Thông tin về tuổi, giới tính, nghề nghiệp, nơi ở, lịch sử tiếp xúc của người được thu nhận mẫu huyết thanh được thu thập bằng phiếu điều tra qua việc phỏng vấn cùng với quá trình thu nhận mẫu. Thông tin được nhập vào máy tính bằng chương trình Epi Info 6.0 và được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 15.0.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA
3.1.1. Nồng độ protein của virus cúm gia cầm
Nồng độ protein của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên đường chuẩn độ protein chuẩn (hình 3.1). y = 0.0005x + 0.302 R2 = 0.9878 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 200 400 600 800 1000 Nồng độ (µg/ml) OD 5 95 Nồng độ protein Linear (Nồng độ protein)
Hình 3.1: Đường chuẩn độ protein chuẩn và protein cần xác định nồng độ
Chúng tôi đã xác định được nồng độ protein của virus cúm gia cầm được sử dụng là 1.07 µg/ml.
3.1.2. Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA
Việc chuẩn độ được thực hiện theo các bước đã nêu trong mục 2.3.2. Chúng tôi tiến hành chuẩn độ KT với hai độ pha loãng KN là 10µg/ml và 20µg/ml. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và 3.3 dưới đây:
Bảng 3.1: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 10µg/ml Kháng NP Kháng chuột 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 1.892 1.623 1.763 1.733 1.566 1.649 1.497 1.501 1.452 1.356 1.229 1.197 1:2000 1.646 1.509 1.085 1.422 1.324 1.372 1.338 1.244 0.989 1.175 1.109 1.039 1:4000 1.441 1.378 1.23 1.242 1.154 1.135 1.094 1.023 0.88 0.929 0.294 0.852 1:8000 1.026 1.015 0.938 0.951 0.862 0.851 0.767 0.809 0.669 0.679 0.641 0.660 1:12000 0.857 0.935 0.869 0.943 0.667 0.72 0.646 0.684 0.663 0.585 0.541 0.643 1:16000 0.755 0.747 0.681 0.707 0.625 0.617 0.556 0.581 0.537 0.521 0.445 0.522 1:1000 (kháng NP-) 0.049 0.032 0.031 0.025 0.029 0.03 0.036 0.028 0.032 0.023 -0.02 -0.06 1:1000 (kháng NP-) 0.006 0.016 0.018 0.008 0.008 0.007 0.011 0.015 0.015 0.014 0.013 -0.38 Bảng 3.2: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 20µg/ml Kháng NP Kháng chuột HRP 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 2.593 2.041 1.961 1.933 1.688 1.739 1.606 1.577 1.386 1.473 1.422 1.661 1:2000 1.673 1.717 1.681 1.538 1.535 1.519 1.612 1.401 1.241 1.22 1.202 1.305 1:4000 1.317 1.458 1.454 1.34 1.264 1.28 1.172 1.19 1.049 1.077 1.074 1.048 1:8000 1.066 1.096 1.088 1.043 0.966 0.972 0.727 0.868 0.822 0.742 0.743 0.673 1:12000 0.822 0.868 0.844 0.831 0.797 0.773 0.703 0.681 0.609 0.612 0.599 0.567 1:16000 0.686 0.844 0.763 0.721 0.689 0.653 0.599 0.622 0.57 0.552 0.528 0.502 1:1000 Kháng NP 0.059 0.032 0.03 0.027 0.03 0.037 0.034 0.032 0.044 0.034 0.04 0.04 1:2000 Kháng NP 0.016 0.012 0.012 0.016 0.011 0.012 0.011 0.016 0.019 0.011 0.013 0.02
Chúng tôi đã xác định được tỉ lệ pha loãng KT thích hợp dùng cho phản ứng ELISA, cụ thể là KT chuột kháng protein NP virus cúm A có độ pha loãng từ 1:4000 tới 1:8000 và KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase pha loãng từ 1:2000 tới 1:4000.
3.2. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN
3.2.1. Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus
Trypsin có vai trò giúp cho quá trình xâm nhiễm của virus vào trong tế bào dễ dàng hơn. Trypsin được xử lý với L-(tosylamido-2-phenyl)-etyl clorometyl keton (trypsin-TPCK) có tác dụng phân cắt một số liên kết peptit nội chuỗi xác định, cụ thể là liên kết peptit giữa đầu cuối C với lysin và arginin. Chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm virus H5N1 lên tế bào MDCK với sự có mặt của trypsin-TPCK ở các nồng độ khác nhau: 1μg/ml; 2μg/ml; 5μg/ml. Kết quả là hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE) quan sát được sau khi gây nhiễm 22 tiếng ở các nồng độ lần lượt là 30%, 60% và 90% (Hình 3.1). Bên cạnh đó, kết quả của phản ứng được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả HA ở các nồng độ trypsin và độ pha loãng virus
Nồng độ trypsin
Hiệu giá HA
Pha loãng virus 10-3 Pha loãng virus 10-4
1μg/ml 20-40 < 10
2μg/ml 20 40 5μg/ml 160 - 320 10 - 320
Như vậy, trypsin-TPCK ở nồng độ 5μg/ml cho hiệu quả virus cao nhất khi gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào nồng độ trypsin-TPCK 5μg/ml sẽ được chúng tôi sử dụng trong các lần gây nhiễm tiếp theo.
