Chẩn đoán huyết thanh học nhằm xác định sự có mặt của IgM hoặc sự tăng lên của hiệu giá KT từ giai đoạn cấp đến phục hồi. Huyết thanh đơn cũng được sử dụng trong các điều tra này để xác định mức độ tiếp xúc của cộng đồng với virus.
Phản ứng ức chế neuraminidase (NAI) và NA: NA là một enzyme và là glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt virion cúm. NA cắt sialic acid cuối cùng liên kết tế bào và virus, giải phóng virus khỏi tế bào[37]. Xét nghiệm xác định hoạt tính NA của virus cúm bằng cách phát hiện sialic acid tự do trong mẫu. Virus pha loãng được trộn với một lượng cơ chất (fetuin) xác định và ủ qua đêm ở 370C. Các mẫu chứa virus pha loãng sẽ giải phóng ra sialic acid tự do từ cơ chất fetuin. Lượng sialic acid sẽ được xác định bằng xét nghiệm tạo màu hồng với thiobarbituric acid, lượng sialic acid được giải phóng tương ứng với lượng virus cúm có trong mẫu. Màu hồng tạo thành được định lượng bằng máy đo quang phổ[37]. Tiếp theo, chuẩn độ kháng huyết thanh chuẩn cho mỗi subtype NA. Huyết thanh này được chuẩn bị ở các động vật (dê, cừu, gà) để thu được huyết thanh đặc hiệu cho từng NA. Subtype NA của virus cúm được xác định bằng kháng huyết thanh chuẩn. Trong NAI, KT trong huyết thanh sẽ phân biết các subtype NA và ức chế hoạt tính của enzyme virus đối với cơ chất fetuin, do đó màu hồng sẽ không xuất hiện[37]. NAI còn được sử dụng để khẳng định lại kết quả của phản ứng HI và phản ứng trung hoà virus. NAI được tiến hành với các KN đã biết, các bước thực hiện hoàn toàn tương tự các bước nêu trên.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học nhiễm virus ở người và động vật. Các bước tiến hành phản ứng tương tự với phản ứng HI dùng cho xác định subtype virus cúm, chỉ khác là cần có KN virus chuẩn và mẫu là huyết thanh thu nhận từ thực địa. Mẫu dương tính là mẫu có chứa KT đặc hiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị ngưng kết, tạo thành hạt trong giếng[13, 37]. HI vẫn còn một số nhược điểm: phải loại bỏ hết các yếu tố ức chế không đặc hiệu trong huyết thanh; phải chuẩn lại KN trước mỗi phản ứng; và cần người có chuyên môn và kinh nghiệm để đọc kết quả phản ứng[13, 37].
Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện KT kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh. KN toàn phần của virus (H5) hoặc protein HA tinh chế được chạy điện di trên gel, sau đó chuyển sang màng nitrocellulose hoặc nylon. Màng chứa KN được cắt thành các băng nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, KT đặc hiệu trong huyết thanh sẽ liên kết với KN gắn trên màng. Tiến hành ủ các băng nêu trên với KT kháng người có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm hoặc peroxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin-HRP. Vị trí gắn KT kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với cơ chất của enzyme hoặc chất tạo màu. WB có độ nhạy cao, được sử dụng để khẳng định lại kết quả của kĩ thuật khác. Tuy nhiên, do có độ nhạy cao nên trong chẩn đoán virus cúm, WB rất dễ cho kết quả chéo giữa các subtype[41].
1.4.3.1. Serial radial hemalysis (SRH)
SRH trên gel lần đầu tiên được Weiler (1965) sử dụng để xác định hoạt tính phân hủy hồng cầu của IgG chuột[67]. KN được gắn cố định với hồng cầu trong agaro chứa bổ thể. Tạo các giếng chứa mẫu huyết thanh trên bản agaro. KT kháng virus và bổ thể sẽ phân giải tế bào hồng cầu có KN trên bề mặt, kết quả là các vùng có tế bào hồng cầu bị phân giải xuất hiện xung quanh giếng. SRH có ưu điểm: đơn giản, chi phí thấp, cần lượng KT ít và có độ nhạy tương đương với HI. Tuy nhiên, kĩ thuật này mất nhiều thời gian và công sức[67].
Phản ứng ELISA đặc hiệu với HA: được tiến hành gồm bước phủ lượng xác định HA trên các giếng của tấm 96 giếng. Mẫu huyết thanh được pha loãng, ủ với KN trong giếng, bổ sung KT thứ hai được đánh dấu, ủ trong một khoảng thời gian xác định, cho cơ chất vào, làm dừng phản ứng và đo độ hấp thụ ánh sáng với bước sóng phù hợp. Với phản ứng ELISA, hiệu giá thu được lớn hơn hoặc bằng 1600 sẽ được coi là dương tính[41].
