Tỉ lệ nhiễm virus H5N1 thấp ở người cả trong điều kiện tiếp xúc với gia cầm nhiễm bệnh cho thấy việc ngăn ngừa lây nhiễm giữa các loài rất hiệu quả[5]. Virus
cúm ở người thường gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-6 ở tế bào biểu mô ống hô hấp, virus cúm gia cầm lại gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-3 ở các tế bào biểu mô ruột[65].
1.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu
Virus cúm xâm nhập vào cơ thể người chủ yếu qua đường hô hấp, được nhân lên trong tế bào trên bề mặt ống hô hấp, lớp tế bào này có tác dụng hạn chế sự lây truyền của virus vào các cơ quan khác, song lại làm tăng nguy cơ lây truyền virus sang các vật chủ khác khi virus tập trung ở đầu trên ống hô hấp. Ống hô hấp của người có các cơ chế bảo vệ, ngăn ngừa sự xâm nhập của virus cúm như lớp nhầy, lớp lông mao và các thành phần ức chế là protease[1].
Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu còn có sự tham gia của tế bào giết tự nhiên (NK) là nhóm tế bào lympho hạt lớn không đồng nhất, gồm CD3-, CD16+, CD56+ có khả năng giết tế bào nhiễm virus. Cơ chế nhận biết tế bào nhiễm virus của tế bào NK vẫn chưa được biết rõ. Tế bào NK giết tế bào nhiễm virus không có sự đặc hiệu miễn dịch, không ghi nhớ, không có giới hạn phức hợp phù hợp tổ chức chính (Major Histocompatibility Complex - MHC) và không phụ thuộc vào KT. Tế bào NK có vai trò quan trọng phòng vệ sớm do hoạt động của các tế bào này đạt cao nhất sau 1-2 ngày nhiễm. Tế bào NK được hoạt hóa có interferon làm trung gian với sự phối hợp của IL-2 và các tế bào NK cũng tiết ra cytokine IFN-γ và TNF-α[62].
Đại thực bào gồm đại thực bào tự do trong phế nang và màng bụng, đại thực bào cố định trong hạch lympho, lách, gan, tế bào mô và tế bào thần kinh đệm. Đại thực bào cũng được hoạt hoá nhờ KT và bổ thể thông qua hiện tượng opsonin hoá. Đại thực bào cũng được hoạt hoá nhờ cytokine do tế bào T tiết ra, thu hút chúng tới vùng bị nhiễm để làm nhiệm vụ thực bào[1]. Các cytokinee như TNF, IL1 do đại thực bào tiết ra cũng tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu với virus. Trong đó, TNF (α và β) do tế bào bạch cầu đơn nhân sinh ra, có tác dụng kháng virus, nhân nhanh và biệt hoá tế bào lympho T, lympho B, đại thực bào, và gây sốt. IL1 (α và β) do tế bào bạch cầu đơn nhân và đại thực bào tiết ra, giúp nhân nhanh dòng tế bào T, thụ thể IL-2, KT và gây sốt[1].
Khi đã vượt qua các hàng rào bảo vệ nêu trên, virus sẽ nhiễm vào tế bào biểu mô, tế bào này sẽ sản sinh và giải phóng ra cytokine, quan trọng nhất là interleukin- 6 (IL-6) và IFN-α. Hai cytokine này đạt nồng độ cao nhất sau 2 ngày nhiễm virus và chúng được sản sinh kèm theo các triệu chứng tiết dịch nhày và sốt[36]. Các
interleukin khác xuất hiện sau như IL-8 và TNF-α. IFN (α, β và γ) được cho rằng có vai trò kiểm soát sự nhân lên của virus do IFN là thành phần đối kháng với protein NS1. Khi loại bỏ protein NS1, lượng IFN và virus tăng lên nhanh chóng. Việc tổng hợp interferon cùng phản ứng sốt có tác dụng ngăn chặn sự nhân lên của virus[36].
1.3.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Đáp ứng miễn dịch dịch thể: khi bị nhiễm virus, cơ thể sẽ sản sinh ra KT đặc hiệu kháng lại các thành phần HA, NA, NP và M của virus. Trong đó, chỉ có các KT đặc hiệu với HA và NA có liên quan tới khả năng chống xâm nhiễm đặc hiệu[36]. Nồng độ KT đặc hiệu với hai loại KN này trong máu tăng lên có liên quan tới khả năng chống lại tình trạng suy yếu của cơ thể, ức chế sự nhân lên của virus trong ống hô hấp[36]. KT đặc hiệu với HA có thể ức chế quá trình nhân lên của virus nhờ tác dụng trung hoà virus trong khi các KT kháng NA gián tiếp chống virus bằng cách giới hạn virus trong ống hô hấp. Ngoài ra, KT do tế bào tiết ra còn thực hiện nhiều chức năng như ngăn chặn virus xâm nhập vào tế bào; ngăn cản virus gắn lên bề mặt tế bào; hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển và tham gia phản ứng gây độc tế bào phụ thuộc KT[1].
