HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1

Năm 2005, lần đầu tiên virus H5N1 gây chết 6.345 con chim thuộc nhiều loài chim hoang dã khác nhau tại hồ Qinghai, Trung Quốc, ảnh hưởng lớn tới số lượng chim hoang dã ở đây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Hoà Bình

HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC

VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2007

-

Nguyễn Hoà Bình

HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC

VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1

Chuyên ngành: Hoá sinh học

Mã số: 1.05.10

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Vân Trang

Hà Nội - 2007

Lời cảm ơn

Trong suốt thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận

tình, chu đáo của các thầy cô giáo và các cán bộ khoa học công tác tại Phòng Hoá

sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Bộ môn

Hoá sinh học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQGHN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Vân Trang, phụ

trách phòng Hoá sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ

TW người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho

tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Mùi và PGS TS Vũ Tân

Trào – những người đã có định hướng quan trọng và đưa ra những lời khuyên bổ

ích trong quá trình nghiên cứu Đồng thời, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo

khoa, các anh chị cùng các bạn đã và đang công tác tại Khoa Miễn dịch và Sinh học

Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập mẫu

ngoài thực địa và luôn nhiệt tình chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm thực tiễn quý

báu trong công tác nghiên cứu khoa học Đặc biệt, tôi xin cảm ơn chị Đỗ Quỳnh

Nga đã giúp đỡ tôi về mặt kĩ thuật trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Hoá sinh học và Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thầy, các cô là những người mang đến

cho tôi niềm đam mê khoa học và truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản, bổ ích

Tôi cũng xin cảm ơn sự PGS TS Đinh Duy Kháng (Viện Công nghệ Sinh

học), TS Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y Quốc gia), TS Carl Mason (AFRIMS) và

TS Roland Levandowski (NIH) đã cung cấp virus và những hướng dẫn kĩ thuật cần

thiết Cảm ơn các tổ chức SIDA, AFRIMS và NIH đã cấp kinh phí và hoá chất cho

nghiên cứu Cảm ơn phòng Công nghệ cao - Công ty vacxin & Sinh phẩm số 1 đã

cho phép chụp ảnh các thí nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại công ty Tư

vấn và Đại diện Sở hữu Trí tuệ Trường Xuân, đã tạo điều kiện tốt nhất về mặt thời

gian và công việc, cùng hỗ trợ về kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tôi, những người thân yêu đã luôn bên tôi, tin

tưởng và cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 28 tháng 11 năm 2007

Học viên: Nguyễn Hoà Bình

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AA : Axit amin

BSA : Albumin huyết thanh bò

CPE : Hiệu ứng huỷ hoại tế bào

CTL : Tế bào Lympho độc

DMEM : Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles

EID50 : Liều gây nhiễm 50% số trứng

FBS : Huyết thanh bào thai bê

MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby Canine Kidney)

MN : Trung hoà vi lượng (Microneutralization)

MOI : Số virus xâm nhiễm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN .2

1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 .2

1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới 2

1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam 5

1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1 6

1.2 Virus cúm A .9

1.2.1 Phân loại 9

1.2.2 Danh pháp 10

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo virus cúm 10

1.2.4 Các subtype hiện nay của virus cúm 14

1.2.5 Sự xâm nhập và sao chép của virus cúm trong tế bào chủ 14

1.2.6 Cơ chế hình thành chủng mới 16

1.2.7 Bệnh học nhiễm virus H5N1 ở người 18

1.2.8 Các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhiễm virus H5N1 18

1.3 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm 19

1.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 20

1.3.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 21

1.3.3 Tác dụng bảo vệ chéo .23

1.4 Các phương pháp chẩn đoán virus .24

1.4.1 Phương pháp chẩn đoán trực tiếp 24

1.4.2 Phương pháp chẩn đoán gián tiếp 26

1.4.3 Phương pháp huyết thanh học 27

1.5 Kĩ thuật trung hòa vi lượng (MN) .29

1.5.1 Cơ sở của kĩ thuật 29

1.5.2 Ứng dụng kĩ thuật trong chẩn đoán virus .29

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .31

2.1 Mẫu huyết thanh .31

2.2 Vật liệu 32

2.2.1 Dòng tế bào .32

2.2.2 Chủng virus 32

2.2.3 Kháng nguyên và kháng thể 32

2.2.4 Môi trường và hoá chất 32

2.2.5 Trang thiết bị 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh 34

2.3.2 Chuẩn độ kháng thể 34

2.3.3 Chuẩn bị tế bào MDCK .35

2.3.4 Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng 36

2.3.5 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) .37

2.3.6 Phản ứng trung hoà virus .38

2.3.7 Phản ứng ELISA .40

2.4 Xử lý số liệu 41

2.4.1 Kết quả phản ứng trung hòa virus 41

2.4.2 Đọc kết quả 41

2.4.3 Xử lý thông tin về người tiếp xúc .42

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Kết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA .43

3.1.1 Nồng độ protein của virus cúm gia cầm 43

3.1.2 Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA .44

3.2 Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN .46

3.2.1 Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus 46

3.2.2 Xác định MOI của virus sử dụng trong gây nhiễm 49

3.2.3 Xác định TCID50 của virus P2 dùng cho phản ứng MN 50

3.3 Chuẩn bị tế bào MDCK, thời gian và điều kiện gây nhiễm 51

3.3.1 Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp 51

3.3.2 Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào .54

3.4 Đánh giá kết quả thu được của phản ứng MN 54

3.4.1 So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt của trypsin-TPCK 54

3.4.2 Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN 56

3.4.3 Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng MN 58

3.4.4 Đánh giá độ nhạy của phản ứng MN 58

3.5 Ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học 60

KẾT LUẬN .64

KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

MỞ ĐẦU

Virus cúm type A được phân thành 16 phân nhóm dựa trên tính kháng nguyên (KN) của protein Hemagglutinin (HA) và 9 phân nhóm dựa trên tính KN của protein Neuraminidase (NA) Virus cúm đã được phân lập từ nhiều loài động vật như chim, hoang dã, thuỷ cầm, gia cầm, lợn, ngựa và người Việc thay đổi nhanh chóng về tính KN của virus đã gây khó khăn lớn trong phòng ngừa, điều trị bệnh cúm, đặc biệt là trong sản xuất vaccine cúm Lịch sử đã ghi nhận những vụ dịch do virus cúm A gây ra với thiệt hại nghiêm trọng, điển hình là đại dịch do cúm H1N1 năm 1918 gây tử vong cho 40-60 triệu người và đại dịch cúm H2N2 năm

1957 đã cướp đi sinh mạng gần 2 triệu người

Từ năm 1997 tới nay, nhiều vụ dịch do virus cúm gia cầm H5N1 đã liên tiếp bùng phát trên diện rộng tại nhiều quốc gia, các châu lục trên thế giới gây thiệt hại nặng nề về người và kinh tế Virus cúm gia cầm H5N1 đã gây bệnh cho người với tỉ

lệ tử vong lên tới 50% Năm 2007, toàn thế giới đã có 71 ca nhiễm virus H5N1, trong đó có 47 ca tử vong Trong đó, Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai sau In-đô-nê-xia về số người nhiễm và tử vong do virus H5N1 Đứng trước tình hình đó, Việt Nam cần phải luôn chủ động ứng phó kịp thời với những diễn biến dịch Bên cạnh việc phát hiện, khoanh vùng dịch bệnh sớm và chính xác để kiểm soát dịch, chúng

ta cần phải có những nghiên cứu, điều tra dịch tễ học một cách toàn diện nhằm xác định khả năng miễn dịch của người đối với virus Để thực hiện điều này, chúng ta cần có các kĩ thuật chẩn đoán đặc hiệu và có độ tin cậy cao giúp xác định sự có mặt của kháng thể (KT) kháng virus H5N1 trong huyết thanh người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1

Đáp ứng yêu cầu này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Hoàn thiện kĩ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization) trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1” Kĩ thuật được xây

dựng, tối ưu hoá và bước đầu áp dụng để xác định KT kháng virus H5N1 trong mẫu huyết thanh thu thập tại các tỉnh Hà Tây, Hải Dương và Thái Bình trong các năm 2006-2007

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1

1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới

Trước khi phân lập được trên người, năm 1996, virus cúm gia cầm H5N1 có khả năng gây bệnh cao (HPAI) đã được phân lập từ ngỗng nuôi ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc[66] Năm 1997, virus cúm gia cầm H5N1 là nguyên nhân gây bùng phát dịch tại các trang trại nuôi gà và các khu vực chợ buôn bán gia cầm sống ở Hồng Kông, đợt dịch này cũng ghi nhận trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở người, sau đó có thêm 18 người được xác định bị nhiễm virus H5N1, 6 người đã tử vong[66] Vụ dịch này cũng dẫn đến việc phải tiêu huỷ 1,5 triệu gia cầm tại Hồng Kông, nhờ đó đã ngăn chặn được dịch bùng phát[57]

Từ năm 1997 tới cuối năm 2002, thế giới không có vụ dịch do virus H5N1 nào bùng phát Đầu năm 2003, virus H5N1 với khả năng gây bệnh cao nêu trên đã xuất hiện trở lại ở cả gia cầm nuôi nhốt và chim hoang dã tại Trung Quốc và lần đầu tiên virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện tại Hàn Quốc[66] Hồng Kông đã có hai trường hợp được khẳng định là nhiễm virus gia cầm H5N1 trên người, trong đó có một người tử vong[66] Năm 2004, dịch đã bùng phát trên diện rộng, gây thiệt hại lớn tại các nước Đông Nam Á bao gồm Cam-pu-chia, In-đô-nê-xia, Lào, Thái Lan

và Việt Nam Trong năm này, Nhật Bản cũng đã ghi nhận trường hợp nhiễm virus cúm H5N1 đầu tiên trên gia cầm Nhiều ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người dẫn tới

tử vong đã được ghi nhận tại Việt Nam và Thái Lan[66]

Năm 2004, trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở thú lớn thuộc họ mèo là hai con hổ và hai con báo đã được ghi nhận tại Thái Lan[66] Kuiken cùng các cộng sự đã chứng minh được rằng mèo nhà cũng bị nhiễm virus H5N1 và có khả năng lây truyền từ mèo sang mèo[23] Cùng thời gian này, 147 con

hổ trong số 441 con hổ nuôi nhốt tại một vườn thú ở Thái Lan đã chết do ăn xác gia cầm sống Các nghiên cứu đã khẳng định được rằng vịt nuôi có thể là vật chủ chứa virus khi chúng thải ra một lượng lớn virus có khả năng lây nhiễm cao song hoàn toàn không có các biểu hiện nhiễm bệnh[66] Tuy nhiên, chủng virus H5N1 hiện tại

