Xác định hoạt độ enzym β Galactosidase bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Chất nền : ganglioside GM1, lactosylceramides, lactose,và nhiều glycoprotein.● Nó cũng có thể tách fucosides và arabinosides nhưng vớihiệu quả thấp hơn nhiềuβ galactosidase có nhiều đồng phân như :betagalactosidase (EBG), betaglucosidase ,6phosphobetagalactosidase, betamannosidase, vàlactasephlorizin hydrolase● . β galactosidase bị ức chế bởi Lribose , chất ức chếkhông cạnh tranh iốt , và các chất ức chế cạnhtranh phenylthyl thiobetaDgalactoside (PETG),Dgalactonolactone , isopropyl thiobetaDgalactoside(IPTG) , và galactose

Xác định hoạt độ enzym

β- Galactosidase bằng phương pháp quang

phổ hấp thụ phân tử

Giảng viên: PGS.TS Quản Lê Hà Sinh viên: Nguyễn Thị Thúy Ngân

MSSV: 20132749

Sơ lược về enzym β- Galactosidase

● Chất nền : ganglioside GM1, lactosylceramides, lactose,

và nhiều glycoprotein

● Nó cũng có thể tách fucosides và arabinosides nhưng với hiệu quả thấp hơn nhiều

Cấu trúc không gian

● β - galactosidase có nhiều đồng phân như :

beta-galactosidase (EBG), beta-glucosidase ,

6-phospho-beta-galactosidase, beta-mannosidase, và lactase-phlorizin hydrolase

● β - galactosidase bị ức chế bởi L-ribose , chất ức chế không cạnh tranh iốt , và các chất ức chế cạnh

tranh phenylthyl thio-beta-D-galactoside (PETG),

D-galactonolactone , isopropyl thio-beta-D-galactoside (IPTG) , và galactose

- Enzym ngoại bào

Tiết ra ngoài môi trường

- Enzym nội bào

Tích tụ trong tế bào, ở dạng tự do hoặc liên kết với màng tế bào hoặc lyzosome

Vi sinh vật tổng hợp

NẤM MEN

Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces lactics, K.fragilis, K marxianus, Torulopsis sphaerica, T versalitis …

NẤM MỐC Aspergilus awmori, A cellulosae, Penicilum canescens,

Rhizopus acidus, R.niveus

VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae SP3-BS71, Clostridium

perfringens, Lactococcus pneumonira…

Mô hình sản xuất enzym từ nấm men trong

đề tài.

Two expression Plasmids A

Β-galactosidase

Dùng chỉ thị X- Glal

● Nguyên tắc: của phương pháp dựa trên khả năng thủy phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh blue kiểu indigo của enzym β - galactosidase

● Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, hóa chất không quá phức tạp

● Nhược điểm: Độ chính xác thấp, khả năng sai số cao, chỉ xác định định tính chứ không áp dụng để định lượng

Quang phổ hấp thụ phân tử

● Nguyên tắc của phương pháp : để xác định một chất bất

kì, ta có thể tìm cách đo một tín hiệu bất kỳ có quan hệ

trực tiếp hoặc gián tiếp

● Yêu cầu : +Ánh sáng được sử dụng trong nghiên cứu

là ánh sáng đơn sắc

+ Trong quá trình đo quang, không xuất hiện các tương tác giữa chất nghiên cứu với chất lạ hay môi

trường

Quang phổ hấp thụ phân tử

● Ưu điểm: tính chính xác của kết quả khá cao, áp dụng để định lượng được chất cần phân tích

● Nhược điểm: thao tác phức tạp, cần độ chuẩn xác, có sự đầu tư về thiết bị và hóa chất

Hóa chất

●

Thiết bị dụng cụ

● Máy li tâm

● Máy so màu quang phổ

● Thiết bị ổn nhiệt

● Các dụng cụ kèm theo trong quá trình thao tác

Chuẩn bị sinh khối

● + ly tâm 2ml dịch nuôi cấy, ở 4ᵒC với tốc độ 6000 vòng / phút trong 4 phút

● + loại bỏ phần dịch trong, phần cặn bã được tái tạo huyền phù bằng cùng một thể tích dung dịch đệm Z đã làm lạnh

● + Pha loãng dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật bằng dung dịch đệm Z

● + Làm tăng tính thấm của các tế bào vi sinh vật đã pha

loãng này bằng cách thêm 100 µl Cloroform và 50 µl dung dịch SDS 0,1 % vào 1ml huyền phù đã pha loãng

● + Lắc đều và để ổn định ở 28ᵒC trong 5 phút

Phân tích

●

●

THANK YOU