3.5: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Malathion đường chuẩn Hình 3.6: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Permethrin đường chuẩn Từ đồ thị ta thấy khoảng nồng độ 50ppb- 2000ppb mối quan hệ diện tích peak nồng độ chất tuyến tính 3.3.2 Giới hạn phát LOD, giới hạn định lượng LOQ Để xác định giới hạn dùng hỗn hợp 500ppb tiến hành pha loãng thu chiều cao chất phân tích gấp lần tín hiệu đường kết thu sau: giới hạn phát Chlorpyripos, Cypermethrin, Metlaxyl, Malathion, Permethrin 0,002mg/kg (2ppb) Giới hạn định lượng LOQ xem nồng độ thấp mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu Theo lí thuyết thống kê hóa phân tích LOQ = 3,33 LOD Do giới hạn phát Chlopyriphos, Cypermethrin, Metalaxyl, Malathion, Permethrin 0,007mg/kg (7ppb) 3.3.3 Kết độ xác phép đo Pha mẫu nồng độ đầu, cuối khoảng tuyến tính Thực đo mẫu lần ta có kết sau: Bảng 3.8: Sai sốcủa phép đo nồng độ khác Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 38 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Diện tích peak(Si) Diện tích peak (St) Nồng độ (ppb) Lần đo Chlophyriphos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin Chlorphyriphos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin Chlophyriphos Cypermethrin Metalaxyl Malathion Permethrin 50 200 500 25023 64568 11186 26978 40987 90981 314515 46978 130496 189153 245708 931783 127351 361918 540118 %Xtb 25178 24088 25783 24515 2,9 65231 11983 25825 42112 97237 324865 46530 120124 190297 241872 949853 128325 363597 541323 66598 12586 25972 41672 104213 322187 46782 127178 196695 240921 945318 127730 364147 538330 66967 10825 27609 41514 95193 302197 47918 127326 193783 241363 940178 127198 362118 541421 61686 10848 29014 37043 92223 348801 47778 144565 189354 242639 923031 132808 355297 528864 6,7 7,5 8,3 12,2 5,6 9,42 1,7 12,6 1,7 0,7 2,0 3,9 2,2 2,9 Nhận xét: phần trăNhận xét: Phần trăm sai số phép đo mức nồng độ có giá trị từ 0,3-12,6 % nằm giới hạn cho phép AOAC 3.4 Kết phân tích mẫu thực tế Sau khảo sát thực tế mẫu rau địa bàn Hà Nội phương pháp Chúng có kết sau: Bảng 3.9: Kết phân tích dư lượng HC loại rau (mg/kg) theo AOAC STT Mã số C1 C2 C3 C4 C5 Chlorphyripho s 211.38 14.86 0.16 KPH KPH Cypermethri n 60.23 6.55 KPH 0.029 KPH Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Metalaxy l KPH KPH KPH KPH KPH Malathio n KPH KPH KPH KPH KPH Permethri n KPH KPH KPH KPH KPH Page 39 Đồ án tốt nghiệp 10 GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh C6 1.37 0.59 C7 C8 C9 KPH KPH C10 Ghi chú: KPH- không phát KPH KPH KPH KPH KPH KPH Bảng 3.10: Hàm lượng cho phép loại rau Mã Chlorphyriphos Cypermethri Metalaxy Malathio Permethri STT rau n l n n C1 0.2 2 C2 0.2 C3 0.2 C4 0.5 C5 0.1 2 C6 0.5 C7 0.2 0.5 0.2 0.5 C8 0.05 0.5 0.5 0.5 C9 10 C10 0.5 0.5 0.5 Nhận xét: Đã khảo sát dư lượng số hóa chất bảo vệ thực vật 10 loại rau Qua bảng (3.5) so sánh với hàm lượng giới hạn cho phép (3.6) cho ta - thấy: Các mẫu rau chứa HC BVTV bao gồm Các mẫu rau chứa hàm lượng lớn hàm lượng giới hạn cho phép bao gồm Nhiều mẫu rau địa bàn Hà Nội chứa nhiều dư lượng HC BVTV vượt giới hạn cho phép TCVN Vì cần có chế quản lý, kiểm tra chặt chẽ mặt hàng rau để nâng cao chất lượng sống cho người vật nuôi Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 40 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.Đã khảo sát phương pháp phân tích HC BVTV ( Chlorpyripos, Cypermethrin, Metalaxyl, Malathion, Permethrin) mẫu rau phương pháp sắc kí khí detector khối phổ 2.Tiến hành đánh giá quy trình phân tích thông qua khảo sát yếu tố - Khảo sát điều kiện GC/MS - Khảo sát độ ổn định thiết bị GC/MS - Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng - Khảo sát độ lặp lại phương pháp phân tích Tiến hành thực nhiệm phân tích HC BVTC 10 loại rau thị trường Hà Nội Kiến nghị 1.Tiếp tục nghiên cứu quy trình phân tích đa dư lượng HC BVTV mẫu rau phương pháp GC/MS Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 41 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh 2.Cần có chế quản lý chặt chẽ sản phẩm rau không rõ nguồn gốc mặt hàng đa dạng dễ tồn dư HC BVTV ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trung tâm nghiên cứu tư vấn tiêu dùng (2009), Báo cáo thực trạng an toàn rau, củ, thị trường Trần Việt Hùng (2005), Các kỹ thuật xử lý mẫu phương pháp phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu, chuyên đề sâu Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thanh Hải (2000), Cơ sở sắc ký khí, Hà