Kĩ thuật trung hoà virus: là phương pháp huyết thanh học có độ nhạy và đặc hiệu cao được sử dụng để xác định KT đặc hiệu với virus trong huyết thanh. Kĩ thuật gồm: phản ứng của virus với KT, trong đó virus được trộn và ủ với KT phù hợp, và bước ủ hỗn hợp virus-KT trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi cấy, phôi trứng…) để xác định sự xâm nhiễm của virus. Nếu không có sự xâm nhiễm của virus, tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có KT đặc hiệu với virus[37]. Kĩ thuật trung hoà virus cũng được sử dụng để khẳng định kết quả của phản ứng HI. KT trung hoà ít có phản ứng chéo giữa các virus hơn so với KT dùng trong HI, do
vậy, khi sử dụng các KT cùng nhau trong phản ứng trung hoà sẽ cung cấp các thông tin bổ sung cho việc nhận dạng virus xâm nhiễm.
Trung hòa vi lượng (MN): là kĩ thuật trung hoà virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng ELISA sau 18-22 giờ kể từ khi gây nhiễm. Do vậy, so với kĩ thuật trung hoà virus thông thường, kĩ thuật MN cho kết quả nhanh, chính xác, khách quan hơn và có thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một tấm 96 giếng.
1.5 Kĩ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization) 1.5.1 Cơ sở của kĩ thuật
Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung hòa virus của KT đặc hiệu có trong huyết thanh giúp ức chế sự xâm nhiễm của virus lên tế bào nuôi cấy.
Huyết thanh được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tế bào được cho vào hỗn hợp huyết thanh-virus nêu trên. Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng ELISA.
1.5.2 Ứng dụng kĩ thuật trong chẩn đoán virus
Ứng dụng trong chẩn đoán virus cúm: kĩ thuật MN được Wulff cùng các cộng sự sử dụng trong chẩn đoán virus cúm lần đầu tiên năm 1967, trong đó virus cúm được gây nhiễm trên dòng tế bào RMK (rhesus monkey kidney cells). Năm 1980, kĩ thuật này được Arthur cùng các cộng sự đã phát triển hoàn thiện hơn với việc sử dụng một lớp tế bào nuôi cấy liên tục MDCK và LLC-MK2 trong môi trường có trypsin, cho phép tiến hành chẩn đoán đồng thời một số lượng lớn mẫu huyết thanh[14].
Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Rowe đã tiến hành xác định KT kháng virus cúm A (H5N1) trong huyết thanh người kết hợp nhiều xét nghiệm huyết thanh bao gồm HI, MN và Westen Blot[42]. Kết quả thu được cho thấy phương pháp HI có độ nhạy thấp hơn so với phương pháp MN khi được sử dụng để phát hiện các KT kháng virus cúm gia cầm H5N1 trong huyết thanh người. Trong đó, việc kết hợp phương pháp MN với Western Blot có thể đạt được độ nhạy cao nhất (80%) và mức độ đặc hiệu (96%) đối với KT kháng H5 trong huyết thanh của những người trong
độ tuổi từ 18 tới 59. Việc kết hợp này có thể được sử dụng trong điều tra huyết thanh dịch tễ học các đợt bùng phát dịch do virus cúm A H5N1[42].
Năm 2005, kĩ thuật MN được sử dụng cùng với các kĩ thuật khác như RT- PCR, real-time PCR, HI để xác định ca nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở Trung Quốc. Qua nghiên cứu này, Hongjie Yu và Yuelong Shu đã chỉ ra rằng khả năng virus truyền từ người sang người là rất thấp[68].
Ứng dụng trong chẩn đoán các virus: ngoài virus cúm, kĩ thuật MN còn được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học của nhất nhiều virus khác như virus SARS, dengue, virus herpes, virus quai bị, virus sởi ... [60, 12].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh của những người tiếp xúc với bệnh nhân nhiễm H5N1 và những người tiếp xúc với gia cầm, cụ thể là người chăn nuôi gia cầm, cán bộ thú y, cán bộ tham gia tiêu huỷ gia cầm, cán bộ y tế chăm sóc và điều trị cho bệnh nhân và người nhà bệnh nhân thu thập từ 9/2006 tới 3/2007 tại 3 tỉnh: Hà Tây, Hải Dương và Thái Bình là các địa phương đã được ghi nhận là có bùng phát dịch cúm gia cầm H5N1 trong các vụ dịch năm 2003-2004. Hơn nữa, ở cả ba tỉnh này đều có những bệnh nhân và người tử vong được xác định là do nhiễm virus H5N1.
