2.4.1. Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu của 20 cán bộ và sinh viên khoẻ mạnh không có tiền sử tiếp xúc với virus cúm gia cầm thực tập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Mẫu máu người tiếp xúc với bệnh nhân và người tiếp xúc với gia cầm (3-5ml) thu nhận ngoài thực địa được bảo quản lạnh 40C và được đưa về phòng thí nghiệm. Tiến hành ly tâm 1600 vòng/phút trong 30 phút để tách huyết thanh cùng ngày thu nhận mẫu trong tủ hút và chia nhỏ thành các phần. Mẫu huyết thanh được làm bất hoạt ở 560C trong 30 phút và được giữ trong điều kiện nhiệt độ -200C và được làm tan băng trước khi sử dụng.
2.4.2. Chuẩn độ kháng thể
- Xác định nồng độ protein của KN virus cúm gia cầm do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y) bằng bộ kit chuẩn nồng độ protein (Biorad, Mỹ). Kết quả thu được trong mục 3.1;
- Tiến hành pha loãng với tỉ lệ thích hợp để được nồng độ KN 10 μg/ml và 20μg/ml. Phủ KN với hai nồng độ nêu trên lên tấm 96 giếng dùng cho phản ứng ELISA, 40C, 18 tiếng;
- Pha loãng KT đơn dòng kháng NP giữa các cột của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000. Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng;
- Pha loãng KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase giữa các hàng của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000.Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng;
- Cho vào mỗi giếng 100µl cơ chất OPD mới chuẩn bị;
- Để khoảng 5 phút, tới khi các giếng chuyển màu thì thêm 100µl dung dịch; - H2SO4 1N vào mỗi giếng để làm dừng phản ứng;
- Đọc kết quả ở bước sóng 490/620nm.
2.4.3. Chuẩn bị tế bào MDCK
Tế bào MDCK (P6) cất giữ trong Nitơ lỏng với số lần cấy truyền thấp được lấy ra khỏi nitơ lỏng, nuôi giữ trong chai nuôi cấy với môi trường DMEM 10% FBS. Qua ít nhất là 3 lần cấy chuyển (tỉ lệ pha loãng tế bào mỗi lần cấy chuyển là 1:10), khi tế bào phát triển ổn định, chúng sẽ được sử dụng cho phản ứng MN. Số lần cấy chuyển tối đa cho mỗi dòng tế bào là 25-30 lần và mỗi chai nuôi cấy 75cm2
đủ dùng cho 4-6 tấm 96 giếng. Các bước chuẩn bị tế bào được tiến hành như sau: - Bỏ môi trường nuôi cấy trong chai;
- Rửa tế bào 2 lần với PBS để loại bỏ hết FBS, hút sạch lượng PBS còn lại trong chai nuôi cấy;
- Cho một lượng vừa đủ trypsin-EDTA để phủ toàn bộ bề mặt chai nuôi cấy; - Ủ ở 370C trong 5-10 phút, cho tới khi toàn bộ lớp tế bào tách ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy;
- Cho khoảng 5 ml DMEM 10% FBS vào trong bình, dùng pipet đánh tan các cụm tế bào sau đó chuyển toàn bộ lượng tế bào thu được vào ống ly tâm 50ml, bổ sung thêm môi trường xét nghiệm;
- Loại bỏ dịch nước nổi, thu cặn tế bào lắng dưới đáy ống, hoà tan và pha loãng các tế bào này trong môi trường xét nghiệm tới mật độ tế bào đủ để phủ kín bề mặt giếng (kết quả ở mục 3.3).
