Kĩ thuật MN đã thiết lập được sử dụng trong điều tra huyết thanh học ở những người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1, cụ thể là ở người tiếp xúc với bệnh nhân và người chăn nuôi gia cầm, kết quả thu được thể hiện trên bảng 3.7:
Bảng 3.7A: Các mẫu huyết thanh dương tính trong phản ứng MN Stt Mã huyết thanh Tuổi Giới tính Nghề nghiệp Tiếp xúc Địa phương Hiệu giá MN* Hiệu giá HI** 1. Mẫu 1 55 Nữ Bác sĩ Bệnh nhân Thái Bình 28 20 2. Mẫu 2 46 Nữ Bác sĩ Bệnh nhân Thái Bình 28 40 3. Mẫu 3 17 Nữ Người nhà
bệnh nhân Bệnh nhân Thái Bình 56 113 4. Mẫu 4 48 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 20 20
5. Mẫu 5 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 20 6. Mẫu 6 38 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 20 20
7. Mẫu 7 40 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Thái Bình 20 28 8. Mẫu 8 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 40 9. Mẫu 9 56 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 20 40
10. Mẫu 10 37 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 40 11. Mẫu 11 32 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Thái Bình 20 40 12. Mẫu 12 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 28 10
13. Mẫu 13 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 28 10 14. Mẫu 14 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 56 40
15. Mẫu 15 66 Nam Tiêu hủy Gia cầm Hải
Dương 160 20
16. Mẫu 16 76 Nam Tiêu hủy Không nuôi gia cầm
Hải
Dương 80 80
(*): Ngưỡng dương tính của KT MN = 20 (**): Ngưỡng dương tính của KT HI = 40
Tiến hành phản ứng MN với 311 mẫu huyết thanh đã phát hiện được 16 mẫu dương tính (Bảng 3.7A). Trong đó, 3 mẫu huyết thanh là của người tiếp xúc với bệnh nhân nhiễm virus H5N1. Đáng chú ý, mẫu số 3 của một người nhà bệnh nhân có hiệu giá cao ở cả hai kĩ thuật HI và MN lần lượt là 113 và 56, hai trường hợp còn lại là của nhân viên y tế tham gia chăm sóc bệnh nhân. Cả ba trường hợp này cần tiếp tục được kiểm tra để khẳng định đó là do sự lây truyền từ người sang người hay từ một nguồn khác.
Phần lớn các mẫu huyết thanh dương tính xác định được là của người tiếp xúc với gia cầm (13 mẫu), tập trung chủ yếu ở nhóm những người chăn nuôi gia cầm (bao gồm gà, vịt, ngan, ngỗng và chim cút), tuy nhiên hiệu giá MN của nhóm những người này không cao với 8/13 mẫu có hiệu giá MN bằng 20 (vừa đạt ngưỡng dương tính). Điều này có thể được giải thích là do những người chăn nuôi gia cầm đã tiếp xúc với chủng virus có khả năng nhân lên thấp ví dụ như LPAI, cần có thêm những nghiên cứu về virus để khẳng định. Mẫu số 16 có hiệu giá HI và MN đều bằng 80 là của người tham gia tiêu hủy gia cầm, tuy nhiên người đàn ông này có tuổi 76. Kết quả thu được của phản ứng MN ở người này có thể không chính xác do phản ứng đạt được độ nhạy và đặc hiệu cao nhất với những mẫu huyết thanh của người trong độ tuổi từ 18 đến 59. Điều này đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Rowe và các cộng sự năm 1999[60]. Bảng 3.7B dưới đây cũng khẳng định cho nhận định trên:
Bảng 3.7B: Thông tin về người có mẫu huyết thanh MN âm tính nhưng dương tính với HI Stt Mã huyết thanh Tuổi Giới tính Nghề nghiệp Tiếp xúc Địa phương Hiệu giá MN Hiệu giá HI
17. Mẫu 17 63 Nuôi gia cầm Bệnh nhân Hải
Dương 5 40
18. Mẫu 18 53 Nam Nuôi gia cầm Bệnh nhân Thái
Bình 5 40
19. Mẫu 19 64 Nữ Nuôi gia cầm Bệnh nhân Hải
Dương 5 40
20. Mẫu 20 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 5 57
21. Mẫu 21 49 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 5 57 22. Mẫu 22 55 Nam Tiêu hủy Gia cầm Hải
Dương 5 160
23. Mẫu 23 85 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải
Dương 5 80
24. Mẫu 24 28 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 5 80
Trong 8 mẫu huyết thanh dương tính với HI có 4 mẫu là của người trên 60 tuổi, do vậy, kết quả MN và HI của các mẫu này có thể không chính xác và cần được xác định bằng các kĩ thuật khác để khẳng định.