Các mẫu huyết thanh được sàng lọc bằng phản ứng HI, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên bằng chương trình thống kê SPSS 15.0 các mẫu huyết thanh cho phản ứng MN trong số các mẫu huyết thanh có hiệu giá (HI ≥ 10, 112 mẫu) và một số mẫu không có hiệu giá (HI <10,197 mẫu). Các phản ứng HI được thực hiện bởi cử nhân Trần Thị Sao Mai, bộ môn Vi sinh vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong khoảng thời gian 2006-2007.
Mẫu huyết thanh được sử dụng làm đối chứng âm được thu nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu, mẫu đối chứng âm này đã được kiểm tra bằng phương pháp WB và HI. Các mẫu huyết thanh dương tính của gà được thu nhận từ gà được gây miễn dịch bằng chủng virus H5N1 hoang dã do tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng - Viện Thú Y Trung ương cung cấp và huyết thanh dương tính của cừu được thu nhận từ cừu được gây miễn dịch bằng chủng virus H5N1 A/Vietnam/1203/04 đã được bất hoạt, sau đó được trộn với huyết thanh người đối chứng âm nêu trên theo tỉ lệ 1:1 được cung cấp bởi Tiến sĩ Levandowski – Viện nghiên cứu sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (NIH).
2.2. Vật liệu
2.2.1. Dòng tế bào
Dòng tế bào thận chó Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) do tiến sĩ Jean- Michel Garcia, Trung tâm nghiên cứu Pasteur – Trường Đại học tổng hợp Hồng Kông cung cấp.
2.2.2. Chủng virus
Chủng virus vaccine A/Vietnam/1194/2004/H5N1 do TS Đinh Duy Kháng, Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam cung cấp.
2.2.3. Kháng nguyên và kháng thể
- Kháng nguyên virus cúm gia cầm (A/Vietnam/Ck/6/03 H5N1) được bất hoạt bằng β-propiolactone do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y) cung cấp;
- KT chuột kháng protein NP virus cúm A (Anti-NP mouse monoclonal antibody) được cung cấp bởi tiến sĩ John Meijer, Viện Nghiên cứu Quốc gia về sức khoẻ cộng đồng và môi trường, Hà Lan;
- KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase 1mg/ml (Goat anti-mouse IgG- peroxidase conjugated) (Công ty KPL, Mỹ).
2.2.4. Môi trường và hoá chất
¾ Môi trường nuôi cấy và rửa tế bào MDCK
Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) không đầy đủ: - DMEM (Gibco, Cat. # 12100-046): một gói được hòa tan trong 970 ml nước cất 3 lần;
- NaHCO3: 3,7g;
- Sử dụng HCl để chỉnh pH đạt 7,2;
- Kháng sinh 100x (Gibco 15240-062): 10 ml; - HEPES 1M: 20 ml;
Môi trường DMEM đầy đủ: DMEM không đầy đủ + 10% FBS (Gibco) Môi trường xét nghiệm (Assay medium): DMEM không đầy đủ + 1% BSA (BSA fraction, Sigma);
¾ Dung dịch PBS 1x: NaCl(8g/l); KCl(0,2g/l); Na2HPO4.12H2O(3,58g/l); KH2PO4(0,24g/l), pH 7,2;
¾ Trypsin 0,2% pha từ bột trypsin (1:250) trong PBS 1x, pH 7,2, EDTA 0,001M (Gibco 27250-018) dùng cho tách tế bào;
¾ Trypsin-TPCK (2 mg/ml) (Sigma Cat. # T-8642) dùng cho gây nhiễm virus;
¾ Dung dịch cố định virus: 80% Acetone trong 20% PBS pH 7,2 được pha mới trong ngày;
¾ Đệm rửa: PBS + Tween-20 (0,05%);
¾ Đệm blocking: PBS + BSA (1%) + Tween-20 (0,1%);
¾ Dung dịch cơ chất: o-phenylenediamine-dihydrochloride (OPD) + đệm citrate pH 5,5 (58.8 g acid citric trisodium + 2L H2O, chỉnh pH tới 5.0 bằng HCl) + H2O2
30%. Các thành phần nêu trên được pha với tỉ lệ: OPD 0,05% (10 mg) + đệm xitrat (20ml) + H2O2 0,015% (10µl), pha trước khi cho vào phản ứng;
¾ Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 1N.