2.4.4. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng
Virus vaccine được nuôi cấy trên phôi gà (tại viện Công nghệ Sinh học). Dịch khoang niệu được thu thập, chuyển tới viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, tại đây virus được cấy truyền 2 lần để tạo một được virus ổn định cho toàn bộ phản ứng MN. Lần cấy truyền thứ nhất (P1) nhân tạo chủng để cấy truyền lần 2 (P2). Quy trình gây nhiễm virus được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị tế bào MDCK tạo thành một lớp trong chai nuôi cấy với độ bao phủ khoảng 90%;
- Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy và rửa lần 1 bằng cách tráng tế bào với DMEM không có FBS. Lần thứ 2, để dung dịch rửa từ 1-2 tiếng, ở 370C, sau đó loại bỏ toàn bộ môi trường DMEM trước khi nhiễm virus;
- Chuẩn bị môi trường nhiễm virus chứa trypsin-TPCK với nồng độ thích hợp (kết quả ở mục 3.2.1) và pha loãng virus P1 trong DMEM đã chuẩn bị một lượng vừa đủ để láng hết toàn bộ bề mặt tế bào (1ml cho chai 75cm2 và 4ml cho chai 175cm2);
- Cho virus đã pha loãng vào trong chai nuôi cấy có chứa lớp tế bào MDCK nêu trên và lắc đều để virus tiếp xúc với toàn bộ bề mặt chai;
- Ủ từ 1-2 tiếng ở 370C, cứ 15 phút lại nhẹ nhàng lắc chai nuôi cấy 1 lần nhằm trải đều virus trên bề mặt chai;
- Bổ sung thêm môi trường DMEM có chứa trypsin-TPCK vào và để trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau 36-48 tiếng, quan sát hiệu ứng huỷ hoại tế bào do virus gây ra và thu hoạch virus khi hiệu ứng huỷ hoại tế bào đạt 90-95%;
- Tiến hành ly tâm thu dịch nổi có chứa virus, chia virus ra các ống nhỏ và giữ trong điều kiện -800C, mỗi lần thực hiện phản ứng MN sử dụng một ống.
2.4.5. Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50)
- Làm tan băng virus, pha loãng virus trên tấm 96 giếng theo ½ log10 (mỗi giếng có 100μl môi trường) theo sơ đồ hình 2.1:
Hình 2.1: Sơđồ thực hiện pha loãng virus theo ½ log10
- Bổ sung 100μl tế bào đã chuẩn bị với mật độ thích hợp ở mục 2.3.3 vào mỗi giếng, trộn đều và ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 từ 18 đến 22 tiếng;
- Sau thời gian ủ, hút bỏ toàn bộ môi trường có trong các giếng, rửa các giếng bằng PBS 1x (200µl);
- Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cố định virus, để 10 phút, sau đó loại bỏ hết dung dịch và để bay hơi hết dung dịch trong các giếng, giữ phiến tế bào ở -800C nếu không dùng ngay;
- Thực hiện phản ứng ELISA mục 2.3.7 và tính giá trị trung bình (AvgCC) và độ lệch chuẩn (SD) của các giếng tế bào đối chứng;
- Giếng được xác định là dương tính khi có giá trị OD lớn hơn AvgCC + 3 SD (ngưỡng dương tính); Thêm 146µl virus pha loãng ban đầu (1/100) Chỉ có môi trường (không có virus) Bỏ đi 46µl
- TCID50/100µl được tính bằng nồng độ pha loãng virus mà 50% số giếng có giá trị OD dương tính. TCID50 được tính theo phương pháp Reed-Muench:
Bảng 2.1: Tính TCID50 theo phương pháp Reed-Muench
Giá trị thu được (OD) Giá trị cộng dồn
Pha loãng dương tính (1) âm tính(2) dương tính(3) âm tính(4) Tỉ lệ (5) % dương tính(6)
104 4 0 11 0 11/11 100
104,5 4 0 7 0 7/7 100
105 3 1 3 1 3/4 75
105,5 0 4 0 5 0/5 0
- Các bước tính TCID50 theo phương pháp Reed-Muench: xác định số giếng dương tính (1) và âm tính (2) ở mỗi độ pha loãng; tính giá trị cộng dồn từ dưới lên các của giếng dương tính (3) và giá trị cộng dồn từ trên xuống của các giếng âm tính (4); tính tỉ lệ phần trăm các giếng dương tính (5); tính khoảng cách số hạng của tỉ lệ thức giữa độ pha loãng có số giếng dương tính lớn hơn 50% và độ pha loãng có số giếng dương tính nhỏ hơn 50% (6); TCID50 được tính bằng cách cộng khoảng cách tính được nêu trên với độ pha loãng có số giếng dương tính lớn hơn 50%; mỗi giếng được ủ với 0,1ml virus được pha loãng, nên TCID50 tính được là TCID50/0,1 ml; chuyển về 100TCID50 bằng 10-3.15/0,1 ml, hoặc 10-2.8/50 μl.
