Xác định hàm lượng Nito tổng theo phương pháp KJELDAHL

CHƯNG CẤT ĐAM BẰNG BỘ CHƯNG CẤT KJELDAHL 1. NGUYÊN TẮC Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị phân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Quá trình được thực hiện theo các bước sau

phanquangthoai@yahoo.com ĐỊNH LƯỢNG NITO TỔNG THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL CHƯNG CẤT ĐAM BẰNG BỘ CHƯNG CẤT KJELDAHL NGUYÊN TẮC Dưới tác dụng H2SO4 đặc nhiệt độ cao, hợp chất có chứa nito bị phân huỷ oxy hoá đến CO2 H2O nito chuyển thành amoniac (NH3) tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Quá trình thực theo bước sau: Bước 1: Vô hoá nguyên liệu R-CH-COOH + H2SO4 NH2 t CO2+H2O+(NH4)2SO4 Xúc tác Bước 2: Cất đạm phản ứng xảy thiết bị cất đạm (NH4)2SO4 +2NaOH Na2SO4 +2NH3 +2H2O Phản ứng xảy bình hứng NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4 +H2SO4 dư Bước 3: Chuẩn độ lượng H2SO4 thừa bình hứng NaOH Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com D P2 C E B A F P1 BỘ CHƯNG CẤT ĐẠM KJELDAHL GIỚI THIỆU TERMAMYL -Termamyl tên thị trường enzyme amylase -Termamyl loại alpha-amylase ổn định nhiệt sản xuất chủng Licheniformis Bacillus Ứng dụng: -Termamyl sử dụng ngành công nghiệp sau đây: Tinh bột Tinh bột sản phẩm tự nhiên quan trọng có nhiều ứng dụng kỹ thuật đời sống người Nhiều nước giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), riêng nước ta sử dụng gạo Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com khoai mì nguồn tinh bột chủ yếu Trong chế biến tinh bột đường, công đoạn quan trọng thuỷ phân tinh bột đường đơn giản Sau đó, chủ yếu sở đường đơn nhờ lên men, người ta nhận nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, loại acid hữu cơ, amino acid,… Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu giai đoạn hồ hoá giai đoạn đường hoá Để thực hai công đoạn công nghệ nói trên, thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột acid enzym Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta sử dụng acid vô HCl H2SO4 Nhưng kết cho thấy, thuỷ phân acid khó kiểm soát thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột kết tất yếu lịch sử phát triển Enzym amylase tìm góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Enzym amylase tìm thấy nhiều nguồn khác amylase từ thực vật, động vật VSV Amylase ngày thay acid sản xuất qui mô công nghiệp Hiện nay, nhà sản xuất sử dụng amylase có khả chịu nhiệt cao mà không bị hoạt tính, chẳng hạn amylase tách chiết từ VSV, cụ thể chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng Ngoài ra, amylase có nhiều ưu điểm sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho trình tinh dịch đường Nguồn amylase lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất gạo, bắp, khoai mì,… nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền tìm thấy dễ dàng nước ta Do đó, lợi hướng phát triển mạnh làm sở cho nhiều ngành khác phát triển Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô làm mềm vải,… Trong công nghiệp tinh bột, Termamyl sử dụng cho hóa lỏng liên tục tinh bột nhiệt độ lên tới 105-110 ° C, lợi dụng ổn định nhiệt cực độ enzym Rượu Trong công nghiệp rượu, Termamyl sử dụng cho tinh bột mỏng chưng cất mashes Mía đường Trong công nghiệp đường, Termamyl sử dụng để phá vỡ mặt tinh bột nước trái mía Qua nội dung tinh bột đường thô giảm lọc nhà máy lọc tạo điều kiện Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com Dệt may Trong ngành công nghiệp dệt may, Termamyl sử dụng cho hàng dệt trước nhuộm nhiệt độ cao HOẠT ĐỘNG -Enzyme termamyl endoamylase bẻ gãy mối liên kết hydrolyses 1,4alpha glycosidic amylose Amylopectin, hai thành phần tinh bột Do ,tinh bột bị phá vỡ nhanh chóng để tạo dextrins oligosaccharides -Termamyl hoạt động tối ưu pH 90 ° C -Termamyl amylase sử dụng để loại bỏ vết bẩn