Sau khi cơ thể bị nhiễm virus, KT lần lượt được tiết ra. Đầu tiên là IgM được tiết ra trong màng nhày ở giai đoạn nhiễm sớm, IgA và IgG sẽ được tạo thành sau 5- 7 ngày. Khi cơ thể bị nhiễm lại virus, KT chủ yếu được tạo thành là IgG[1, 49]. Kháng thể IgA dạng tiết (S-IgA) được sản xuất và vận chuyển đến màng nhầy trong ống hô hấp, tiêu hoá và niệu sinh dục. IgA có tác dụng như một protease hơn là một immunoglobulin như các Ig khác. IgA có hoạt tính trên bề mặt nhầy và trong sữa. Do vậy, IgA có vai trò trong việc kháng lại sự xâm nhiễm của virus vào đường hô hấp, tiêu hoá và niệu sinh dục[62]. S-IgA, IgG và CTL còn tham gia quá trình phục hồi sau nhiễm virus. S-IgA và IgG có trước khi nhiễm virus cúm giúp ngăn ngừa nhiễm virus vào cơ thể. Kháng thể S-IgA được đưa tới màng nhầy bằng việc vận chuyển qua lớp biểu mô (được sử dụng cho IgA-dimer)[47]. IgA đơn (monomer) tập trung nhiều trên biểu mô túi phổi giúp ngăn ngừa sự xâm nhiễm của virus cúm được thấm từ huyết thanh ra lớp dịch nhày theo cơ chế khuếch tán. Khi cơ thể không IgA, sự tạo thành S-IgA và IgG sẽ được thúc đẩy bởi tế bào nhớ B khi bị nhiễm lại virus đó và các KT này thực hiện chức năng loại bỏ virus từ ngày thứ 3 kể từ khi bị nhiễm lại[47]. Trong tế bào biểu mô nhiễm virus, dIgA được vận chuyển qua các tế bào biểu mô sẽ ngăn chặn virus lắp ráp bằng cách liên kết với glycoprotein mới tổng hợp[47].
Đáp ứng miễn dịch tế bào: đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng nhất trong miễn dịch chống virus. Ở người có hai nhóm tế bào lympho tham gia quá trình này:
+ Các peptit được tạo ra từ các KN nội sinh (được tổng hợp trong các tế bào nhiễm virus) sẽ được đưa lên MHC lớp I. Sau đó phức hợp MHC lớp I và peptit sẽ được các tế bào CD8+ T (tế bào Tc) nhận ra, trong các KN nội sinh này thì các KN bên trong sẽ là đích chính của tế bào Tc[47]. Tế bào Tc tiết ra protein phá huỷ màng tế bào nhiễm virus làm thoát nội chất và giết chết tế bào. Bên cạnh đó, các tế bào Tc này sẽ tấn công tế bào bị nhiễm virus khi KN của virus biểu hiện trên bề mặt tế bào này. Các Tc trí nhớ được tạo thành sau khi cơ thể bị nhiễm virus hoặc được tiêm vaccine. Trong nghiên cứu, Tc trí nhớ được tạo thành in vitro bằng cách sử dụng các KN để kích thích tế bào lympho ngoại biên. Tuy nhiên, Tc trí nhớ này cho thấy có sự phản ứng chéo giữa các chủng virus, cụ thể là Tc tác dụng tới các tế bào đích nhiễm virus cúm A thuộc tất cả các subtype, song chúng không tác dụng tới các tế bào nhiễm virus cúm B. Việc các tế bào Tc nhận ra KN là glycoprotein (HA) hoặc không phải là glycoprotein (M, NP, PB2) sẽ quyết định mức độ đặc hiệu theo subtype. Tế bào Tc cũng đóng vai trò trung gian trong quá trình loại bỏ virus cúm A và loại bỏ RNA của virus cúm ra khỏi các mô của phổi[1, 36].