KẾT LUẬN
A. Hoàn thiện kĩ thuật MN
1. Xác định được nồng độ trypsin-TPCK thích hợp sử dụng trong gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào MDCK là 5μg/ml.
2. Xác định được MOI trong gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào là từ 2x10-3 tới 4x10-3.
3. Sản xuất được virus H5N1 vaccine với TCID50 là 106,75/ml để sử dụng cho phản ứng MN, virus có MOI nằm trong khoảng từ 2,23x10-3 tới 4,57x10-3.
4. Xác định được mật độ tế bào thích hợp cho phản ứng MN là 2,0x105 tế bào/ml.
5. Xác định được thời gian gây nhiễm virus vào tế bào, cụ thể là ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng, trong khi đó, với sự có mặt của trypsin (0,5 µg/ml) thì thời gian gây nhiễm tốt nhất là 18 tiếng.
6. Thiết lập và hoàn thiện kĩ thuật MN với độ ổn định và độ đặc hiệu cao được sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1.
7. Với giá trị ngưỡng dương tính của phản ứng MN là 20 thì có 98% số mẫu (đã loại bỏ những người trên 60 tuổi) được xác định cho kết quả tương đồng với kết quả của kĩ thuật HI (giới hạn dương tính là 40).
B. Bước đầu ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1
8. Có 16 mẫu dương tính trên tổng số 311 mẫu xét nghiệm, chiếm 5,14%. Trong đó có 3 trường hợp tiếp xúc với bệnh nhân, 14 người tiếp xúc với gia cầm.
Phần lớn các trường hợp có hiệu giá KT trung hòa thấp (20-80), có thể do tiếp xúc với virus LPAI. Một số trường hợp mẫu huyết thanh của người trên 60 tuổi có thể đã làm cho kết quả MN và HI khác nhau. Nếu loại bỏ các trường hợp này thì tỉ lệ tương đồng giữa hai kĩ thuật này là tương đối cao (98%).
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu, xác định các điều kiện thực hiện tốt nhất nhằm làm tăng độ nhạy, giúp hoàn thiện hơn nữa phản ứng MN.
2. Tiến hành phản ứng MN với các chủng virus cúm khác như H1N1, H3N2, chủng H5N1 có độc lực.
3. Thực hiện phản ứng trên một số lượng mẫu lớn hơn để khẳng định chắc chắn hơn nữa hiệu quả và độ tin cậy của phản ứng trung hoà vi lượng.
4. Xác định các dòng tế bào khác có khả năng thay thế cho tế bào MDCK sử dụng trong phản ứng MN.
5. Tiến hành phản ứng MN với toàn bộ số mẫu thu được và phân tích hiệu giá MN trên người tiếp xúc với gia cầm và người tiếp xúc với bệnh nhân, điều này có ý nghĩa quan trọng trong điều tra huyết thanh dịch tễ học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Văn Ty (2004), Virut học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
2. Ann H. R., et al. (2000), “Characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus neuraminidase gene”, Microbiology, 97, p. 6785-6790.
3. Babakir-Mina M., et al. (2007), “Influenza virus A (H5N1): a pandemic risk?”, New Microbiol, 30(2), p. 65-78.
4. Barry J.M. (2004), “The great influenza: the epic story of the deadliest plague in history”, New York, 2004.
5. Beigel J.H., Farrar J., Han A.M., et al. (2005), “Avian Influenza A (H5N1) Infection in Humans”, The new England Journal of Medicine, 353(13), 1374-85.
6. Brankston G., et al. (2007), “Transmission of influenza A in human beings”,
Lancet Infect Dis, 7, p. 257–65.
7. Bui B.B. (2005), “Measures to control Avian Influenza and Pandemic Preparedness in Vietnam”, Meeting on avian influenza & human pandemic influenza. Geneva.
8. Chan P.K. (1997), “Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34, p. 58–S64.
9. Chen H., et al. (2005), “Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl”, Nature, 436, p. 191–192.
10. Chotpitayasunondh T., Ungchusak K., et al. (2005), “Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004”, Emerg Infect Dis, 11, p. 201-209. 11. Coiras M.T., et al. (2003), “Simultaneous detection of influenza A, B, and C
viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assay”, J Med Virol., 69(1), p. 132-44.