tinh bột -Termamyl hiệu loại bỏ vết bẩn tinh bột cung cấp độ trắng Termamyl có hiệu môi trường kiềm tương đối cao nhiệt độ cao Tổng quan enzym amylase Amylase gì? Amylase hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước Có loại enzyme xếp vào nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào ) exoamylase ( enzyme ngoại bào ) Endoamylase gồm có α-amylase nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh chia thành loại: Khử trực tiếp Pullulanase ( hay α-dextrin – glucosidase); khử gián tiếp Transglucosylase (hay oligo1,6-glucosidase) maylo-1,6-glucosidase Các enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide Exoamylase gồm có β-amylase γ-amylase Đây enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử chuỗi polysaccharide Cơ chất tác dụng amylase tinh bột glycogen: • Tinh bột: nhóm Carbohydrate thực vật, có chủ yếu loại củ khoai lang, khoai tây, khoai mì… , hạt ngũ cốc, loại hạt có công thức tổng quát (C6H12O6)n.Tinh bột từ nguồn khác có cấu tạo từ amylase amylopectin ( Meyer, 1940 ) Các loại tinh bột có 20-30% amylase 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột xem chất dự trữ lượng quan trọng -Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, cấu tạo từ 2001000 phân tử D-glucose nối với liên kết α-1,4-glucoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com -Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với liên kết α-1,4glucoside α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan nước lạnh hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60850C ) tinh bột bị hồ hóa gọi hồ tinh bột Dưới tác dụng enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột enzyme amylase xảy theo mức độ: Dịch hóa đường hóa Kết dịch hóa tạo sản phẩm trung gian dextrin dextrin tiếp tục bị đường hóa sản phẩm maltose glucose -Cabohydrate thực phẩm nguồn cung cấp lượng quan trọng cho thể người Rau nguồn cung cấp tinh bột tinh bột phần chuyển hóa thành disaccharide glucose Carbohydrate có mặt hầu hết loại thực phẩm nguồn cung cấp chủ yếu đường tinh bột • Glycogen: loại Cabohydrate dự trữ Ở động vật dự trữ thể động vật thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng chuyển hóa glucid tế bào động vật, VSV, glucogen cấu tạo từ glucose liên kết với liên kết α-1,4-glycoside vị trí phân nhánh, glucose nối với liên kết α-1,6-glycoside Glycogen có số mạch nhiều tinh bột Phân tử lượng khoảng triệu-3 triệu Da Glycogen dễ tan nước, ăn nhiều Carbohydrate thể chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật người, glycogen tập trung chủ yếu gan Đặc tính chế tác dụng enzym α-amylas Đặc tính enzym α-amylase α-amylase từ nguồn khác có thành phần amino acid khác nhau, loại α-amylase có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic aspartic Các glutamic acid aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: - α-amylase có methionine có khoảng 7-10 gốc cysteine - Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ) - Amylase dễ tan nước, dung dịch muối rượu loãng - Protein α-amylase có tính acid yếu có tính chất globuline -Điểm đẳng điện nằm vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ) -α-amylase metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, không 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com gia vào hình thành ổn định cấu trúc bậc enzyme, trì hoạt động enzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca có vai trò trì tồn enzyme bị tác động tác nhân gây biến tính tác động enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca hoàn toàn bị hết khả thủy phân chất α-amylase bền với nhiệt độ enzyme khác Đặc tính có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca phân tử nồng độ Mg2+ Tất amylase bị kiềm hãm kim loại nặng Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, ảnh hưởng đến α-amylase