- Nồng độ virus được điều chỉnh để có 100 TCID50/50µl, kết quả sẽ được sử dụng cho phản ứng trung hoà.
2.4.6. Phản ứng trung hoà virus
- Cho 50μl môi trường xét nghiệm vào các hàng BÆH; 90 μl môi trường xét nghiệm vào các giếng A1ÆA10; cho vào giếng tế bào đối chứng (CC) 50μl môi trường xét nghiệm; cho vào giếng virus đối chứng (CC) 50μl virus được pha loãng;
- Mẫu huyết thanh đã bất hoạt ở 560C được cho vào các giếng A1ÆA10 (mỗi giếng 10μl), mỗi mẫu thực hiện hai lần, do vậy mỗi tấm 96 giếng sẽ kiểm tra được 5 mẫu; như vậy, độ pha loãng huyết thanh bắt đầu từ 1:10;
- Tiến hành pha loãng huyết thanh bậc 2 như hình 2.2;
- Virus pha loãng tới nồng độ thích hợp được cho vào các giếng (50μl/giếng), trừ giếng tế bào đối chứng và chuẩn độ lại virus (như trong hình 3.2);
Hình 2.2: Sơđồ thực hiện pha loãng mẫu huyết thanh
- Tiến hành chuẩn độ lại virus, đối chứng âm, đối chứng dương trên một tấm 96 giếng riêng (như trong hình 3.3), trong đó các bước chuẩn độ lại virus được tiến hành như sau: thêm 50µl môi trường xét nghiệm vào mỗi giếng B5ÆH5, thêm 100µl virus cần chuẩn độ (100TCID50) vào giếng A5, pha loãng virus theo tỉ lệ 1:2 bằng cách chuyển 50µl từ giếng A5 lần lượt qua các giếng B5ÆH5 và bỏ 50µl ở giếng cuối cùng, thêm 50µl môi trường xét nghiệm vào mỗi giếng, bổ sung 100µl tế bào với nồng độ thích hợp đã chuẩn bị vào tất cả các giếng; kết quả của phản ứng MN chỉ được chấp nhận khi kết quả chuẩn độ lại cho giá trị dương tính ở độ pha loãng từ 3Æ5, nếu kết quả dương tính ở độ pha loãng nhỏ hơn 3 tức là virus quá loãng và ngược lại nếu kết quả dương tính ở độ pha loãng lớn hơn 5 tức là virus quá đặc, do vậy phải tiến hành lại bước xác định TCID50;
- Ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 với thời gian 2 tiếng;
Virus đối chứng (VC)
Tế bào đối chứng (CC) Mẫu huyết thanh
Pha loãng
Bỏ 50 μl
Bắt đầu
1/10 10µl mẫu + 90µl DMEM + 1% BSA
- Thêm 100μl tế bào đã chuẩn bị với mật độ thích hợp (xem kết quả ở phần 3.2) vào mỗi giếng, lắc nhẹ để trộn đều hỗn hợp, ủ 18-22 tiếng trong tủ ấm 370C, 5% CO2;
- Lấy tấm 96 giếng ra, hút bỏ toàn bộ môi trường có trong các giếng, rửa các giếng bằng PBS (200 μl);
- Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cố định virus, để 10 phút, sau đó loại bỏ hết dung dịch và để bay hơi hết dung dịch trong các giếng;
- Thực hiện phản ứng ELISA; -
Hình 2.3: Sơđồ thực hiện pha loãng huyết thanh với các mẫu đối chứng
(1): Mẫu huyết thanh (3&4): Đối chứng dương (huyết thanh gà và huyết thanh cừu trên nền người âm tính)
(2): Đối chứng âm (5): Chuẩn độ lại virus
2.4.7. Phản ứng ELISA