Nội 2000 Trần Việt Hùng (2005), Độc tính ảnh hưởng việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đến môi trường sức khỏe người, chuyên đề sâu Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Khoa học Kỹ thuật Trần Việt Hùng (2006), Khảo sát nghiên cứu phân tích dư lượng số hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu sạch, Luận án tiến sĩ, Trường Đại học dược Hà Nội Trần Việt Hùng (2003), Một số phương pháp chiết đại, Thông báo kiểm nghiệm, số QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm Phạm Văn Hùng (2005), Sắc ký khí sở lý thuyết khả ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội 10 Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh Vĩnh Phúc (2008), Thuốc bảo vệ thực vật tác động chúng 11 Cổng thông tin điện tử Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (2013) Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 42 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh 12 Đặng Văn Khánh (2010), Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm Carbamat số loại rau phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 13 Nguyễn Thị Bích Thu (2009); Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khí khối phổ để phân tích dư lượng số hóa chất bảo vệ thực vật thường dùng B Tiếng Anh 14 AOAC Official Method 2007.01 “Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate”, Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry 15 AOAC International (1985), “AOAC Official Method 985.22 Organochlorine and Organophosphorus Pesticide Residues – Gas Chromatographic Method” AOAC Official method 16 AOAC International (1988), “AOAC Official Method 998.01 Synthetic Pyrethroids in Agricultural Products - Multiresidue Gas Chromatographic Method” AOAC Official Method 17 Diazinon, Evironmental Health Criteria 198, International Programme on Chemical Safety, World Health Oganisation, Geneva, 1998, p12 18 Food and Agriculture Organization of the United Nations (2002), International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides 19 Grou E., Radulescu V (1983), Direct determination of some carbamat pesticides in water and soil by high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography, 260, pp 502-506 20 Grob, K (1993), Classical Split and Splitness Injection in Capillary Gas Chromatography, 3rd.ed., Heuthig, Heidelberg 21 Harold M.McNair, Jame M.Miller (1998), Basic Gas Chromatography, John Willey & Sons, Inc 22 Liu M., Yang H., Liu H., Han P., Wang X., Zhang S., Wu Y (2007), Development of high-performance liquid chromatography and non-aqueous capillary electrophoresis methods for the determination of fenoxycarb residues in wheat samples, Journal of the Science of Food and Agriculture, Vol.88, Issue 23 Morgan, D.P.1982 (Jan) Recognition and management of pesticide poisonongs Third edition U.S Enviromental Protection Agency.Washington, DC:U.S Government Printing Office Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 43 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh 24 Tethgatuk P Jinsart W and ArnoldP (2001), Determination of Organophosphate Pesticides in Vegetable Farm Drained Water Using Solid Phase Extraction Followed by High Performace Liquid Chromatography, J Sci Res Chula Univ, Vol 26 No.1, pp.35-47 25 T Visser, M J Verdenbregt and A.P J Mde Jong, L.A.van Ginkel, H.J vanRossurn and R.W Stepheny Cryotrapping gas chrmatography – fourier trasform infrated spectrometry: anew technique to confirm the presence of bete – agonists in animal material Analytical Chumuca Acta 26 Winefordner J.D (1998), Solid-Phase Extraction, principle and pratice, Chemical analysis, volume 47, A Willey-internscience publication, John Wiley & Sons, Inc Nhóm sinh viên: Đặng Thị Lành - Nguyễn Thị Thùy Trang Page 44 ... tồn dư loại HC BVTV rau Theo báo cáo cục bảo vệ thực vật, có 23% số hộ dân vi phạm quy định sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, dẫn đến tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật nông sản Một số loại hóa chất. .. Văn Khánh (2010) [12], Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm Carbamat số loại rau phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Đề tài tiến hành: - Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký. .. môi hữu mà rửa giải hay chiết hợp chất quan tâm để lại tạp chất không loại trình rửa 1.5 Tổng quan phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ Phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ phương pháp