+ Các glycoprotein HA và NA là KN chính được các tế bào trình diện KN nhận vào và phân giải qua con đường thực bào, peptit của các KN này được đưa lên MHC lớp II và được thể hiện trên các tế bào trình diện KN. Phức hợp MHC lớp II và peptit được nhận ra bởi các tế bào CD4+ T (tế bào Th). Việc kích thích tế bào Th nhờ việc nhận biết KN sẽ dẫn tới cytokinee kích thích tế bào B KT kháng HA và NA của virus. KT khác HA sẽ trung hoà sự xâm nhiễm của virus trong khi đó KT kháng NA lại có tác dụng ngăn ngừa virus việc giải phóng của virus ra khỏi các tế bào bị nhiễm. Do vậy, các KT đặc hiệu type hoặc subtype kháng HA và NA là những yếu tố chính chống lại sự xâm nhiễm của virus cúm. KT kháng protein có tính KN ổn định M2 của virus cúm A có tác dụng bảo vệ chéo, chống lại sự xâm nhiễm của các subtype mặc dù cơ thể tiết ra KT này với một lượng rất nhỏ. KT kháng protein có mức độ bảo thủ cao NP và M1 cũng có thể được tạo thành mặc dù chúng không có tác dụng bảo vệ[47]. Các tế bào Th giúp tế bào B sản xuất ra KT và hỗ trợ quá trình nhân lên của tế bào Tc, các tế bào này hỗ trợ đặc hiệu với KN M hoặc NP có thể hỗ trợ các tế bào B tiết ra KT đặc hiệu với HA của virus, theo đó có thể làm tăng phản ứng KT đối với các KN bảo vệ. Ngoài ra, các tế bào Th2 (CD4+)
cũng có hoạt tính phân giải tế bào, với mức độ đặc hiệu KN tương tự như của các tế bào Tc. Trong đáp ứng miễn dịch chống virus, vai trò của các tế bào Th được xác định bằng cách nghiên cứu các động vật không chứa tế bào Tc, khi đó virus cúm A được loại bỏ bằng một cơ chế phụ thuộc vào tế bào Th. Các dòng tế bào Th đặc hiệu với virus cúm A tự nó không thể loại bỏ được virus, mà chúng phải cần tới các tế bào B để thực hiện việc này. Như vậy, vai trò kháng virus quan trọng nhất của các tế bào Th là giúp đỡ tế bào B sản sinh ra KT kháng virus do tế bào Th có thể nhận biết được các quyết định KN (epitop) trên protein của các virus cúm[1, 47, 62].
Quá trình thực bào đóng vai trò quan trọng trong phân hủy virus và được kích thích bởi tế bào Th. Ngay sau khi bị nhiễm virus, các hạt virus sẽ bị thực bào bởi đại thực bào. Protein của virus bị phân cắt thành các đoạn peptit ngắn liên kết với protein MHC lớp II và được đưa ra trên bề mặt đại thực bào. Sự kết hợp trên sẽ được các dòng tế bào lympho Th nhận ra. Các tế bào Th1 phản ứng lại bằng cách nhân nhanh dòng tế bào này và giải phóng ra lymphokine giúp tập trung các tế bào đơn nhân trong máu, nhân nhanh và biệt hóa thành đại thực bào được hoạt hóa. Các tế bào giết tự nhiên (NK) cũng tham gia vào quá trình này, quá trình sinh trưởng của tế bào NK được kích thích bởi interferon (IL2) do Th sinh ra[47].
1.3.3 Tác dụng bảo vệ chéo
Tác dụng bảo vệ chéo chống lại sự xâm nhiễm do thay đổi KN trong một subtype của virus cúm A đã được xác định ở cả người và chuột[47]. Tác dụng bảo vệ chéo là do sự tạo thành của IgA có khả năng bảo vệ chéo. Chuột đã nhiễm virus H3N1 trước đó có khả năng miễn dịch cao đối với sự xâm nhiễm của virus H3N2. Có thể có KT S-IgA bảo vệ chéo đặc hiệu với hai virus nêu trên. Tác dụng bảo vệ chéo là nhờ sự có mặt của KT S-IgA kháng HA hoặc kháng virus trong ống hô hấp. Phản ứng bảo vệ chéo giúp loại bỏ các virus type A khỏi phần trên ống hô hấp được chia thành 2 giai đoạn: từ 0-3 ngày sau gây nhiễm, các KT tồn tại từ trước có tác dụng bảo vệ đặc hiệu type hoặc subtype. Do vậy, giai đoạn 1 hạn chế nguy cơ nhiễm virus bằng việc tạo thành phức hợp miễn dịch giữa subtype virus mới và virus hiện có hoặc KT phản ứng chéo là kết quả của phản ứng trung hoà virus. Sau ngày thứ 3 kể từ khi gây nhiễm, virus mới và các thế hệ virus còn lại sau giai đoạn 1 sẽ được loại bỏ bởi Tc, các tế bào này sẽ tăng lên nhanh chóng sau ngày thứ 3 nhờ các tế bào trí nhớ. Do vậy, tác dụng bảo vệ chéo trong giai đoạn 2 là nhờ có sự tham gia phản ứng của Tc.