- Rửa tấm 96 giếng đã có tế bào được cố định trong đó 3 lần bằng đệm rửa; - Pha loãng KT thứ nhất (KT đơn dòng chuột kháng protein NP của virus cúm A với nồng độ thích hợp) trong đệm blocking (mục 2.2.4), cho vào mỗi giếng 100µl và ủ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng; Virus đối chứng (VC) Tế bào đối chứng (CC) Huyết thanh Pha loãng Bỏ 50 μl Thêm 100µl Bỏ 50 μl
- Rửa tấm 96 giếng 5 lần bằng đệm rửa;
- Pha loãng KT thứ hai (KT dê kháng chuột, cộng hợp HRP với nồng độ thích hợp) trong đệm blocking (mục 2.2.4), cho vào mỗi giếng 100µl và ủ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng;
- Rửa tấm 96 giếng 6 lần bằng đệm rửa;
- Cho vào mỗi giếng 100µl cơ chất OPD (0,05%), H2O2 (0,015%) trong đệm citrate pH 5,2) mới chuẩn bị;
- Để khoảng 5 phút, tới khi các giếng chuyển màu trong khi giếng tế bào đối chứng vẫn không chuyển màu thì thêm 100µl dung dịch H2SO4 1N vào mỗi giếng để làm dừng phản ứng;
- Đọc kết quả ở bước sóng 490nm/620nm.
2.4. Xử lý số liệu
2.4.1. Kết quả phản ứng trung hòa virus
Hoạt tính trung hòa virus của từng mẫu huyết thanh được tính theo công thức sau: ) ( 2 ) ( ) ( AvgCC AvgCC AvgVC X = − + Trong đó:
- X là hoạt tính trung hòa virus của huyết thanh
- AvgVC là giá trị trung bình hấp thụ bước sóng của các giếng virus đối chứng - AvgCC là giá trị trung bình hấp thụ bước sóng của các giếng tế bào đối chứng
2.4.2. Đọc kết quả
Giếng có OD ≤ X được coi là dương tính, hiệu giá KT trung hoà là độ pha loãng huyết thanh ở 2 giếng cùng dương tính. Nếu có một giếng âm tính và một giếng dương tính thì hiệu giá sẽ là trung bình nhân của hai độ pha loãng. Huyết thanh được pha loãng với tỉ lệ 1:10, ngưỡng dương tính ≥ 20.
2.4.3. Xử lý thông tin về người tiếp xúc
Thông tin về tuổi, giới tính, nghề nghiệp, nơi ở, lịch sử tiếp xúc của người được thu nhận mẫu huyết thanh được thu thập bằng phiếu điều tra qua việc phỏng vấn cùng với quá trình thu nhận mẫu. Thông tin được nhập vào máy tính bằng chương trình Epi Info 6.0 và được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 15.0.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA
3.1.1. Nồng độ protein của virus cúm gia cầm
Nồng độ protein của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên đường chuẩn độ protein chuẩn (hình 3.1). y = 0.0005x + 0.302 R2 = 0.9878 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 200 400 600 800 1000 Nồng độ (µg/ml) OD 5 95 Nồng độ protein Linear (Nồng độ protein)
Hình 3.1: Đường chuẩn độ protein chuẩn và protein cần xác định nồng độ
Chúng tôi đã xác định được nồng độ protein của virus cúm gia cầm được sử dụng là 1.07 µg/ml.