Thành phần amino acid α-amylase nấm mốc Aspergillus sau ( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ) Không giống α-amylase khác, amylase Asp.oryzae có chứa phần phi protein polysaccharide Polyose bao gồm mol maltose, mol glucose, mol hexozamin mol enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ) Vai trò polyose chưa rõ, song biết không tham gia vào thành phần trung tâm hoạt động nằm phía phân tử enzyme α-amylase nấm mốc công hạt tinh bột bị thương tổn Sản phẩm cuối thủy phân amylase glucose maltose Đối với nấm sợi tỉ lệ 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) α-amylase nấm sợi không công liên kết α-1,6 glucoside amylopectin, nên thủy phân tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh Đây cấu trúc phân tử tinh bột enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh Sản phẩm thủy phân cuối tinh bột tác dụng amylase nấm sợi chủ yếu maltose, thứ đến maltotriose Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men Còn α-amylase nấm mốc mức độ đường hóa đến glucose maltose lên tới 84-87% Điều kiện hoạt động α-amylase từ nguồn khác thường không giống pH tối thích cho hoạt động α-amylase từ nấm sợi 4,0-4,8 ( hoạt động tốt vùng pH từ 4,5-5,8 ) Theo số liệu Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa đường hóa chế phẩm amylase từ Asp.oryzae vùng 5,6-6,2 Còn theo số liệu Fenixova pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa 6,0-7,0 Độ bền tác dụng acid khác khác α-amylase Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com Asp.oryzae bền vững acid tốt α-amylase malt vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH= 3,6 0oC, α-amylase malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, hoạt lực α-amylase nấm sợi không giảm ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa nấm sợi đen chịu pH từ 2,52,8.Ở 0oC pH= 2,5, bị bất hoạt hoàn toàn sau Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác α-amylase từ nguồn khác không đồng nhất, α-amylase nấm sợi nhạy cảm tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích 500C bị vô hoạt 70OC( Kozmina, 1991 ) Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase Asp.oryzae nhạy với tác động nhiệt độ cao, chí 400C hoạt lực dextrin hóa 22-29%, hoạt lực đường hóa 27-85% Ở 500C giờ, αamylase nấm sợi bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller cộng ) Cơ chế tác dụng enzym α-amylase α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ) α-amylase từ nguồn khác có nhiều điềm giống α-amylase có khả phân cách liên kết α-1,4-glucoside nằm phía bên phần tử chất ( tinh bột glycogen ) cách ngẫu nhiên, không theo trật tự α-amylase không thủy phân hồ tinh bột mà thủy phân hạt tinh bột nguyên song với tốc đột chậm Quá trình thủy phân tinh bột α-amylase trình đa giai đoạn + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ số phân tử chất bị thủy phân tạo thành lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh ( amylose amylopectin bị dịch hóa nhanh ) + Sang giai đoạn ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất bị thủy phân chậm α-amylase disaccharide monosaccharide Dưới tác dụng α-amylase, amylose bị phân giải nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vậy, người ta cho α-amylase phân cắt amylose thành đoạn 6-7 gốc glucopiranose ) + Sau đó, poliglucose bị phân cách tiếp tục tạo nên mạch polyglucose colagen ngắn dần bị phân giải chậm đến maltotetrose maltotriose maltose Qua thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com amylose chứa 13% glucose 87% maltose Tác dụng α-amylase lên amylopectin xảy tương không phân cắt liên kết α-1,6-glycoside chỗ mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu sản phẩm cuối cùng, đường nói ( 72% maltose 19% glucose ) có dextrin phân tử thấp isomaltose 8% Tóm lại, tác dụng α-amylase, tinh