2.2.5. Trang thiết bị
- Tủ ấm nuôi cấy 370C, CO2 5%: Forma Series II, water Jacketed CO2, Hepa Class 100, Thermo Electron Corporation;
- Tủ hút an toàn sinh học cấp 2: CSC và FluFrance Advangarde 100; - Kính hiển đảo soi ngược: Olympus CKX41, Nhật Bản (kèm máy ảnh); - Tủ lạnh (40C): Facis S.A., Pháp;
- Tủ lạnh sâu: (-200C) Darling, HNA-270; (-800C) Sanyo, Nhật Bản; - Máy ly tâm: CR 412 Jouan;
- Cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo); - Máy khuấy từ (RotoLab, OSI);
- Máy đo pH: Corning Pinnacle, 530 pH meter; - Máy khuấy trộn Vortex: VF2, Janke & Kunkel;
- PipetteMan các loại (Nichipet 7000 và Biohit), pipet đa kênh (8 & 12 kênh); - Chai nuôi cấy tế bào (25; 75; 175 và 225 cm2): Nunc hoặc Costar;
- Tấm 96 giếng đáy bằng: Costar;
- Falcon (15; 50ml) tiệt trùng: Nunc hoặc Costar;
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu của 20 cán bộ và sinh viên khoẻ mạnh không có tiền sử tiếp xúc với virus cúm gia cầm thực tập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Mẫu máu người tiếp xúc với bệnh nhân và người tiếp xúc với gia cầm (3-5ml) thu nhận ngoài thực địa được bảo quản lạnh 40C và được đưa về phòng thí nghiệm. Tiến hành ly tâm 1600 vòng/phút trong 30 phút để tách huyết thanh cùng ngày thu nhận mẫu trong tủ hút và chia nhỏ thành các phần. Mẫu huyết thanh được làm bất hoạt ở 560C trong 30 phút và được giữ trong điều kiện nhiệt độ -200C và được làm tan băng trước khi sử dụng.
2.4.2. Chuẩn độ kháng thể
- Xác định nồng độ protein của KN virus cúm gia cầm do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y) bằng bộ kit chuẩn nồng độ protein (Biorad, Mỹ). Kết quả thu được trong mục 3.1;
- Tiến hành pha loãng với tỉ lệ thích hợp để được nồng độ KN 10 μg/ml và 20μg/ml. Phủ KN với hai nồng độ nêu trên lên tấm 96 giếng dùng cho phản ứng ELISA, 40C, 18 tiếng;
- Pha loãng KT đơn dòng kháng NP giữa các cột của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000. Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng;
- Pha loãng KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase giữa các hàng của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000.Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng;
- Cho vào mỗi giếng 100µl cơ chất OPD mới chuẩn bị;
- Để khoảng 5 phút, tới khi các giếng chuyển màu thì thêm 100µl dung dịch; - H2SO4 1N vào mỗi giếng để làm dừng phản ứng;
- Đọc kết quả ở bước sóng 490/620nm.
2.4.3. Chuẩn bị tế bào MDCK
Tế bào MDCK (P6) cất giữ trong Nitơ lỏng với số lần cấy truyền thấp được lấy ra khỏi nitơ lỏng, nuôi giữ trong chai nuôi cấy với môi trường DMEM 10% FBS. Qua ít nhất là 3 lần cấy chuyển (tỉ lệ pha loãng tế bào mỗi lần cấy chuyển là 1:10), khi tế bào phát triển ổn định, chúng sẽ được sử dụng cho phản ứng MN. Số lần cấy chuyển tối đa cho mỗi dòng tế bào là 25-30 lần và mỗi chai nuôi cấy 75cm2
đủ dùng cho 4-6 tấm 96 giếng. Các bước chuẩn bị tế bào được tiến hành như sau: - Bỏ môi trường nuôi cấy trong chai;
- Rửa tế bào 2 lần với PBS để loại bỏ hết FBS, hút sạch lượng PBS còn lại trong chai nuôi cấy;
- Cho một lượng vừa đủ trypsin-EDTA để phủ toàn bộ bề mặt chai nuôi cấy; - Ủ ở 370C trong 5-10 phút, cho tới khi toàn bộ lớp tế bào tách ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy;
- Cho khoảng 5 ml DMEM 10% FBS vào trong bình, dùng pipet đánh tan các cụm tế bào sau đó chuyển toàn bộ lượng tế bào thu được vào ống ly tâm 50ml, bổ sung thêm môi trường xét nghiệm;