3.1.2. Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA
Việc chuẩn độ được thực hiện theo các bước đã nêu trong mục 2.3.2. Chúng tôi tiến hành chuẩn độ KT với hai độ pha loãng KN là 10µg/ml và 20µg/ml. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và 3.3 dưới đây:
Bảng 3.1: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 10µg/ml Kháng NP Kháng chuột 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 1.892 1.623 1.763 1.733 1.566 1.649 1.497 1.501 1.452 1.356 1.229 1.197 1:2000 1.646 1.509 1.085 1.422 1.324 1.372 1.338 1.244 0.989 1.175 1.109 1.039 1:4000 1.441 1.378 1.23 1.242 1.154 1.135 1.094 1.023 0.88 0.929 0.294 0.852 1:8000 1.026 1.015 0.938 0.951 0.862 0.851 0.767 0.809 0.669 0.679 0.641 0.660 1:12000 0.857 0.935 0.869 0.943 0.667 0.72 0.646 0.684 0.663 0.585 0.541 0.643 1:16000 0.755 0.747 0.681 0.707 0.625 0.617 0.556 0.581 0.537 0.521 0.445 0.522 1:1000 (kháng NP-) 0.049 0.032 0.031 0.025 0.029 0.03 0.036 0.028 0.032 0.023 -0.02 -0.06 1:1000 (kháng NP-) 0.006 0.016 0.018 0.008 0.008 0.007 0.011 0.015 0.015 0.014 0.013 -0.38 Bảng 3.2: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 20µg/ml Kháng NP Kháng chuột HRP 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 2.593 2.041 1.961 1.933 1.688 1.739 1.606 1.577 1.386 1.473 1.422 1.661 1:2000 1.673 1.717 1.681 1.538 1.535 1.519 1.612 1.401 1.241 1.22 1.202 1.305 1:4000 1.317 1.458 1.454 1.34 1.264 1.28 1.172 1.19 1.049 1.077 1.074 1.048 1:8000 1.066 1.096 1.088 1.043 0.966 0.972 0.727 0.868 0.822 0.742 0.743 0.673 1:12000 0.822 0.868 0.844 0.831 0.797 0.773 0.703 0.681 0.609 0.612 0.599 0.567 1:16000 0.686 0.844 0.763 0.721 0.689 0.653 0.599 0.622 0.57 0.552 0.528 0.502 1:1000 Kháng NP 0.059 0.032 0.03 0.027 0.03 0.037 0.034 0.032 0.044 0.034 0.04 0.04 1:2000 Kháng NP 0.016 0.012 0.012 0.016 0.011 0.012 0.011 0.016 0.019 0.011 0.013 0.02
Chúng tôi đã xác định được tỉ lệ pha loãng KT thích hợp dùng cho phản ứng ELISA, cụ thể là KT chuột kháng protein NP virus cúm A có độ pha loãng từ 1:4000 tới 1:8000 và KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase pha loãng từ 1:2000 tới 1:4000.
3.2. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN
3.2.1. Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus
Trypsin có vai trò giúp cho quá trình xâm nhiễm của virus vào trong tế bào dễ dàng hơn. Trypsin được xử lý với L-(tosylamido-2-phenyl)-etyl clorometyl keton (trypsin-TPCK) có tác dụng phân cắt một số liên kết peptit nội chuỗi xác định, cụ thể là liên kết peptit giữa đầu cuối C với lysin và arginin. Chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm virus H5N1 lên tế bào MDCK với sự có mặt của trypsin-TPCK ở các nồng độ khác nhau: 1μg/ml; 2μg/ml; 5μg/ml. Kết quả là hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE) quan sát được sau khi gây nhiễm 22 tiếng ở các nồng độ lần lượt là 30%, 60% và 90% (Hình 3.1). Bên cạnh đó, kết quả của phản ứng được thể hiện trong