F: TB không nhiễm virus; độ khuếch đại 20x E: Tế bào sau 24h nhiễm virus; độ khuếch đại 20x
A: CPE 30%; độ khuếch đại 10x B: CPE 60%; độ khuếch đại 10x
D: TB không nhiễm virus; độ khuếch đại 10x C: CPE 90%; độ khuếch đại 10x
Hình 3.3: Hiệu giá virus (HA) trên hồng cầu gà 0,5%
(-): Đối chứng âm (tế bào hồng cầu gà) (+): Đối chứng dương (KN 6/03 H5N1 pha loãng 1:8)
1: Trypsin ở nồng độ 5μg/ml, pha loãng virus 1:103, HA = 320
2: Trypsin ở nồng độ 2μg/ml, pha loãng virus 1:104, HA = 160
3.2.2. Xác định MOI của virus sử dụng trong gây nhiễm
Chủng virus gốc chúng tôi nhận được có 106 liều gây nhiễm 50% trứng (EID50) được nhân lên lần thứ nhất trong chai nuôi cấy tế bào MDCK thu được một lượng nhỏ virus (P1), lượng virus này tiếp tục được sử dụng để lây nhiễm lần thứ hai trên tế bào MDCK để tạo một lượng lớn virus sử dụng cho phản ứng MN (P2). Virus gốc được pha loãng với các tỉ lệ khác nhau (10-2; 10-3; 10-4) được sử dụng để gây nhiễm trên tế bào MDCK trong các chai nuôi cấy với sự có mặt của trypsin- TPCK 5μg/ml. Hiệu giá HA ở độ pha loãng virus 10-2 là 160-320; ở độ pha loãng
2 1
(+) (-)
virus 10-3 là 320 (hình 3.2) và ở độ pha loãng virus 10-4 là 160 (Hình 3.2). Cả hai độ pha loãng virus 10-2, 10-3 đều có hiệu giá HA đạt 320, độ pha loãng virus 10-3 cũng giúp tiết kiệm lượng virus sử dụng hơn so với độ pha loãng virus bằng 10-2. Chúng tôi lựa chọn độ pha loãng virus bằng 10-3 cho các lần thí nghiệm sau. Từ kết quả này, chúng tôi tính được MOI của virus P2 sử dụng cho phản ứng MN là từ 2x10-3
tới 4x10-3.
3.2.3. Xác định TCID50 của virus P2 dùng cho phản ứng MN
Việc xác định TCID50 giúp tính toán được lượng virus phù hợp đưa vào mỗi giếng thí nghiệm trong phản ứng MN. TCID50 là độ pha loãng virus để có thể nhiễm và làm huỷ hoại 50% tế bào nuôi cấy, TCID50 được xác định dựa trên sự có mặt và lây nhiễm của virus trên tế bào. Virus thu được sau khi gây nhiễm lần hai (P2) được pha loãng theo ½log10 với độ pha loãng 10-2, 10-2,5, 10-3 …10-6,5, các bước tiến hành đã được mô tả trong chương II, TCID50 được tính theo phương pháp Reed-Muench[37]. Chúng tôi đã xác định được TCID50 của chủng virus sử dụng cho phản ứng MN là 10-5,75.
Hình 3.4: TCID50 được xác định trên tấm 96 giếng
3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK, thời gian và điều kiện gây nhiễm
Các điều kiện khác đã được thực hiện trên kĩ thuật chuẩn độ virus từ trước, sau đó điều kiện tốt nhất sẽ được áp dụng cho phản ứng MN.
3.3.1. Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp
Tế bào MDCK có vai trò quan trọng đối với sự thành công của phản ứng MN. Dòng tế bào thí nghiệm phải phát triển ổn định qua một số lần cấy chuyển, các tế bào được quan sát dưới kính hiển virus có hình thái đồng đều, đặc biệt, chúng phải có phản ứng giống nhau đối với virus. Lượng tế bào cho vào mỗi giếng thí nghiệm cũng là một trong những yếu tố quyết định của phản ứng MN, lượng tế bào này cần được xác định chính xác và để sau một khoảng thời gian xác định, tế bào sẽ
bao phủ đều trên toàn bộ bề mặt đáy giếng. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với tế bào MDCK ở các mật độ khác nhau: 1,5 x 105 tế bào/ml; 2,0 x 105 tế bào/ml; 2,5 x 105 tế bào/ml.