đã thu nhận thêm kiểu hình khác và có khả năng gây chết cho vịt[19]

Năm 2005, lần đầu tiên virus H5N1 gây chết 6.345 con chim thuộc nhiều loài chim hoang dã khác nhau tại hồ Qinghai, Trung Quốc, ảnh hưởng lớn tới số lượng chim hoang dã ở đây Đợt dịch này làm giảm khoảng 10% tổng số ngỗng đầu

khoang (Anser indicus) toàn cầu, đồng thời cảnh báo nguy cơ ảnh hưởng nghiêm

trọng tới các loài động vật hoang dã[66]

Đến thời điểm năm 2005, virus cúm H5N1 đã xuất hiện ở cả người và gia cầm tại nhiều nước châu Á, châu Âu và Trung Đông Năm 2006, dịch cúm gia cầm

do virus H5N1 đã di dịch sang phía Tây, tiếp tục gây bùng phát dịch ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia ở châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Italia, Anh, Pháp, Đức) Đồng thời, các trường hợp người chết do nhiễm virus cúm H5N1 liên tục được ghi nhận tại Indonesia Lần đầu tiên virus H5N1 đã xuất hiện trên gia cầm tại Mỹ và các nước châu Phi (Nigeria, Sudan, Bờ Biển Ngà …)[66]

Tính tới tháng 12 năm 2007, số ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người liên tục được ghi nhận, nhiều nhất là tại Indonesia và Ai Cập Dịch cúm trên gia cầm vẫn xảy ra rải rác ở nhiều nơi[66] Các khu vực trên thế giới đã được khẳng định là có mặt của virus cúm H5N1 được thể hiện trên hình 1.1

Như vậy, kể từ khi xuất hiện tại Hồng Kông năm 1997 tới nay, chủng virus cúm H5N1 đã lan tràn, gây dịch bệnh cho gia cầm và chim hoang dã ở 60 quốc gia (hình 1.1), hơn 200 triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy Các loài động vật đã bị nhiễm virus H5N1 bao gồm gà, ngỗng, các loài chim hoang dã, mèo, hổ và báo Thiệt hại

về kinh tế ước tính hơn 10 tỉ đô la[3, 30, 66] Đáng lo ngại là sức khoẻ và tính mạng của con người bị đe dọa nghiêm trọng Bảng 1.1 cho thấy, tính đến năm 2005, Việt Nam là quốc gia có số người tử vong do virus H5N1 cao nhất (42 người), tuy nhiên, đến tháng 12 năm 2007 thì quốc gia có số người tử vong do virus H5N1 nhiều nhất

là In-đô-nê-xia (91 người) Thế giới đã có 337 ca được khẳng định là nhiễm virus H5N1 với 207 trường hợp tử vong tại 11 quốc gia (hình 1.2), tỉ lệ tử vong do nhiễm virus cúm H5N1 lên tới hơn 61%

Hình 1.1 Bản đồ lưu hành virus cúm A H5N1 trên gia cầm và chim hoang dã Màu da

cam: các vùng có dịch cúm H5N1 trên gia cầm, màu gạch: nơi phát hiện thấy virus cúm A H5N1 trên chim hoang dã (Tổ chức Y tế thế giới, 27/09/2007) website: www.who.int

Hình 1.2 Bản đồ phân bố các ca bệnh nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 tính từ năm 2003

(Tổ chức Y tế thế giới, 30/11/2007), website: www.who.int

Các khu vực được khẳng định có bệnh nhân nhiễm

Khu vực bùng phát dịch trên gia cầm Khu vực bùng phát dịch ở chim hoang dã

Bảng 1.1 Số người nhiễm và tử vong do virus H5N1 trên thế giới tới tháng 11 năm 2007

Quốc gia

2003 2004 2005 2006 2007 Tổng Nhiễm vong Tử Nhiễm vongTử Nhiễm vongTử Nhiễm vongTử Nhiễm vong Tử Nhiễm vongTử Nigeria 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Thổ Nhĩ Kỳ 0 0 0 0 0 0 12 4 0 0 12 4 Azerbaizan 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 8 5 Campuchia 0 0 0 0 4 4 2 2 1 1 7 7

Ai Cập 0 0 0 0 0 0 18 10 20 5 38 15 Trung Quốc 1 1 0 0 8 5 13 8 3 2 27 17 Thái Lan 0 0 17 12 5 2 3 3 0 0 25 17

Indonesia 0 0 0 0 20 13 55 45 37 32 113 91

Tổng 4 4 46 32 98 43 115 79 70 46 337 207

Ghi chú: Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong Tổ chức Y tế Thế giới chỉ ghi nhận

những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức (Tổ chức Y tế thế

giới, 28/11/2007), website: www.who.int

1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam

Theo ghi nhận của WHO, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát lần đầu tiên tại

Việt Nam vào tháng 1 năm 2004[66] Tính đến tháng 11 năm 2007, đã có 61/64 tỉnh

bùng phát dịch trên gia cầm, tổng số 50 triệu gia cầm các loại đã bị chết hoặc phải

tiêu huỷ Cả nước đã có 30/64 tỉnh phát hiện bệnh nhân nhiễm virus cúm H5N1

(hình 1.3) với tổng số người bị nhiễm lên tới 100 trường hợp, trong số đó có 46

trường hợp đã tử vong[7]

Hình 1.3 Bản đồ các tỉnh có trường hợp nhiễm cúm A H5N1 tại Việt Nam tính tới

28/11/2007 Màu vàng là các tỉnh đã bùng phát dịch trên gia cầm Màu đỏ là các tỉnh có số người tử vong do virus H5N1 (Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức)

(*): Số trường hợp nhiễm virus H5N1/số trường hợp tử vong Bắc Ninh(2/1) tức là tỉnh Bắc Ninh có hai người được xác định là nhiễm virus H5N1, trong đó 1 người đã tử vong

1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1

Sự lây truyền virus ở gia cầm: trong tự nhiên, tất cả các subtype của virus cúm A đã được tìm thấy ở các loài chim hoang dã, cụ thể là các loài chim nước như vịt, ngỗng, nhạn biển, hải âu và mòng biển, từ đó cung cấp các gen cho virus cúm nhiễm vào gia cầm được chăn nuôi, động vật có vú và cả con người[61] Virus được phát tán từ gia cầm nhiễm bệnh ra ngoài môi trường qua đường hô hấp, dịch nhày

và phân[6] Như vậy, con đường lây truyền bệnh có thể diễn ra qua việc tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm khoẻ mạnh với gia cầm nhiễm virus hoặc tiếp xúc gián tiếp của gia cầm khoẻ mạnh với chất thải, dịch tiết có chứa virus hay virus được phát tán trong môi trường sống Việc lây nhiễm có thể xảy ra dễ dàng trong cùng một quần thể gia cầm hoặc giữa các quần thể tại các vùng khác nhau[6] Đặc biệt, virus lây truyền nhanh giữa các vùng, các châu lục thông qua các loài chim di cư[9]

Sự lây truyền virus từ gia cầm sang động vật có vú: đã có nhiều bằng chứng cho thấy virus cúm H5N1 có khả năng truyền từ gia cầm sang các động vật có vú Như đã đề cập ở phần trên, giữa tháng 1 năm 2004, khi dịch cúm gia cầm H5N1

bùng phát tại Thái Lan, hai con hổ (Panthera tigris) và hai con báo (P pardus) của

vườn thú Suphanburi đã chết sau khi có các triệu chứng sốt và suy hô hấp, và chúng được khẳng định là đã bị nhiễm virus H5N1 Các con thú này có thể đã ăn thịt gà sống có có chứa virus H5N1[56, 64] Tháng 11 năm 2004, một con hổ khác cũng được xác định bị nhiễm H5N1 mặc dù con hổ này hoàn toàn không được cho ăn xác

gà chết trong vòng 12 ngày và trong suốt đợt dịch, không có bất kì động vật nào khác của vườn thú này bị nhiễm virus H5N1 Ngoài ra, các thí nghiệm cũng đã ghi nhận hiện tượng lây bệnh giữa các con mèo nhà[56, 64] Trên đảo Ruegen của Đức

đã phát hiện được virus cúm gia cầm H5N1 ở một con mèo nhà đã chết, sau khi có hơn 100 con chim hoang dại chết, trong đó có nhiều con bị chết do virus H5N1 [66] Điều này cho thấy có khả năng virus H5N1 đã được truyền từ gia cầm sang các loài động vật thuộc họ mèo và có khả năng giữa các động vật có vú với nhau[56, 64]

Sự lây truyền virus từ gia cầm sang người: virus cúm ở người thường gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-6 ở các tế bào biểu mô trong ống

hô hấp, trong khi đó virus cúm gia cầm lại gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-3 ở các tế bào biểu mô ruột[65] Trước đó, người ta thường cho rằng lợn là vật chủ trung gian quan trọng, là nơi tiếp xúc vật chất di truyền để thực hiện tái tổ hợp gen, hình thành nên các chủng virus mới trước khi gây ra các vụ dịch lớn[31, 45] Do biểu mô khí quản của lợn bao gồm cả hai liên kết α-2-3 và α-2-6, nên lợn có thể đóng vai trò làm vật chủ, cùng bị xâm nhiễm bởi các virus khác nhau, là nơi xảy ra trao đổi vật chất di truyền của các virus; từ đó hình thành nên các chủng virus mới Biểu mô ống hô hấp của người có cả hai loại liên kết α-2-3 và α-2-6 khiến con người cũng có nguy cơ nhiễm virus cúm gia cầm Cho tới nay các bằng chứng về sự lây truyền từ động vật có vú sang người vẫn chưa đầy đủ[65]