1.4 Các phương pháp chẩn đoán virus
Việc chẩn đoán virus được chia thành 3 nhóm chính: chẩn đoán trực tiếp, gián tiếp và huyết thanh học[17]. Sự thành công của phương pháp chẩn đoán virus cũng phụ thuộc vào chất lượng của mẫu, điều kiện vận chuyển, bảo quản mẫu, và thời điểm mẫu. Mẫu có thể là mẫu ngoáy mũi, ngoáy họng, dịch phổi, mẫu máu. Để chẩn đoán trực tiếp sự có mặt của KN hoặc DNA virus, mẫu thường được thu nhận trong vòng 2-3 ngày đầu kể từ khi xuất hiện triệu chứng bệnh[37].
1.4.1 Phương pháp chẩn đoán trực tiếp
Mẫu bệnh phẩm được kiểm tra trực tiếp để xác định sự có mặt của virus (KN hay nucleic acid). Trong đó, các phương pháp được sử dụng phổ biến gồm:
Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA): phản ứng HA dựa trên khả năng gây ngưng kết hồng cầu của virus được sử dụng để chẩn đoán virus, chuẩn độ KN chuẩn hoặc mẫu bệnh phẩm. Một lượng KN xác định được cho vào các giếng của tấm 96 giếng, lần lượt pha loãng bậc 2, bổ sung tế bào hồng cầu vào các giếng, sau một thời gian ủ nhất định, tiến hành đọc kết quả, mẫu dương tính (chứa virus) là mẫu có tế bào hồng cầu bị ngưng kết hoàn toàn. Độ pha loãng virus cao nhất có ngưng kết hoàn toàn chính là hiệu giá HA[37].
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): phản ứng HI được Hirst mô tả lần đầu tiên vào năm 1942. HI được sử dụng để chẩn đoán virus trong mẫu. HA của virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, KT gắn đặc hiệu với các vị trí KN trên phân tử HA liên kết với thụ thể của hồng cầu, gây ức chế sự ngưng kết hồng cầu và chính là cơ sở của HI. Phản ứng được thực hiện trên các tấm 96 giếng. Một lượng KN xác định được trộn với các kháng huyết thanh chuẩn đặc hiệu, kháng huyết thanh được pha loãng bậc 2, sau đó cho tế bào hồng cầu vào mỗi giếng để xác định liên kết đặc hiệu của KT với HA. Hồng cầu không ngưng kết sẽ tạo thành hạt trong giếng, hồng cầu ngưng kết sẽ tạo cấu trúc mạng lưới gắn vào thành giếng. HI được WHO xem là phương pháp “chuẩn vàng” trong xác định, phân type virus[13, 37].
Quan sát bằng kính hiển vi điện tử (EM): việc chẩn đoán virus bằng kính hiển vi dựa trên khả năng phát hiện và xác định virus với những hiểu biết về đặc điểm hình thái học của virus. Ưu điểm của EM là quan sát được hình ảnh thực của virus (hình 1.7), cho phép phát hiện các chủng virus mới[17], và có thể tiến hành xử lí mẫu chỉ trong vài phút, do vậy, EM được sử dụng trong chẩn đoán nhanh virus. Tuy nhiên, EM có hạn chế: không thể kiểm tra nhiều mẫu cùng một lúc, số lượng
virus cần đạt tối thiểu khoảng 106 virion/ml, chi phí cho EM cao và cần kĩ thuật viên có trình độ để thực hiện. Do vậy, EM thường được sử dụng để khẳng định lại kết quả phân lập virus từ tế bào[17].
Hình 1.7:Ảnh chụp virus cúm dưới kính hiển virus điện tử (http://www.uct.ac.za)
Ngoài ra, phương pháp kính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM) sử dụng kháng huyết thanh kháng virus giúp tập trung virus thành cụm để phát hiện được virus trong mẫu có mật độ thấp và làm tăng độ đặc hiệu. Phương pháp kính hiển vi điện tử miễn dịch gắn vàng, trong đó kháng huyết thanh đặc hiệu với virus (KT thứ nhất) gắn với virus, KT thứ hai gắn vàng để đánh dấu các hạt virus. Nhờ đó, có thể xác định được virus ở mật độ rất thấp với hình ảnh rõ và đặc hiệu hơn[44].
Phản ứng chuỗi trùng hợp transcriptase ngược (RT-PCR): là kĩ thuật hiệu quả cho phép xác định genome của virus cúm với lượng mẫu rất nhỏ. Do virus cúm