Kết quả thu được, như được thể hiện trên hình 3.5 tế bào MDCK ở mật độ 2,0.105 tế bào/ml cho kết quả tốt nhất, tế bào bao phủ 100% bề mặt đáy giếng thí nghiệm, lớp tế bào phát triển, phân bố đồng đều (hình B) và TCID50 thu được là 10-5,75. Trong khi đó, tế bào ở các giếng có mật độ 1,5.105 tế bào/ml không phủ kín bề mặt giếng, có nhiều vị trí tế bào phân bố thưa (hình A), TCID50 là 10-5,25. Ngược lại, các giếng có mật độ tế bào 2,5.105 tế bào/ml có quá nhiều và TCID50 là 10-5,22.
Hình 3.5: Tế bào ở các mật độ khác nhau trong TCID50
Như vậy, mật độ tế bào 2,0.105 tế bào/ml thích hợp nhất và mật độ này được chúng tôi sử dụng ở phần còn lại của nghiên cứu.
A: Mật độ 1,5x105 tế bào/ml
C: Mật độ 2,0x105tế bào/ml
3.3.2. Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào
Thời gian gây nhiễm virus trên tế bào cần được xác định phù hợp để lượng virus xâm nhiễm vào tế bào là lớn nhất, virus cần được bất hoạt và cố định tại thời điểm thích hợp, tại đó lớp tế bào vẫn bám chặt trên bề mặt đáy giếng nuôi cấy và hiệu giá thu được ổn định qua các lần lặp lại. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các khoảng thời gian khác nhau: 18 tiếng; 20 tiếng và 22 tiếng. Kết quả thu được, thời gian gây nhiễm 22 tiếng cho kết quả tốt nhất với hiệu giá đạt được cao và ổn định hơn so với các khoảng thời gian gây nhiễm 18 và 20 tiếng.
Ngoài ra, chúng tôi cũng đã xác định được thời gian gây nhiễm thích hợp nhất trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK ở các nồng độ khác nhau: 0,5 µg/ml; 1,0 µg/ml; 2,5 µg/ml. Chúng tôi nhận thấy sự gây nhiễm đạt kết quả tốt nhất trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK nồng độ 0,5 µg/ml và thời gian gây nhiễm là 18 tiếng. Trong khi đó, nồng độ trypsin-TPCK được khuyến cáo bởi protocol của CDC là 2 µg/ml. Khi nồng độ trypsin tăng lên (1,0 µg/ml; 2,5 µg/ml) hoặc thời gian gây nhiễm lớn hơn 18 tiếng (20 tiếng; 22 tiếng) tế bào trên bề mặt giếng thí nghiệm bị bong ra thành từng mảng lớn.
Như vậy, ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng, trong khi đó, với sự có mặt của trypsin (0,5 µg/ml) thì thời gian gây nhiễm tốt nhất là 18 tiếng. Chúng tôi sẽ dùng hai điều kiện này cho phản ứng trung hoà virus lượng.
3.4. Đánh giá kết quả thu được của phản ứng MN
3.4.1. So sánh kết quả phản ứng MN ởđiều kiện có và không có mặt của trypsin-TPCK trypsin-TPCK
Chúng tôi đã tiến hành phản ứng MN trong hai điều kiện, virus được gây nhiễm vào tế bào không có sự tham gia của trypsin-TPCK và được cố định lên bề mặt giếng thí nghiệm sau 22 tiếng gây nhiễm. Điều kiện thứ hai là quá trình gây nhiễm virus vào tế bào với sự có mặt của trypsin-TPCK (0,5 µg/ml), sau đó virus
được bất hoạt và cố định sau 18 tiếng gây nhiễm. Kết quả thu được được thể hiện trong bảng 3.4:
Bảng 3.4: So sánh hiệu giá trong phản ứng MN có và không có mặt của trypsin
Stt Mã huyết thanh Hiệu giá HI Hiệu giá MN không có trypsin Hiệu giá MN có trypsin 1. Mẫu 1 <10 14* 80 2. Mẫu 2 <10 10 80 3. Mẫu 3 10 10 40 4. Mẫu 4 20 20 160 5. Mẫu 5 20 160 320 6. Mẫu 6 20 20 80 7. Mẫu 7 20 <10 40 8. Mẫu 8 20 28* 40 9. Mẫu 9 28* <10 40 10. Mẫu 10 28* <10 80 11. Mẫu 11 28* <10 80 12. HT người (-) <10 <10 Không ổn định** 13. HT gà (+) 640 1280 1280 14. HT cừu (+) 640 2560 2560
Chú thích: (*): Trung bình nhân của hai lần thí nghiệm
Kết quả trên cho thấy, khi sử dụng trypsin-TPCK trong gây nhiễm virus H5N1 vào tế bào, hiệu giá xác định được rất cao. Cụ thể là với mẫu số 2 được xác định là âm tính với hiệu giá trong phản ứng HI và MN không có mặt của trypsin lần lượt là 5 và 10 thì hiệu giá ở phản ứng MN có mặt của trypsin lên tới 80. Một ví dụ khác, mẫu số 4 có hiệu giá ở cả hai phản ứng HI và MN không có trypsin là 20 thì trong phản ứng MN có mặt của trypsin hiệu giá xác định được là 160 (bảng 3.1 và hình 3.4). Hơn nữa, với các mẫu huyết thanh đối chứng, hiệu giá xác định được của phản ứng MN có trypsin rất không ổn định trong các lần thí nghiệm.