Nghiên cứu virus cúm trong đợt dịch năm 1997 cho phép khẳng định rằng virus cúm gia cầm H5N1 có thể truyền trực tiếp từ gia cầm sang người mà không qua một vật chủ trung gian nào Trong đợt dịch năm 1997, tại Hồng Kông đã có 18

ca được xác định là nhiễm virus H5N1, 6 người đã tử vong Tháng 5 năm 1997, một

bé trai 3 tuổi chết do nhiễm virus H5N1, virus này được xác định là có nguồn gốc từ

gà nuôi đã chết hàng loạt vài ngày trước khi cậu bé có triệu chứng sốt[31] Nghiên cứu bởi Mount và cộng sự cho thấy có sự liên quan giữa việc tiếp xúc với gia cầm

bị bệnh trong vòng một tuần và khởi phát bệnh trên người tiếp xúc sau đó[26] Điều tra này cũng cho thấy nguy cơ nhiễm virus H5N1 do ăn hoặc chế biến thực phẩm từ gia cầm cũng như do tiếp xúc với người nhiễm virus H5N1 là rất thấp, trong đó việc tiếp xúc và làm thịt gia cầm bệnh có thể liên quan đến mẫu huyết thanh dương tính với virus H5N1[26] Cũng trong thời gian này, Kazt cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu huyết thanh học của những người tiếp xúc với gia cầm Kết quả thu được là trong 51 người chăn nuôi gia cầm có 6 người (12%) có huyết thanh dương tính, trong nhóm 26 người là khách du lịch qua vùng dịch có 1 người (4%) huyết thanh có KT kháng virus[5] Như vậy, trong các trường hợp nhiễm virus H5N1, mặc dù không phải là những người làm nghề giết mổ gia cầm song phần lớn các bệnh nhân đều có tiền sử tiếp xúc trực tiếp với gia cầm, cụ thể như vặt lông, tiêu huỷ gia cầm bệnh, chơi chọi gà, ăn tiết canh hoặc thịt gia cầm chưa nấu chín[5] Tuy nhiên, Liêm cùng cộng sự (2004) đã nghiên cứu tình trạng nhiễm virus cúm H5N1 ở 51 người chăn nuôi và 25 người có tiếp xúc với gia cầm bệnh, các mẫu huyết thanh kiểm tra đều âm tính với virus H5N1[5, 27]

Sự lây truyền từ người sang người: kết quả của các điều tra huyết thanh và virus học qua các vụ dịch đã đưa ra những kết luận khác nhau về khả năng lây nhiễm từ người sang người của virus H5N1 Trong đó, các trường hợp nhiều bệnh nhân nhiễm virus H5N1 là người trong cùng gia đình đã được phát hiện[59] Trong

đó có trường hợp một bé gái 11 tuổi ở Thái Lan có thể đã lây truyền virus H5N1 sang mẹ và người họ hàng, những người này đã có những triệu chứng khởi phát sau

3 và 7 ngày tiếp xúc với bé gái, thời gian tiếp xúc lần lượt là 16-18 giờ và 12–13 giờ[59] Bé gái đã có những biểu hiện ngày càng nặng hơn như suy hô hấp, giảm oxi huyết, suy giảm chức năng thuỳ não phải, số lượng tế bào bạch cầu, bạch cầu trong máu giảm và có biểu hiện sốc Bé gái này đã tử vong sau 6 ngày kể từ khi có các triệu chứng khởi phát Mẹ của bé gái cũng có những triệu chứng tương tự và tử vong sau 13 ngày kể từ lần tiếp xúc đầu tiên Người họ hàng của bé gái được đưa vào bệnh viện sau 12 ngày kể từ khi tiếp xúc và xuất viện sau 18 ngày điều trị với

oseltamivir Bằng kĩ thuật RT-PCR, virus H5N1 ở cả người mẹ và người họ hàng của bé gái được xác định là giống nhau Việc tiếp xúc gần gũi mà không sử dụng biện pháp bảo vệ có thể là lý do chính dẫn đến sự lây truyền này[59] Năm 2004, một trường hợp y tá bị bệnh nặng sau khi tiếp xúc với bệnh nhân đã được ghi nhận tại Việt Nam[5, 27] Năm 2006, bảy người trong một gia đình ở Indonesia đã bị nhiễm virus, sáu người đã tử vong, sự việc này gây lo ngại về việc virus H5N1 có thể đã biến đổi và có khả năng lây từ người sang người[5, 59] Việc phân biệt những người trong cùng gia đình lây nhiễm cho nhau hay bị lây từ cùng một nguồn gia cầm nhiễm bệnh là rất khó khăn Gần đây, giám sát những người tiếp xúc với bệnh nhân bằng xét nghiệm phản ứng RT-PCR đã ghi nhận một số trường hợp có biểu hiện nhẹ, khả năng nhiễm virus tăng lên theo độ tuổi của những người tiếp xúc, đồng thời số lượng và thời gian nhiễm của các nhóm bệnh nhân trong cùng gia đình

ở miền bắc Việt Nam cũng tăng lên, kết quả này cho thấy các chủng virus địa phương có lẽ đã thích nghi với người[5, 63]

Tuy nhiên, khi xét nghiệm huyết thanh của các nhân viên y tế tiếp xúc với bệnh nhân, Katz và cộng sự không tìm thấy KT đặc hiệu H5N1, điều này gợi ý rằng

sự lây truyền từ người sang người khó xảy ra chỉ qua tiếp xúc thông thường[21] Một số điều tra huyết thanh học ở Việt Nam và Thái Lan cũng chưa tìm thấy bằng chứng của việc nhiễm virus cúm gia cầm ở người có tiếp xúc với người bệnh[5, 27] Apisarthanarak (2005) đã nghiên cứu dấu hiệu của sự lây nhiễm virus trên 89 nhân viên y tế, song tất cả các mẫu huyết thanh đều âm tính với KT kháng virus H5N1[5] Đến nay, nguy cơ lây truyền sang nhân viên y tế là khá thấp, ngay cả khi không sử dụng biện pháp cách ly thích hợp[5, 27] Khả năng lây nhiễm từ người sang người của virus cúm H5N1 vẫn là một vấn đề gây nhiều tranh luận, cần tiếp tục nghiên cứu để có kết luận chính xác

1.2 Virus cúm A

1.2.1 Phân loại

Virus cúm gia cầm H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm các virus có

genome RNA đơn, phân đoạn, âm tính Dựa trên sự khác biệt KN giữa protein

nucleocapsid (NP) và matrix (M), họ Orthomyxoviridae được chia thành 5 chi:

- Virus cúm A - Virus thogoto

- Virus cúm B - Virus isa

- Virus cúm C

Trong 5 chi nêu trên, virus cúm A có độc lực cao nhất, thường gây ra những

vụ dịch lớn trên thế giới, virus cúm A được phân lập ở người, các động vật như lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, vịt và gà[39] Virus cúm B và virus cúm C chủ yếu được phân lập từ người Genome của virus cúm C gồm 7 phân đoạn RNA và chỉ có một glycoprotein đơn có ba hoạt tính hemaglutinin, esterase và dung hợp, virus cúm C không có KN nào chung với cúm A và B, virus cúm C thường nhiễm ở trẻ em song không gây bệnh nguy hiểm Chi virus thogoto gồm virus dhori được phân lập từ bọ

ve (Hyalomma sp.), xâm nhiễm ở người, gây sốt và viêm não, genome có 6 phân đoạn và virus thogoto được phân lập từ bọ ve Boophilis sp., gây nhiễm ở người, gia súc Virus isa được phân lập từ cá hồi (Salmo salar), chỉ gây bệnh cho cá hồi [20]

Chi virus cúm A chỉ bao gồm type cúm A, type này tiếp tục được phân chia thành các subtype khác nhau dựa trên sự khác biệt KN giữa các protein hemaglutinin (HA) và neuraminidase (NA) (ví dụ như các subtype: H5N1, H1N1, H3N2 …) Virus H5N1 được chia làm các genotype dựa trên phân tích sự phát sinh loài của cả 8 gen và so sánh với các chủng tham khảo Virus H5N1 còn được chia thành các clade dựa vào sự khác nhau về trình tự gen HA Hiện nay, virus H5N1 tại Việt Nam bao gồm clade 2 ở miền Nam và clade 2.3 ở miền Bắc[48]

1.2.2 Danh pháp

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quy định cách viết dành cho virus cúm gồm:

- Type virus (A, B, C)

- Vật chủ phân lập được virus (nếu virus được phân lập trên động vật)

- Địa điểm phân lập

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo virus cúm

Cấu trúc virion của virus cúm: các virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu hoặc đa diện, đường kính từ 80-120 nm; đôi khi chúng có dạng sợi nhỏ dài tới vài μm[36] Các virion gồm vỏ ngoài, protein nền M, phức hợp nucleoprotein,

nucleocapsid và phức hợp polymerase (hình 1.4) Trong đó, nucleocapsid được bao quanh bằng màng protein nền (M1), phía ngoài tiếp tục được bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào vật chủ Một lượng nhỏ protein nền (M2) nằm xuyên qua và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành kênh ion Bề mặt virus có khoảng 500 gai có bản chất là glycoprotein nhô ra ngoài, các gai này

có kích thước từ 10 tới 14 nm, và được phân chia thành hai loại là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), hai loại gai này có tỉ lệ tương ứng HA/NA là từ 4/1 tới 5/1 Dựa trên tính KN của chúng, gai HA được chia thành 16 loại khác nhau và gai NA được chia thành 9 loại khác nhau Các gai nêu trên gắn với lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ qua các trình tự ngắn các amino acid (AA) kị nước[36]

Hình 1.4 Cấu trúc điển hình của virion cúm A[18]

Genome của virus cúm A: virus cúm A có genome gồm 8 phân đoạn RNA mạch đơn (ssRNA) mã hóa cho 10 protein khác nhau, cụ thể là:

- Phân đoạn 1 mã hóa cho PB2 (2.320 nucleotide);

- Phân đoạn 2 mã hóa cho PB1(2.320 nucleotide);

- Phân đoạn 3 mã hóa cho PA (2.211 nucleotide);

- Phân đoạn 4 mã hóa cho HA (1.757 nucleotide);

- Phân đoạn 5 mã hóa cho NP (1.540 nucleotide);

- Phân đoạn 6 mã hóa cho NA (1.392 nucleotide);

- Phân đoạn 7 mã hóa cho M1 và M2 (1.005 và 315 nucleotide);

- Phân đoạn 8 mã hóa cho NS1 và NS2 (868 và 395 nucleotide);

Protein Hemagglutinin (HA) của virus cúm A: tên gọi hemagglutinin là do phân tử này có khả năng gây ngưng kết hồng cầu khi gắn với các thụ thể đặc hiệu

có chứa sialic acid trên hồng cầu HA gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào giúp virus bám vào tế bào và đóng vai trò trung gian trong quá trình dung hợp màng của virus với màng sinh chất của tế bào, đưa nucleocapsid vào trong tế bào chất[36]

HA là một trong hai KN chính của virus cúm mà cơ thể nhận biết được, từ đó sản sinh ra các KT kháng virus, sự hình thành các chủng virus cúm A với gen HA mới trong quần thể không có khả năng miễn dịch với HA đó sẽ dẫn tới nguy cơ bùng phát dịch khi virus lan truyền nhanh chóng giữa các cá thể trong quần thể[25]