bột chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase thủy phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine maltose Khả dextrin hóa cao α-amylase tính chất đặc trưng Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Các giai đoạn trình thủy phân tinh bột α-amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 2.NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT , THIẾT BỊ: NGUYÊN LIỆU: Mẫu termamyl vô hoá pha loãng HOÁ CHẤT : H2SO4 N/100 NaOH N/100 Metyl đỏ CÁCH TIẾN HÀNH: Bước 1: Vô hoá mẫu _ termamyl dùng vô hoá mẫu sẵn Bước : Cất đạm a )Rửa máy : - Đun sôi bình A mở nước vào ớng làm lạnh F Khoá P1 P2 đóng , sau cho vào phễu D nước cất (khoảng 10ml) cho chảy xuống bình C P2 Hơi nước bình A từ từ qua erlen F, để erlen F có khoảng 5ml nước ngưng đun bình A, làm nguội bình A , áp suất bình A giảm xuống đồng thời áp suất bình B giảm , nước bìnhC rút qua B Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com - Khi nước rút hết ta lại thêm nước vào phễu D, lại mở kẹp cho nước chảy qua C, kế nước rút qua B Ta làm chừng vài lần - Nuớc bình B đầy ta mở kẹp P1 cho nước chảy Khoá kẹp P1 P2 lại b)Chuẩn bị dung dịch bình hứng NH3 (bình F): Cho vào bình hứng F (erlen 250 ml) 15ml H2SO4 N/100 giọt thuốc thử metyl đỏ, dung dịc có màu tím đỏ Đặt bình hứng cho đầu mút ống sinh hàn E ngập dung dịch bình hứng c)Thực chung cất lôi nước: - Lúc bình A đun sôi, kẹp P1 v P2 đóng Đổ vào phễu D 10 ml dung dịch termamyl, mở kẹp P2 cho dung dịch chảy từ từ xuống bình C, đóng P2 lại Đổ nước tráng vào D mở kẹp cho nước chảy từ từ xuống C mực nước D xuống gần sát kẹp P2 khoá kẹp P2 lại Sau tráng D nước cất vài lần với thao tác - Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc Mở khoá P2 từ từ NaOH chảy từ từ xuống C giọt Nếu nước C trào lên mạnh khoá P2 lại, sau lại tiếp tục cho NaOH chảy gần hết xuống C Tráng phễu D lần nước cất , cho nuớc chảy gần sát tới P2 mà - Tiếp tục chưng cất lôi nước phút, sau hạ erlen xuống cho đầu mút ống sinh hàn không khí , đun tiếp phút Rửa đầu mút sinh hàn E nằm không khí, đun tiếp phút Rửa đầu mút lại nước cất, lấy erlen để định lượng H2SO4 thừa - Ngưng đun bình A , rửa máy vài lần *Ta thực lại lần thử không thay dùng termamyl ta dùng 10 ml nước cất Bước 3: Chuẩn độ Lượng H2SO4 N/100 thừa bình F chuẩn độ NaOH N/100 Quá trình chuẩn độ kết thúc dung dịch chuyển từ đỏ tím sang màu vàng nhạt 3.SƠ ĐỒ KHỐI Ks.phanquangthoai Trang phanquangthoai@yahoo.com RỬA MÁY CHƯNG CẤT ĐẠM ĐẾN LẦN CHUẨN BỊ DUNG DỊCH Ở BÌNH HỨNG F : 15 ml dung dich H2SO4 N/100, giọt metyl đỏ VÔ CƠ HOÁ MẪU TERMAMYL ĐUN SÔI BÌNH A CHO VÀO PHỄU D, TRÁNG LẠI PHỄU BẰNG NƯỚC CẤT MẪU TERMAMYL 10 ML CHO 10 ml DUNG DỊCH NaOH , TRÁNG LẠI BẰNG NƯƠC CẤT NaOH N/100 -CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC TRONG PHÚT -SAU ĐÓ HẠ ERLEN XUỐNG SAO CHO ĐẦU MÚT CỦA ỐNG SINH HÀN TRONG KHÔNG KHÍ , ĐUN TIẾP PHÚT -RỬA ĐẦU MÚT CỦA SINH HÀN E NẰM TRONG KHÔNG KHÍ, ĐUN TIẾP PHÚT NỮA -RỬA ĐẦU MÚT LẠI BẰNG NƯỚC CẤT LẤY DUNG DỊCH TRONG BÌNH F CHUẨN ĐỘ VỚI NaOH N/100 ĐẾN KHI DUNG DỊCH CHUYỂN SANG VÀNG NHẠT XÁC ĐỊNH HỆ SỐ HIỆU CHUẨN : Lấy erlen , cho vào erlen 20 ml H2SO4 N/100 vài giọt metyl đỏ Sau chuẩn độ dung dịch NaOH N/100 Ks.phanquangthoai Trang 10 ... glutamic acid aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: - α-amylase có methionine có khoảng 7-10 gốc cysteine - Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000... nước cất, lấy erlen để định lượng H2SO4 thừa - Ngưng đun bình A , rửa máy vài lần *Ta thực lại lần thử không thay dùng termamyl ta dùng 10 ml nước cất Bước 3: Chuẩn độ Lượng H2SO4 N/100 thừa... amylase xảy theo mức độ: Dịch hóa đường hóa Kết dịch hóa tạo sản phẩm trung gian dextrin dextrin tiếp tục bị đường hóa sản phẩm maltose glucose -Cabohydrate thực phẩm nguồn cung cấp lượng quan