Như vậy, kết quả của phản ứng MN với sự tham gia của trypsin cho kết quả không chính xác, các kết quả tiếp theo sử dụng điều kiện phản ứng MN không có trypsin-TPCK.
3.4.2. Đánh giá độổn định của phản ứng MN
Độ ổn định của phản ứng có ý nghĩa quan trọng, quyết định sự đồng đều của kết quả thu được qua các lần thực hiện khác nhau. Để đánh giá độ ổn định của phản ứng MN, chúng tôi tiến hành xác định độ lệch chuẩn log10 của kết quả phản ứng MN với cùng một mẫu qua các lần khác nhau, cụ thể là mẫu huyết thanh đối chứng dương của gà và huyết thanh đối chứng dương của cừu trên nền huyết thanh người. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.5:
Bảng 3.5: Kết quả phản ứng MN với mẫu huyết thanh đối chứng âm của người, huyết thanh đối chứng dương của gà và của cừu trên nền huyết thanh người.
Stt Lần TN HT Gà (+) HT Cừu (+)
HT Người (-)
Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá
1 I 640 2.806 1280 3.107 < 10 2 II 640 2.806 640/1280 2.957 < 10 3 III 640/1280 2.957 1280/256 0 3.258 < 10 4 IV 1280 3.107 2560 3.408 < 10 5 V 1280 3.107 2560 3.408 < 10 6 VI 1280 3.107 2560 3.408 < 10 Trung bình nhân hiệu giá 952 1660 <10
Độ lệch chuẩn log(hiệu giá) trong phản ứng MN với các mẫu huyết thanh dương tính của gà và cừu tính được lần lượt là 0,147 và 0,190. Các giá trị độ lệch chuẩn trên xấp xỉ bằng 5% giá trị trung bình kết quả các lần thí nghiệm, phản ứng MN có độ ổn định cao. Kết quả trong bảng 3.2 và độ lệch chuẩn tính được cũng cho thấy huyết thanh dương tính của gà có trung bình nhân hiệu giá bằng 952, thấp hơn so với huyết thanh dương tính của cừu có trung bình nhân bằng 1660. Hơn nữa, tất cả các phản ứng với huyết thanh đối chứng âm của người đều cho kết quả âm tính, kết quả này một lần nữa khẳng định cho độ ổn định của phản ứng.
Như vậy, phản ứng MN đã thiết lập được có độ ổn định nằm trong giới hạn cho phép.
3.4.3. Đánh giá độđặc hiệu của phản ứng MN
Tính đặc hiệu của phản ứng MN quyết định khả năng phân biệt KN của virus H5N1 với các KN khác. Trong 214 mẫu huyết thanh không có hiệu giá HI (HI<10) thì cả 214 mẫu đều có hiệu giá MN nhỏ hơn 20 (ngưỡng dương tính) (bảng 3.6) điều này chứng tỏ rằng KT đặc hiệu với các virus khác, cụ thể là virus cúm thông thường trong huyết thanh người không bắt cặp chéo với KN của virus H5N1 sử dụng trong phản ứng. Điều này chứng tỏ rằng phản ứng MN thiết lập được có độ đặc hiệu cao, có thể tin cậy để sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1.
3.4.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng MN (so sánh với phản ứng HI)
Kĩ thuật HI được coi là kĩ thuật “chuẩn vàng” trong phát hiện và định type virus cúm ở người, tuy nhiên kĩ thuật này được xác định là có độ nhạy không cao trong xác định KT kháng virus cúm gia cầm ở động vật[67, 68]. Khi chẩn đoán huyết thanh học nhiễm virus H5N1 ở cậu bé 3 tuổi, kết quả của phản ứng HI và MN đã được so sánh với nhau, trong đó KT kháng H5 đã được phát hiện bằng kĩ thuật MN ở những người có tiền sử tiếp xúc với gia cầm và với bệnh nhân nhiễm virus