HA được mã hoá bởi phân đoạn số 4 có từ 1.742 tới 1.778 nucleotide của virus cúm A, có từ 563 tới 566 AA[36] HA có chiều dài khoảng 10nm, gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau tạo thành dạng homotrimer, giữa các tiểu đơn vị không có liên kết cộng hoá trị Mỗi chuỗi polypeptide của HA bao gồm một vùng ngoài màng, trên đó có gắn các chuỗi oligosaccharide, một vùng xuyên màng và một đuôi cytoplasmic nằm trong tế bào chất[29] Protein HA có thể tồn tại ở dạng nguyên toàn phần (HA0) hoặc dạng bị phân cắt bao gồm 2 chuỗi polypeptide HA1

và HA2 có khối lượng phân tử lần lượt là 47.000Dalton và 29.000Dalton được nối với nhau bằng cầu nối disulfur Vị trí cắt giữa hai chuỗi có vai trò quan trọng đối với quá trình xâm nhiễm cũng như khả năng gây bệnh của virus cúm A[36] Sự lây nhiễm virus cúm gia cầm có HA là H5 hoặc H7 có khả năng gây chết cao ở chim sáo và gia cầm Mức độ độc của virus H5 và H7 khác nhau tuỳ thuộc vào phân tử

HA của các subtype virus cúm A khác nhau và đoạn chứa các AA kiềm tính tại đầu cuối carboxyl của HA1 Điều này cho phép các furin (protease của tế bào) nhận biết được các AA kiềm tính để cắt phân tử HA và hạn chế sự xâm nhiễm của virus cũng

như sự lây truyền virus invitro và in vivo Số AA kiềm tính có thể là từ 4 đến 6 AA

và khả năng bị cắt tuỳ thuộc vào sự có mặt của chuỗi oligosaccharide liền kề của phân tử HA Vị trí cắt của phân tử HA bởi furin có thể là X-X-R-X-R/K-R (X là các

AA không kiềm tính, R là arginine; K là lysin) hoặc R/K-X-R/K-R Enzyme cắt phân tử HA là furin – một protease trong mạng lưới Golgi

Mặc dù độc tính của virus là một đặc điểm do nhiều gen quy định, song HA

có vai trò rất quan trọng đối với đặc điểm này Vị trí cắt của phân tử HA thành HA1

và HA2 của virus cúm là yếu tố quyết định đối với sự lây nhiễm của virus Bằng việc sử dụng phương pháp điện di 2 chiều, Bosch và cộng sự đã xác định được mối liên hệ giữa khả năng phân cắt phân tử HA và sự có mặt của các AA kiềm tính tại vị

trí cắt Mặc dù chiều dài của đoạn peptit nối giữa HA1 và HA2 của H5 và H7 khác nhau, song các virus này đều chứa ít nhất hai cặp AA kiềm tính tại vị trí cắt, trong khi vị trí này của các chủng LPAI không có arginine nào[24] Yoshihiro đã tiến hành gây đột biến điểm tại những vị trí xác định trên phân tử HA của virus A/Turkey/Ireland/ 1378/83 (H5N8)[22] Kết quả thu được cho thấy arginine ở vị trí

số 4 tính từ đầu cuối carboxyl có vai trò đặc biệt quan trọng, trong khi đó vai trò của lysin ở vị trí số 3 lại không quan trọng lắm, lysin chỉ có vai trò giúp cho việc cắt dễ dàng hơn Ngoài chuỗi peptit liên kết, thành phần cấu trúc khác của HA cũng cần thiết để cho việc nhận biết của enzyme cắt[22]

Protein Neuraminidase (NA) của virus cúm A: cùng với HA, NA là glycoprotein quyết định KN chính thứ hai của virus cúm A NA nằm xen với các

HA trên bề mặt virus và có vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi KN hình thành nên chủng mới NA có dạng hình nấm, homotetramer do 4 tiểu đơn vị dạng hình cầu nối với nhau[36] NA gồm một vùng kị nước nằm xuyên qua lớp lipit kép gần đầu tận cùng N của chuỗi (từ AA thứ 7 tới 35), có vai trò như một tín hiệu kết nối liên tục và là vùng giúp NA gắn chặt, ổn định trên bề mặt màng NA được mã hoá bởi phân đoạn thứ 6 có khoảng 1400 nucleotide, mã hoá cho 450 AA[36]

Cho tới nay, vai trò của NA trong chu trình sống của virus vẫn chưa được biết rõ Một số giả thiết cho rằng NA có vai trò loại bỏ sialic acid khỏi glycoprotein,

cụ thể là NA xúc tác cho phản ứng cắt liên kết α-ketosilic giữa sialic acid đầu cuối

và D-galactose hoặc D-galactosamine liền kề[43] NA cũng giúp virus vượt qua lớp nhày trong ống hô hấp, để tiếp xúc được với tế bào biểu mô[2] Ngoài ra, có nhiều bằng chứng về vai trò của NA trong việc xác định vật chủ và thích ứng với môi trường mới của virus cúm, do vậy NA có cũng tham gia vào việc lây truyền của virus giữa các loài vật chủ khác nhau[53]

Protein polymerase (PB): bao gồm 757 AA, được mã hoá bởi phân đoạn 2 trong genome của virus BP1 có khối lượng phân tử khoảng 86.500Dalton và là một endonuclease trong phức hợp transcriptase, với vai trò là một protein gắn mũ[1, 36] Trong khi đó, BP2 gồm 759 AA, được mã hoá bởi phân đoạn 1 trong genome BP2

có khối lượng phân tử khoảng 85.700Dalton, nằm bên trong hạt virion và là polymerase khởi đầu phiên mã trong phức hợp transcriptase[1, 36]

Protein polymerase (PA): có nhiệm vụ kéo dài phiên mã trong phức hợp transcriptase, được mã hoá bởi phân đoạn 3 trong genome của virus Protein bao gồm 716 AA và có khối lượng phân tử khoảng 84.200Dalton[1, 36]

Protein nucleocapsid (NP): là protein cấu trúc dưới đơn vị nucleocapsid và được mã hoá bởi phân đoạn 5 trong genome của virus Protein bao gồm 498 AA và

có khối lượng phân tử khoảng 56.100Dalton[1]

Protein matrix (M): bao gồm M1 và M2, cùng được mã hoá bởi phân đoạn 7 trong genome của virus Trong đó, M1 nằm dưới lớp lipit kép vỏ ngoài, gồm 252

AA với khối lượng phân tử 27.800Dalton và là thành phần cấu trúc chính, tham gia vào quá trình lắp ráp, nảy chồi của virus M2 gồm 97 AA, có khối lượng phân tử 11.000Dalton, M2 là protein không cấu trúc, là các kênh ion M2 thay đổi pH trong endosome bị phong bế bởi amatadin-là một thành phần trong các thuốc điều trị virus hiện nay[36]

Protein không cấu trúc (NS): gồm NS1 và NS2 được mã hoá bởi phân đoạn 8 của genome virus Trong đó, NS1 gồm 230 AA, khối lượng phân tử khoảng 26.815Dalton, ức chế vận chuyển mRNA và phân cắt NS2 gồm 121 AA, khối lượng phân tử 14.216Dalton, giúp đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân[1]

1.2.4 Các subtype hiện nay của virus cúm

Các subtype khác nhau của virus cúm A đã được tìm thấy trên nhiều loài vật chủ Cụ thể là, các subtype virus cúm đã tìm thấy trên người gồm: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H7N1 và H7N7 Các subtype lây nhiễm ở gia cầm và chim gồm: các subtype có chứa H4, H5, H7, H9, H10; N1, N2, N4, N7 như H5N1, H7N7

và H9N2 Các subtype: H7N7, H4N8, H10N4, H1N1, H1N2, H3N2, H4N6, H13N5

đã được tìm thấy ở các loài thú như lợn, ngựa, cá voi và chồn[53]

1.2.5 Sự xâm nhập và sao chép của virus cúm trong tế bào chủ

Quá trình xâm nhập, sao chép của virus cúm trong tế bào chủ gồm các bước: hấp phụ, xâm nhập và “cởi áo”, tổng hợp các thành phần, lắp ghép và phóng thích

Hấp phụ: virus cúm gắn với sialic acid trên glycoprotein của bề mặt tế bào qua vị trí gắn thụ thể tại đầu cùng của gai HA Virus cúm có mức độ đặc hiệu khác nhau đối với sialic acid, acid này được gắn với galactose bằng liên kết α-2,3 hoặc α-2,6 tùy thuộc vào các vị trí đặc hiệu trên phân tử HA[36] Độ đặc hiệu của HA với sialic acid qua liên kết α-2,3 hoặc α-2,6 với galactose quyết định sự lây truyền giữa các loài khi không có đột biến tại vị trí gắn với sialic acid của HA[36, 53]

Xâm nhập và “cởi áo”: virus xâm nhập vào trong tế bào qua quá trình nội thực bào có các thụ thể đặc hiệu làm trung gian[36] Qua quá trình nội thực bào, các

RNA genom chuỗi đơn (-)

RNA (+) đối genom

mRNA virut Protein capsit

Tổng hợp các thành phần của virus:

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp RNA và protein trong quá trình nhân lên của virus cúm A

Sau khi xâm nhập và “cởi áo” (bước 1, hình 1.5), RNA genome virus tiến hành phiên mã để tạo mRNA với sự xúc tác của RNA polymerase phụ thuộc RNA liên kết virion, tế bào không có enzyme này, tuy nhiên, enzyme này không thể tự khởi động quá trình phiên mã được, chúng phải sử dụng tới sản phẩm của quá trình phiên mã do RNA polymerase II xúc tác để làm đoạn mồi cho quá trình tổng hợp mRNA, các đoạn mồi được tạo thành do enzyme endonuclease (thực chất là polymerase của virus) cắt phân tử RNA từ đầu 5’ tại các purin để tạo thành các đoạn có chiều dài từ 10-13 nucleotide (bước 2, hình 1.5) Các phân tử mRNA tạo

RNA (+) đối genome

RNA genome chuỗi đơn (+)

Protein capsid

và RdRp mRNA virus

Virus mới

thành sẽ được sử dụng để tổng hợp protein cấu trúc và protein không cấu trúc Trong giai đoạn đầu, các protein được tổng hợp chủ yếu là NS và NP do chúng cần thiết cho quá trình tổng hợp RNA của virus, còn M thì không được tổng hợp do chúng ức chế phiên mã từ RNA genome thành mRNA và vận chuyển RNA genome

từ nhân ra ngoài tế bào chất Sau đó, khi quá trình tổng hợp mRNA đạt mức cao nhất và bắt đầu giảm dần thì lượng protein M, HA và các protein cấu trúc được tổng hợp tăng dần (bước 3, hình 1.5) Để tổng hợp RNA genome từ mRNA, virus cần trải qua bước tạo RNA chuỗi dương (bước 4, hình 1.5) Sau đó, RNA chuỗi dương được dùng làm khuôn để tổng hợp RNA genome âm (bước 5, hình 1.5) Một phần RNA genome được dùng để tiến hành phiên mã tạo ra một lượng lớn mRNA dùng cho quá trình tổng hợp protein (bước 7, hình 1.5), một phần dùng để lắp ráp với protein để tạo virus mới (bước 8, hình 1.5)[1, 36]

Lắp ghép và phóng thích: sau khi được tổng hợp trên mạng lưới nội chất, HA

và NA được chuyển tới vị trí xác định trên màng sinh chất, M cũng di chuyển tới màng và liên kết với màng nhờ HA và NA Ribonucleoprotein và RNA-polymerase cũng di chuyển từ nhân tới màng sinh chất RNA-polymerase, HA, NA và M được lắp ghép với nhau và ra khỏi tế bào theo lối nảy chồi với sự tham gia của enzyme neuraminidase[36]

1.2.6 Cơ chế hình thành chủng mới

Virus cúm đã nhiều lần thay đổi KN gây ra các đại dịch ở người cũng như ở động vật, cụ thể là lần thay đổi của virus cúm H1N1 được ghi nhận gây hậu quả nghiêm trọng nhất vào năm 1918 làm chết 40-60 triệu người[32] Các vụ dịch do virus cúm H2N2 và H3N2 lần lượt trong các năm 1957 và 1968 do sự tái tổ hợp của chủng virus cúm ở người và chủng virus cúm gia cầm[46] Những thay đổi của AA

ở virus H1N1 từ năm 1918 cũng được tìm thấy trên các chủng virus HPAI (H5N1

và H7N7), những thay đổi này tham gia vào quá trình nhân lên và gây bệnh của virus[55] Các chủng virus cúm mới được hình thành qua việc tích lũy thay đổi KN của virus cụ thể là HA và NA Thay đổi KN của virus xảy ra theo hai cơ chế: thay đổi lớn KN (sắp xếp lại gen) và thay đổi nhỏ KN (đột biến điểm)[29]

Sự thay đổi lớn của kháng nguyên (antigenic shift): sự trao đổi vật chất di truyền giữa hai virus cúm A được quan sát lần đầu tiên năm 1949 trong thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của virus với não chuột[36] Khi có hai hay nhiều chủng virus với các đoạn RNA khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các chủng virus này có thể trao đổi các đoạn gen với nhau và tạo ra chủng virus mới có KN thay đổi

Đáp ứng miễn dịch của cơ thể không thể nhận biết được chủng virus mới hình thành Do vậy, chủng virus mới này có thể xâm nhiễm vào vật chủ mà các chủng khi chưa hoán vị không thể gây nhiễm được Sự thay đổi KN là nguyên nhân gây ra các vụ dịch cúm lớn Thực tế, HA, NA và PB1 của chủng A/HongKong/68 H3N2

và H5N1 được xác định là có nguồn gốc và đã được biến đổi từ chủng cúm gia cầm A/equine/Miami/63 H3N8[1, 36] Theo lý thuyết thì với 8 phân đoạn của genome,

có thể xảy ra 256 khả năng sắp xếp lại các phân đoạn, tuy nhiên thực tế hoàn toàn không xảy ra sự tái sắp xếp ngẫu nhiên do protein của virus cần kết hợp với các protein đặc hiệu có mối quan hệ gần gũi[36]

Sự thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift): sự thay đổi KN ở mức độ thấp do đột biến ngẫu nhiên như thêm, mất, chèn điểm hoặc đoạn xảy ra ở gen mã hoá cho HA dẫn tới sự thay đổi AA hoặc trình tự AA của protein HA Do các RNA polymerase không có khả năng sửa chữa như DNA polymerase, nên xác suất xảy ra đột biến trong quá trình sao chép của virus cúm rất cao (10-4 base) so với của DNA polymerase (10-9 base) [1, 53] Theo ước tính, xác suất đột biến trung bình tại mỗi

AA của HA là 6,7.10-3 một năm và xác suất đột biến qua mỗi chu kỳ xâm nhiễm tại mỗi nucleotide là 1,5.10-5[53] Chủng virus đột biến được chọn lọc và giữ lại trong quần thể do chúng có khả năng xâm nhiễm vào vật chủ mới Các đột biến được tích luỹ gây khó khăn cho việc phòng dịch bằng vaccine Sự thay đổi nhỏ KN gây ra các

vụ dịch nhỏ, tản phát[1, 53] Sự hình thành chủng virus H5N1 từ năm 1997 tới năm

2005 trải qua bước tái tổ hợp vật chất di truyền giữa virus giống chủng A/Goose/Guangdong/1/96 H5N1 và các virus H9N2, H6N1 ở chim cút[25] Gen

NA của virus bị mất đoạn giúp virus có khả năng xâm nhiễm vào các loài gia cầm trên cạn như gà, chim cút Từ năm 2000, nhiều lần tái tổ hợp vật chất di truyền của virus đã được phát hiện ở vịt, gà và các loài gia cầm khác với HA có nguồn gốc từ virus giống chủng A/Goose/Guandong/1/96, nhưng với các phân đoạn gen bên trong có nguồn gốc từ các virus cúm của chim[33] Nhiều genotype đã được xác định trong năm 2001-2002, tới năm 2003, genotype Z trở nên chiếm ưu thế ở gia cầm cạn tại Trung Quốc (Hình 1.6) Genotype Z đã thu nhận gen NA bị mất đoạn nêu trên và có thể lây nhiễm trên gia cầm sống trên cạn Virus H5N1 HPAI đã được phát hiện tại Trung Quốc (1999), Việt Nam (2001) cho thấy rằng virus này tiếp tục lây nhiễm ở vịt và ngỗng[33] Từ tháng 12 năm 2003, Nhật Bản và Hàn Quốc đã ghi nhận dịch bùng phát do virus genotype V, tuy nhiên genotype Z vẫn phổ biến nhất Sự tiến hoá được minh hoạ bằng hình 1.6[33]

Hình 1.6: Sự sắp xếp lại và hình

thành virus cúm A H5N1 ở châu Á từ

năm 1999 tới 2005 Tám phân đoạn

gen (các thanh ngang) bắt đầu từ trên

xuống là PB2, PB1, PA, HA, NP,

NA, M, và NS Mỗi màu thể hiện một

Sau phơi nhiễm, thời gian ủ

bệnh khoảng 3 ngày Lúc đầu,

bệnh nhân có triệu chứng như sốt

cao, khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho,

sổ mũi, nhức đầu, tiến tới khó thở,

nghẹt thở, rối loạn thính giác và

thị giác[1] Bệnh nhân nhiễm virus

cúm A thường tự phục hồi trong 1

tuần Tuy nhiên, các bệnh nhân

nhiễm virus cúm H5N1 có các biểu hiện bệnh nghiêm trọng như suy yếu nhanh, dễ dẫn tới tử vong[10] Bệnh nhân còn có các triệu chứng khác như tiêu chảy, nôn, đau bụng, đau ngực, chảy máu mũi và có thể có biểu hiện của viêm não cấp[10] Triệu chứng đặc trưng khi nhiễm virus H5N1 là tiêu chảy và suy hô hấp[58] Một số chức năng sinh hoá cơ thể bất thường: lượng tế bào lympho và tiểu cầu giảm, aminotransferase hoạt động tăng, tình trạng đông tụ tại các điểm trong hệ mạch[36]

1.2.8 Các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhiễm virus H5N1

Các biện pháp chủ yếu được áp dụng bao gồm: kiểm soát lây nhiễm, phòng bệnh bằng tiêm vaccine và sử dụng thuốc kháng virus[25]

Sử dụng thuốc kháng virus: Điều trị bằng cách sử dụng thuốc kháng virus, các loại thuốc này thường hoạt động theo một trong hai cơ chế: là thành phần ức chế kênh ion của M2 (amantadine), hoặc ức chế neuraminidase (oseltamivir)[28]

Kiểm soát lây nhiễm: Loại bỏ hoặc hạn chế tối đa nguồn gây nhiễm như gia cầm nhiễm bệnh là biện pháp phòng ngừa, kiểm soát dịch hiệu quả nhất Tiêu huỷ gia cầm nhiễm bệnh là biện pháp thành công trong các đợt dịch tại Hồng Kông, Hà Lan và Canada[8] Tuy nhiên, khi dịch bùng phát trên một khu vực rộng (Đông Nam Á), gia cầm được nuôi nhỏ lẻ, virus H5N1 là từ các loài chim di cư hoang dã thì chỉ tiêu huỷ tại khu vực bùng phát dịch sẽ đem lại hiệu quả không cao[25, 28]

Sử dụng vaccine: Hiện đã có rất nhiều cách tiếp cần khác nhau trong sản xuất vaccine virus cúm gia cầm như: sản xuất vaccine bất hoạt từ virus kiểu hoang dại; chọn lựa các chủng virus vaccine tương tự về khả năng tạo KT; sử dụng virus côn trùng để biểu hiện HA tái tổ hợp; vaccine DNA, plasmid phiên mã ngược để tạo chủng vaccine có các thành phần được làm yếu[50] Vaccine phổ biến hiện nay là:

+ Vaccine bất hoạt: chủng virus để sản xuất vaccine bất hoạt phải có tính KN giống với virus đang lưu hành và phát triển tốt trên phôi trứng Từ vụ dịch tại Hồng Kông (1997), chủng virus LPAI A/duck/Singapore/F119–3/97(H5N3) đã được lựa chọn trong nghiên cứu sản xuất vaccine virus cúm H5N1 cho người[54]

+ Vaccine sống: virus sống được làm yếu nhờ nhiệt độ lạnh và phun qua mũi Vaccine này gồm các virus tái tổ hợp chứa gen mã hoá cho HA và NA của chủng hoang dại, 6 gen còn lại là của chủng virus hoang dại đã bị biến tính Vaccine này có điều kiện gây nhiễm giống trong tự nhiên và gây phản ứng miễn dịch chéo

do kích thích tạo KT S-IgA, IgG và CTL[47]

+ Vaccine DNA: khi tiêm vaccine plasmid DNA mã hóa cho protein virus (NP, PR8 H1N1) cho chuột đã tạo khả năng miễn dịch chống virus cúm H3N2 Điều này cho thấy, vaccine DNA có thể gây phản ứng bảo vệ chéo giữa các subtype Hiệu quả của vaccine DNA mã hóa cho HA, NA cao hơn của NP[47]

+ Vaccine phiên mã ngược: hệ thống phiên mã ngược được sử dụng để tạo chủng virus cúm vaccine và rất hữu hiệu trong phòng ngừa các đại dịch cúm Các gen HA và NA từ virus gây bệnh được nhân dòng, trình tự vị trí cắt chứa các AA kiềm tính của HA được loại bỏ Plasmid được chuyển vào tế bào cùng plasmid mã hóa các gen khác của chủng A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) để tạo virus vaccine[50]

1.3 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm

Tỉ lệ nhiễm virus H5N1 thấp ở người cả trong điều kiện tiếp xúc với gia cầm nhiễm bệnh cho thấy việc ngăn ngừa lây nhiễm giữa các loài rất hiệu quả[5] Virus

cúm ở người thường gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-6 ở

tế bào biểu mô ống hô hấp, virus cúm gia cầm lại gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-3 ở các tế bào biểu mô ruột[65]

1.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Virus cúm xâm nhập vào cơ thể người chủ yếu qua đường hô hấp, được nhân lên trong tế bào trên bề mặt ống hô hấp, lớp tế bào này có tác dụng hạn chế sự lây truyền của virus vào các cơ quan khác, song lại làm tăng nguy cơ lây truyền virus sang các vật chủ khác khi virus tập trung ở đầu trên ống hô hấp Ống hô hấp của người có các cơ chế bảo vệ, ngăn ngừa sự xâm nhập của virus cúm như lớp nhầy, lớp lông mao và các thành phần ức chế là protease[1]

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu còn có sự tham gia của tế bào giết tự nhiên (NK) là nhóm tế bào lympho hạt lớn không đồng nhất, gồm CD3-, CD16+, CD56+ có khả năng giết tế bào nhiễm virus Cơ chế nhận biết tế bào nhiễm virus của tế bào NK vẫn chưa được biết rõ Tế bào NK giết tế bào nhiễm virus không có

sự đặc hiệu miễn dịch, không ghi nhớ, không có giới hạn phức hợp phù hợp tổ chức chính (Major Histocompatibility Complex - MHC) và không phụ thuộc vào KT Tế bào NK có vai trò quan trọng phòng vệ sớm do hoạt động của các tế bào này đạt cao nhất sau 1-2 ngày nhiễm Tế bào NK được hoạt hóa có interferon làm trung gian với

sự phối hợp của IL-2 và các tế bào NK cũng tiết ra cytokine IFN-γ và TNF-α[62]

Đại thực bào gồm đại thực bào tự do trong phế nang và màng bụng, đại thực bào cố định trong hạch lympho, lách, gan, tế bào mô và tế bào thần kinh đệm Đại thực bào cũng được hoạt hoá nhờ KT và bổ thể thông qua hiện tượng opsonin hoá Đại thực bào cũng được hoạt hoá nhờ cytokine do tế bào T tiết ra, thu hút chúng tới vùng bị nhiễm để làm nhiệm vụ thực bào[1] Các cytokinee như TNF, IL1 do đại thực bào tiết ra cũng tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu với virus Trong đó, TNF (α và β) do tế bào bạch cầu đơn nhân sinh ra, có tác dụng kháng virus, nhân nhanh và biệt hoá tế bào lympho T, lympho B, đại thực bào, và gây sốt IL1 (α và β) do tế bào bạch cầu đơn nhân và đại thực bào tiết ra, giúp nhân nhanh dòng tế bào T, thụ thể IL-2, KT và gây sốt[1]

Khi đã vượt qua các hàng rào bảo vệ nêu trên, virus sẽ nhiễm vào tế bào biểu

mô, tế bào này sẽ sản sinh và giải phóng ra cytokine, quan trọng nhất là

interleukin-6 (IL-interleukin-6) và IFN-α Hai cytokine này đạt nồng độ cao nhất sau 2 ngày nhiễm virus và chúng được sản sinh kèm theo các triệu chứng tiết dịch nhày và sốt[36] Các

interleukin khác xuất hiện sau như IL-8 và TNF-α IFN (α, β và γ) được cho rằng có vai trò kiểm soát sự nhân lên của virus do IFN là thành phần đối kháng với protein NS1 Khi loại bỏ protein NS1, lượng IFN và virus tăng lên nhanh chóng Việc tổng hợp interferon cùng phản ứng sốt có tác dụng ngăn chặn sự nhân lên của virus[36]

Sau khi cơ thể bị nhiễm virus, KT lần lượt được tiết ra Đầu tiên là IgM được tiết ra trong màng nhày ở giai đoạn nhiễm sớm, IgA và IgG sẽ được tạo thành sau 5-

7 ngày Khi cơ thể bị nhiễm lại virus, KT chủ yếu được tạo thành là IgG[1, 49] Kháng thể IgA dạng tiết (S-IgA) được sản xuất và vận chuyển đến màng nhầy trong ống hô hấp, tiêu hoá và niệu sinh dục IgA có tác dụng như một protease hơn là một immunoglobulin như các Ig khác IgA có hoạt tính trên bề mặt nhầy và trong sữa

Do vậy, IgA có vai trò trong việc kháng lại sự xâm nhiễm của virus vào đường hô hấp, tiêu hoá và niệu sinh dục[62] S-IgA, IgG và CTL còn tham gia quá trình phục hồi sau nhiễm virus S-IgA và IgG có trước khi nhiễm virus cúm giúp ngăn ngừa nhiễm virus vào cơ thể Kháng thể S-IgA được đưa tới màng nhầy bằng việc vận chuyển qua lớp biểu mô (được sử dụng cho IgA-dimer)[47] IgA đơn (monomer) tập trung nhiều trên biểu mô túi phổi giúp ngăn ngừa sự xâm nhiễm của virus cúm được thấm từ huyết thanh ra lớp dịch nhày theo cơ chế khuếch tán Khi cơ thể không IgA, sự tạo thành S-IgA và IgG sẽ được thúc đẩy bởi tế bào nhớ B khi bị nhiễm lại virus đó và các KT này thực hiện chức năng loại bỏ virus từ ngày thứ 3 kể

từ khi bị nhiễm lại[47] Trong tế bào biểu mô nhiễm virus, dIgA được vận chuyển qua các tế bào biểu mô sẽ ngăn chặn virus lắp ráp bằng cách liên kết với glycoprotein mới tổng hợp[47]

Đáp ứng miễn dịch tế bào: đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng nhất trong miễn dịch chống virus Ở người có hai nhóm tế bào lympho tham gia quá trình này:

+ Các peptit được tạo ra từ các KN nội sinh (được tổng hợp trong các tế bào nhiễm virus) sẽ được đưa lên MHC lớp I Sau đó phức hợp MHC lớp I và peptit sẽ được các tế bào CD8+ T (tế bào Tc) nhận ra, trong các KN nội sinh này thì các KN bên trong sẽ là đích chính của tế bào Tc[47] Tế bào Tc tiết ra protein phá huỷ màng

tế bào nhiễm virus làm thoát nội chất và giết chết tế bào Bên cạnh đó, các tế bào Tc này sẽ tấn công tế bào bị nhiễm virus khi KN của virus biểu hiện trên bề mặt tế bào này Các Tc trí nhớ được tạo thành sau khi cơ thể bị nhiễm virus hoặc được tiêm

vaccine Trong nghiên cứu, Tc trí nhớ được tạo thành in vitro bằng cách sử dụng

các KN để kích thích tế bào lympho ngoại biên Tuy nhiên, Tc trí nhớ này cho thấy

có sự phản ứng chéo giữa các chủng virus, cụ thể là Tc tác dụng tới các tế bào đích nhiễm virus cúm A thuộc tất cả các subtype, song chúng không tác dụng tới các tế bào nhiễm virus cúm B Việc các tế bào Tc nhận ra KN là glycoprotein (HA) hoặc không phải là glycoprotein (M, NP, PB2) sẽ quyết định mức độ đặc hiệu theo subtype Tế bào Tc cũng đóng vai trò trung gian trong quá trình loại bỏ virus cúm A

và loại bỏ RNA của virus cúm ra khỏi các mô của phổi[1, 36]

+ Các glycoprotein HA và NA là KN chính được các tế bào trình diện KN nhận vào và phân giải qua con đường thực bào, peptit của các KN này được đưa lên MHC lớp II và được thể hiện trên các tế bào trình diện KN Phức hợp MHC lớp II

và peptit được nhận ra bởi các tế bào CD4+ T (tế bào Th) Việc kích thích tế bào Th nhờ việc nhận biết KN sẽ dẫn tới cytokinee kích thích tế bào B KT kháng HA và

NA của virus KT khác HA sẽ trung hoà sự xâm nhiễm của virus trong khi đó KT kháng NA lại có tác dụng ngăn ngừa virus việc giải phóng của virus ra khỏi các tế bào bị nhiễm Do vậy, các KT đặc hiệu type hoặc subtype kháng HA và NA là những yếu tố chính chống lại sự xâm nhiễm của virus cúm KT kháng protein có tính KN ổn định M2 của virus cúm A có tác dụng bảo vệ chéo, chống lại sự xâm nhiễm của các subtype mặc dù cơ thể tiết ra KT này với một lượng rất nhỏ KT kháng protein có mức độ bảo thủ cao NP và M1 cũng có thể được tạo thành mặc dù chúng không có tác dụng bảo vệ[47] Các tế bào Th giúp tế bào B sản xuất ra KT và

hỗ trợ quá trình nhân lên của tế bào Tc, các tế bào này hỗ trợ đặc hiệu với KN M hoặc NP có thể hỗ trợ các tế bào B tiết ra KT đặc hiệu với HA của virus, theo đó có thể làm tăng phản ứng KT đối với các KN bảo vệ Ngoài ra, các tế bào Th2 (CD4+)

cũng có hoạt tính phân giải tế bào, với mức độ đặc hiệu KN tương tự như của các tế bào Tc Trong đáp ứng miễn dịch chống virus, vai trò của các tế bào Th được xác định bằng cách nghiên cứu các động vật không chứa tế bào Tc, khi đó virus cúm A được loại bỏ bằng một cơ chế phụ thuộc vào tế bào Th Các dòng tế bào Th đặc hiệu với virus cúm A tự nó không thể loại bỏ được virus, mà chúng phải cần tới các tế bào B để thực hiện việc này Như vậy, vai trò kháng virus quan trọng nhất của các

tế bào Th là giúp đỡ tế bào B sản sinh ra KT kháng virus do tế bào Th có thể nhận biết được các quyết định KN (epitop) trên protein của các virus cúm[1, 47, 62]

Quá trình thực bào đóng vai trò quan trọng trong phân hủy virus và được kích thích bởi tế bào Th Ngay sau khi bị nhiễm virus, các hạt virus sẽ bị thực bào bởi đại thực bào Protein của virus bị phân cắt thành các đoạn peptit ngắn liên kết với protein MHC lớp II và được đưa ra trên bề mặt đại thực bào Sự kết hợp trên sẽ được các dòng tế bào lympho Th nhận ra Các tế bào Th1 phản ứng lại bằng cách nhân nhanh dòng tế bào này và giải phóng ra lymphokine giúp tập trung các tế bào đơn nhân trong máu, nhân nhanh và biệt hóa thành đại thực bào được hoạt hóa Các

tế bào giết tự nhiên (NK) cũng tham gia vào quá trình này, quá trình sinh trưởng của

tế bào NK được kích thích bởi interferon (IL2) do Th sinh ra[47]

sẽ được loại bỏ bởi Tc, các tế bào này sẽ tăng lên nhanh chóng sau ngày thứ 3 nhờ các tế bào trí nhớ Do vậy, tác dụng bảo vệ chéo trong giai đoạn 2 là nhờ có sự tham gia phản ứng của Tc

1.4 Các phương pháp chẩn đoán virus

Việc chẩn đoán virus được chia thành 3 nhóm chính: chẩn đoán trực tiếp, gián tiếp và huyết thanh học[17] Sự thành công của phương pháp chẩn đoán virus cũng phụ thuộc vào chất lượng của mẫu, điều kiện vận chuyển, bảo quản mẫu, và thời điểm mẫu Mẫu có thể là mẫu ngoáy mũi, ngoáy họng, dịch phổi, mẫu máu Để chẩn đoán trực tiếp sự có mặt của KN hoặc DNA virus, mẫu thường được thu nhận trong vòng 2-3 ngày đầu kể từ khi xuất hiện triệu chứng bệnh[37]

1.4.1 Phương pháp chẩn đoán trực tiếp

Mẫu bệnh phẩm được kiểm tra trực tiếp để xác định sự có mặt của virus (KN hay nucleic acid) Trong đó, các phương pháp được sử dụng phổ biến gồm:

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA): phản ứng HA dựa trên khả năng gây ngưng kết hồng cầu của virus được sử dụng để chẩn đoán virus, chuẩn độ KN chuẩn hoặc mẫu bệnh phẩm Một lượng KN xác định được cho vào các giếng của tấm 96 giếng, lần lượt pha loãng bậc 2, bổ sung tế bào hồng cầu vào các giếng, sau một thời gian ủ nhất định, tiến hành đọc kết quả, mẫu dương tính (chứa virus) là mẫu có

tế bào hồng cầu bị ngưng kết hoàn toàn Độ pha loãng virus cao nhất có ngưng kết hoàn toàn chính là hiệu giá HA[37]

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): phản ứng HI được Hirst mô tả lần đầu tiên vào năm 1942 HI được sử dụng để chẩn đoán virus trong mẫu HA của virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, KT gắn đặc hiệu với các vị trí KN trên phân tử HA liên kết với thụ thể của hồng cầu, gây ức chế sự ngưng kết hồng cầu và chính là cơ sở của HI Phản ứng được thực hiện trên các tấm 96 giếng Một lượng

KN xác định được trộn với các kháng huyết thanh chuẩn đặc hiệu, kháng huyết thanh được pha loãng bậc 2, sau đó cho tế bào hồng cầu vào mỗi giếng để xác định liên kết đặc hiệu của KT với HA Hồng cầu không ngưng kết sẽ tạo thành hạt trong giếng, hồng cầu ngưng kết sẽ tạo cấu trúc mạng lưới gắn vào thành giếng HI được WHO xem là phương pháp “chuẩn vàng” trong xác định, phân type virus[13, 37]

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử (EM): việc chẩn đoán virus bằng kính hiển vi dựa trên khả năng phát hiện và xác định virus với những hiểu biết về đặc điểm hình thái học của virus Ưu điểm của EM là quan sát được hình ảnh thực của virus (hình 1.7), cho phép phát hiện các chủng virus mới[17], và có thể tiến hành xử

lí mẫu chỉ trong vài phút, do vậy, EM được sử dụng trong chẩn đoán nhanh virus Tuy nhiên, EM có hạn chế: không thể kiểm tra nhiều mẫu cùng một lúc, số lượng

virus cần đạt tối thiểu khoảng 106 virion/ml, chi phí cho EM cao và cần kĩ thuật viên có trình độ để thực hiện Do vậy, EM thường được sử dụng để khẳng định lại kết quả phân lập virus từ tế bào[17]

Hình 1.7: Ảnh chụp virus cúm dưới kính hiển virus điện tử (http://www.uct.ac.za)

Ngoài ra, phương pháp kính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM) sử dụng kháng huyết thanh kháng virus giúp tập trung virus thành cụm để phát hiện được virus trong mẫu có mật độ thấp và làm tăng độ đặc hiệu Phương pháp kính hiển vi điện

tử miễn dịch gắn vàng, trong đó kháng huyết thanh đặc hiệu với virus (KT thứ nhất) gắn với virus, KT thứ hai gắn vàng để đánh dấu các hạt virus Nhờ đó, có thể xác định được virus ở mật độ rất thấp với hình ảnh rõ và đặc hiệu hơn[44]

Phản ứng chuỗi trùng hợp transcriptase ngược (RT-PCR): là kĩ thuật hiệu quả cho phép xác định genome của virus cúm với lượng mẫu rất nhỏ Do virus cúm

có genome là chuỗi RNA mạch đơn, nên phải tổng hợp bản DNA bổ sung (cDNA) trước khi tiến hành PCR với enzyme reverse transcriptase (RT) Do đoạn DNA được tạo thành ở chu kì trước sẽ làm khuôn cho chu kì tiếp theo, sau mỗi chu kì, lượng DNA tăng gấp đôi, nên RT-PCR này có độ nhạy cao và việc lựa chọn cặp mồi có vai trò quyết định Cặp mồi được thiết kế dựa trên những trình tự đã biết như gen mã hoá cho HA của chủng virus đã được phát hiện[37] RT-PCR có ưu điểm:

sử dụng thuận tiện, nhanh, độ nhạy cao (phát hiện tới 102 bản sao) Nhược điểm của RT-PCR là dễ nhiễm chéo, do vậy cần phải giảm tối đa nguy cơ gây nhiễm[25]

Multiplex RT-PCR: là sự phát triển của RT-PCR, kĩ thuật multiplex sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng, các cặp mồi có thể là trình tự

mã hóa cho các protein của một virus (HA, NA, M, NP), trình tự mã hóa cho protein của các subtype (H1; H3; H5), các virus khác nhau (cúm A, B, C) Stockton (1998) đã áp dụng multiplex RT-PCR để phát hiện và xác định subtype của virus

cúm A (H1N1, H3N2), cúm B, virus hợp bào hô hấp (RSV) trong mẫu thu nhận được ở Anh Kết quả thu được hoàn toàn giống (100%) với các phương pháp xác định thông thường Multiplex RT-PCR cũng cho phép xác định nhiều virus khác nhau trong một hỗn hợp, nhờ đó có thể xác định được sự lây nhiễm đồng thời của các virus trong một mẫu bệnh phẩm[51]

Real-time PCR: là sự kết hợp của RT-PCR với việc phát hiện các sản phẩm được khuếch đại trong một hệ kín, cho phép xác định lượng virus có trong mẫu[15] Việc xác định được lượng virus trong huyết thanh có ý nghĩa quan trọng trong điều chỉnh các liệu pháp điều trị nhiễm virus (sử dụng thuốc kháng virus) Hơn nữa, phản ứng giúp làm giảm đáng kể nguy cơ tạp nhiễm[40]

1.4.2 Phương pháp chẩn đoán gián tiếp

Phương pháp này có thể sử dụng in situ, nhờ đó xác định được vị trí gây

nhiễm, loại tế bào gây nhiễm Mẫu được đưa vào trong trứng, tế bào hoặc động vật nhằm làm tăng lượng virus có trong mẫu Ưu điểm của phương pháp này là lượng virus thu nhận sẽ được sử dụng trong bước xác định KN và phân tử sau đó, và có thể được sử dụng để điều chế vaccine hoặc kiểm tra độ nhạy cảm với thuốc và cho phép gây nhiễm nhiều chủng virus cùng lúc[37] Nhược điểm của phương pháp là chỉ có một số chủng virus có thể gây nhiễm và phát triển trên tế bào, các chủng virus mới rất khó phát triển trên tế bào, các chủng virus có độc lực cao thường gây chết phôi trứng gây khó khăn trong việc nuôi và nhân các chủng này trên trứng[37]

Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong phôi gà

10-12 ngày tuổi, cụ thể là trong khoang túi niệu hoặc túi ối của phôi gà[1] Sau khi gây nhiễm trứng 48-72 giờ, thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và kiểu huyết thanh (serotype) của virus bằng các phản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT-PCR Với chủng virus có độc lực cao, phôi có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm Để chẩn đoán virus cúm, có thể được kết hợp cùng với phương pháp chẩn đoán từ trứng và tế bào[1, 37]

Phân lập từ tế bào: trong phân lập virus cúm, dòng tế bào thường được sử dụng nhất là tế bào thận chó (MDCK)[37] Ngoài ra, còn có thể sử dụng một số dòng tế bào khác như RMK (LLC-MK2, Vero hoặc tế bào thận khỉ tiên phát)[16]

Tế bào nuôi cấy trên đĩa hoặc trong chai nuôi cấy tạo thành một lớp và được nhiễm virus Môi trường gây nhiễm có thể có thêm trypsin giúp tăng cường khả năng lây nhiễm của virus Sau 18-24 giờ, các dấu hiệu huỷ hoại tế bào tế bào do virus cúm

gây ra được quan sát dưới kính hiển vi, dịch nuôi cấy được thu nhận để xác định tính gây ngưng kết của virus Nếu virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, tiếp tục phân nhóm H và N bằng kĩ thuật HI và ức chế enzyme neuraminidase (NAI) với kháng huyết thanh chuẩn hoặc bằng RT-PCR[25]

1.4.3 Phương pháp huyết thanh học

Chẩn đoán huyết thanh học nhằm xác định sự có mặt của IgM hoặc sự tăng lên của hiệu giá KT từ giai đoạn cấp đến phục hồi Huyết thanh đơn cũng được sử dụng trong các điều tra này để xác định mức độ tiếp xúc của cộng đồng với virus

Phản ứng ức chế neuraminidase (NAI) và NA: NA là một enzyme và là glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt virion cúm NA cắt sialic acid cuối cùng liên kết tế bào và virus, giải phóng virus khỏi tế bào[37] Xét nghiệm xác định hoạt tính NA của virus cúm bằng cách phát hiện sialic acid tự do trong mẫu Virus pha loãng được trộn với một lượng cơ chất (fetuin) xác định và ủ qua đêm ở 370C Các mẫu chứa virus pha loãng sẽ giải phóng ra sialic acid tự do từ cơ chất fetuin Lượng sialic acid sẽ được xác định bằng xét nghiệm tạo màu hồng với thiobarbituric acid, lượng sialic acid được giải phóng tương ứng với lượng virus cúm có trong mẫu Màu hồng tạo thành được định lượng bằng máy đo quang phổ[37] Tiếp theo, chuẩn độ kháng huyết thanh chuẩn cho mỗi subtype NA Huyết thanh này được chuẩn bị ở các động vật (dê, cừu, gà) để thu được huyết thanh đặc hiệu cho từng NA Subtype NA của virus cúm được xác định bằng kháng huyết thanh chuẩn Trong NAI, KT trong huyết thanh sẽ phân biết các subtype NA và ức chế hoạt tính của enzyme virus đối với cơ chất fetuin, do đó màu hồng sẽ không xuất hiện[37] NAI còn được sử dụng để khẳng định lại kết quả của phản ứng HI và phản ứng trung hoà virus NAI được tiến hành với các KN đã biết, các bước thực hiện hoàn toàn tương tự các bước nêu trên

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học nhiễm virus ở người và động vật Các bước tiến hành phản ứng tương tự với phản ứng HI dùng cho xác định subtype virus cúm, chỉ khác là cần có

KN virus chuẩn và mẫu là huyết thanh thu nhận từ thực địa Mẫu dương tính là mẫu

có chứa KT đặc hiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị ngưng kết, tạo thành hạt trong giếng[13, 37] HI vẫn còn một số nhược điểm: phải loại bỏ hết các yếu tố ức chế không đặc hiệu trong huyết thanh; phải chuẩn lại KN trước mỗi phản ứng; và cần người có chuyên môn và kinh nghiệm để đọc kết quả phản ứng[13, 37]

Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện

KT kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh KN toàn phần của virus (H5) hoặc protein HA tinh chế được chạy điện di trên gel, sau đó chuyển sang màng nitrocellulose hoặc nylon Màng chứa KN được cắt thành các băng nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, KT đặc hiệu trong huyết thanh sẽ liên kết với KN gắn trên màng Tiến hành ủ các băng nêu trên với KT kháng người có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm hoặc peroxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin-HRP Vị trí gắn KT kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với cơ chất của enzyme hoặc chất tạo màu WB có độ nhạy cao, được sử dụng để khẳng định lại kết quả của kĩ thuật khác Tuy nhiên, do có độ nhạy cao nên trong chẩn đoán virus cúm, WB rất dễ cho kết quả chéo giữa các subtype[41]

1.4.3.1 Serial radial hemalysis (SRH)

SRH trên gel lần đầu tiên được Weiler (1965) sử dụng để xác định hoạt tính phân hủy hồng cầu của IgG chuột[67] KN được gắn cố định với hồng cầu trong agaro chứa bổ thể Tạo các giếng chứa mẫu huyết thanh trên bản agaro KT kháng virus và bổ thể sẽ phân giải tế bào hồng cầu có KN trên bề mặt, kết quả là các vùng

có tế bào hồng cầu bị phân giải xuất hiện xung quanh giếng SRH có ưu điểm: đơn giản, chi phí thấp, cần lượng KT ít và có độ nhạy tương đương với HI Tuy nhiên,

kĩ thuật này mất nhiều thời gian và công sức[67]

Phản ứng ELISA đặc hiệu với HA: được tiến hành gồm bước phủ lượng xác định HA trên các giếng của tấm 96 giếng Mẫu huyết thanh được pha loãng, ủ với

KN trong giếng, bổ sung KT thứ hai được đánh dấu, ủ trong một khoảng thời gian xác định, cho cơ chất vào, làm dừng phản ứng và đo độ hấp thụ ánh sáng với bước sóng phù hợp Với phản ứng ELISA, hiệu giá thu được lớn hơn hoặc bằng 1600 sẽ được coi là dương tính[41]

Kĩ thuật trung hoà virus: là phương pháp huyết thanh học có độ nhạy và đặc hiệu cao được sử dụng để xác định KT đặc hiệu với virus trong huyết thanh Kĩ thuật gồm: phản ứng của virus với KT, trong đó virus được trộn và ủ với KT phù hợp, và bước ủ hỗn hợp virus-KT trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi cấy, phôi trứng…) để xác định sự xâm nhiễm của virus Nếu không có sự xâm nhiễm của virus, tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có KT đặc hiệu với virus[37]

Kĩ thuật trung hoà virus cũng được sử dụng để khẳng định kết quả của phản ứng HI

KT trung hoà ít có phản ứng chéo giữa các virus hơn so với KT dùng trong HI, do

vậy, khi sử dụng các KT cùng nhau trong phản ứng trung hoà sẽ cung cấp các thông tin bổ sung cho việc nhận dạng virus xâm nhiễm

Trung hòa vi lượng (MN): là kĩ thuật trung hoà virus được thực hiện trên tấm

96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng ELISA sau 18-22 giờ kể từ khi gây nhiễm Do vậy, so với kĩ thuật trung hoà virus thông thường, kĩ thuật MN cho kết quả nhanh, chính xác, khách quan hơn và có thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một tấm 96 giếng

1.5 Kĩ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization)

1.5.1 Cơ sở của kĩ thuật

Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung hòa virus của KT đặc hiệu có trong huyết thanh giúp ức chế sự xâm nhiễm của virus lên tế bào nuôi cấy

Huyết thanh được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tế bào được cho vào hỗn hợp huyết thanh-virus nêu trên Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng ELISA

1.5.2 Ứng dụng kĩ thuật trong chẩn đoán virus

Ứng dụng trong chẩn đoán virus cúm: kĩ thuật MN được Wulff cùng các cộng sự sử dụng trong chẩn đoán virus cúm lần đầu tiên năm 1967, trong đó virus cúm được gây nhiễm trên dòng tế bào RMK (rhesus monkey kidney cells) Năm

1980, kĩ thuật này được Arthur cùng các cộng sự đã phát triển hoàn thiện hơn với việc sử dụng một lớp tế bào nuôi cấy liên tục MDCK và LLC-MK2 trong môi trường có trypsin, cho phép tiến hành chẩn đoán đồng thời một số lượng lớn mẫu huyết thanh[14]

Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Rowe đã tiến hành xác định KT kháng virus cúm A (H5N1) trong huyết thanh người kết hợp nhiều xét nghiệm huyết thanh bao gồm HI, MN và Westen Blot[42] Kết quả thu được cho thấy phương pháp HI

có độ nhạy thấp hơn so với phương pháp MN khi được sử dụng để phát hiện các KT kháng virus cúm gia cầm H5N1 trong huyết thanh người Trong đó, việc kết hợp phương pháp MN với Western Blot có thể đạt được độ nhạy cao nhất (80%) và mức

độ đặc hiệu (96%) đối với KT kháng H5 trong huyết thanh của những người trong

độ tuổi từ 18 tới 59 Việc kết hợp này có thể được sử dụng trong điều tra huyết thanh dịch tễ học các đợt bùng phát dịch do virus cúm A H5N1[42]

Năm 2005, kĩ thuật MN được sử dụng cùng với các kĩ thuật khác như PCR, real-time PCR, HI để xác định ca nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở Trung Quốc Qua nghiên cứu này, Hongjie Yu và Yuelong Shu đã chỉ ra rằng khả năng virus truyền từ người sang người là rất thấp[68]

RT-Ứng dụng trong chẩn đoán các virus: ngoài virus cúm, kĩ thuật MN còn được

sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học của nhất nhiều virus khác như virus SARS, dengue, virus herpes, virus quai bị, virus sởi [60, 12]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Mẫu huyết thanh

Mẫu huyết thanh của những người tiếp xúc với bệnh nhân nhiễm H5N1 và những người tiếp xúc với gia cầm, cụ thể là người chăn nuôi gia cầm, cán bộ thú y, cán bộ tham gia tiêu huỷ gia cầm, cán bộ y tế chăm sóc và điều trị cho bệnh nhân và người nhà bệnh nhân thu thập từ 9/2006 tới 3/2007 tại 3 tỉnh: Hà Tây, Hải Dương

và Thái Bình là các địa phương đã được ghi nhận là có bùng phát dịch cúm gia cầm H5N1 trong các vụ dịch năm 2003-2004 Hơn nữa, ở cả ba tỉnh này đều có những bệnh nhân và người tử vong được xác định là do nhiễm virus H5N1

Các mẫu huyết thanh được sàng lọc bằng phản ứng HI, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên bằng chương trình thống kê SPSS 15.0 các mẫu huyết thanh cho phản ứng MN trong số các mẫu huyết thanh có hiệu giá (HI ≥ 10, 112 mẫu) và một số mẫu không có hiệu giá (HI <10,197 mẫu) Các phản ứng HI được thực hiện bởi cử nhân Trần Thị Sao Mai, bộ môn Vi sinh vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong khoảng thời gian 2006-2007

Mẫu huyết thanh được sử dụng làm đối chứng âm được thu nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu, mẫu đối chứng âm này đã được kiểm tra bằng phương pháp WB và HI Các mẫu huyết thanh dương tính của gà được thu nhận từ gà được gây miễn dịch bằng chủng virus H5N1 hoang dã do tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng - Viện Thú Y Trung ương cung cấp và huyết thanh dương tính của cừu được thu nhận

từ cừu được gây miễn dịch bằng chủng virus H5N1 A/Vietnam/1203/04 đã được bất hoạt, sau đó được trộn với huyết thanh người đối chứng âm nêu trên theo tỉ lệ 1:1 được cung cấp bởi Tiến sĩ Levandowski – Viện nghiên cứu sức khỏe Quốc gia Hoa

Kỳ (NIH)

2.2 Vật liệu

2.2.1 Dòng tế bào

Dòng tế bào thận chó Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) do tiến sĩ Michel Garcia, Trung tâm nghiên cứu Pasteur – Trường Đại học tổng hợp Hồng Kông cung cấp

Jean-2.2.2 Chủng virus

Chủng virus vaccine A/Vietnam/1194/2004/H5N1 do TS Đinh Duy Kháng, Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam cung cấp

- KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase 1mg/ml (Goat anti-mouse peroxidase conjugated) (Công ty KPL, Mỹ)

IgG-2.2.4 Môi trường và hoá chất

¾ Môi trường nuôi cấy và rửa tế bào MDCK

Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) không đầy đủ:

- DMEM (Gibco, Cat # 12100-046): một gói được hòa tan trong 970 ml nước cất 3 lần;

- NaHCO3: 3,7g;

- Sử dụng HCl để chỉnh pH đạt 7,2;

- Kháng sinh 100x (Gibco 15240-062): 10 ml;

- HEPES 1M: 20 ml;