12. Deregt D., et al. (2000), “Antigenic and molecular characterization of a herpesvirus isolated from a North American elk”, Am J Vet Res, 61(12), p. 1614-8.
13. Dwyer D.E., et al. (2006), “Laboratory diagnosis of human seasonal and pandemic influenza virut infection”, MJA, 185, p. 48-53.
14. Frank A.L., et al. (1980), “Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement”, J Clin Microbiol, 12(3): p. 426-32.
15. Gibson U.E. and Heid C.A. (1996), “A novel method for real time quantitative RT-PCR”, Genome Res, 6(10), p. 995-1001.
16. Govorkova E. A., Murti G. and Meignier B. (1996), “Afican Green Monkey Kidney (Vero) Cells Provide an alternative host cells system for Influenza A and B viruses”, Journal of Virology, 70(8), p. 5519-5524. 17. http://virology-online.com/general.
18. http://www-micro.msb.le.ac.uk
19. Hulse-Post D.J., et al. (2007), “Molecular changes in the polymerase Genes (PA and PB1) Associated with High Pathogenicity of H5N1 Influenza virut in Mallard Ducks”, Journal of Virology, 81(16): p. 8515-8524.
20. International Committee on Taxonomay of Viruses (2007), “Orthomyxoviridae”.
21. Katz J.M. and Lim W. (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, p. 1763-1770. 22. Kawaoka Y. (1988), “Sequence requirements for cleavage activation of
influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells” Proc. Nati. Acad. Sci, 85, p. 324-328.
23. Kuiken T. (2004), “Avian H5N1 influenza in cats”, Science. 306.(5694), p.241.
24. Lazarowitz G.S. (1975), “Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide”,
Virology, 68(2) p. 440-454.
25. Menno D., de Jong and Tran T.H. (2006), “Review Avian influenza A (H5N1)”, Journal of Clinical Virology, 35(1), p. 02-13.
26. Mounts A.W. and Kwong H. (1997), “Case-control study of risk factors for avian influenza A (H5N1) disease, Hong Kong”, J Infect Dis, 180, p. 505-8.
27. Nguyen, T.L. (2005), “Lack of H5N1 avian influenza transmission to hospital employees, Hanoi, 2004”, Emerg Infect Dis, 11, p. 210-5.
28. Nicholson K.G. et al. (2003), “Influenza”, Lancet, 362, p. 1733-1745.
29. Noppenberger J.K., et al. (2007), “Avian influenza: A review”, Am J Health- Syst Pharm, 64, p. 149-165.
30. Olsen B., et al. (2006), “Global patterns of influenza a virus in wild birds”
Science, 2006. 312(5772) p. 384-388.
31. Osterhaus J.C., Rimmelzwaan G. F., Claas E.C.J. (2002), “H5N1 influenza in Hong Kong: virut charaterization”, Vaccine, 20(2), p82-83.
32. Oxford J.S. (2000), “Infuenza A pandemics of the 20th century with special reference to 1918: virology, pathology and epidemiology”, Med. Virol, 10, p. 119±133.
33. Peiris J. S., Menno D. J., and Guan Y. (2007), “Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health”, Clinical Microbiology Reviews, 20(2), p. 243-267.
34. Profeta M.L. and Palladino G. (1986), “Serological evidence of human infections with avian influenza viruses”, Arch. Virol., 90, p. 355-360. 35. Rajagopal S. and Treanor J. (2007), “Pandemic (avian) influenza”, Semin
Respir Crit Care Med, 28(2) p. 159-70.
36. Robert A.L. and Krug R.M. (2001), “Orthomyxoviridae: the viruses and their replication”, Fields Virology, Philadelphia Press, pp 1487-1531.
37. Robert G.W., (2002), “WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance”, World Health Organization.
38. Robert G.W., et al. (2005), “The spread of the H5N1 bird flu epidemic in Asia in 2004”, Arch Virol, 19, p. 117-129.
39. Robert G.W., et al. (1992), “Microbiology Evolution and Ecology of Influenza A Viruses”, Microbiological Reviews, 56, p. 152-179.
40. Rodney M.R., et al. (2005), “Molecular Diagnosis of Medical Viruses”, Curr. Issues Mol. Biol., 9, p. 87-102.
41. Rowe T., et al. (1999), “Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays”,
Journal of Clinical Microbiology, 37(4), p. 937-943.
42. Rowe T., et al. (1999), “Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays”, J Clin Microbiol, 37(4), p. 937-43.
43. Russell R.J., et al. (2006), “The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design”, Nature, 443(7107), p. 45-9.
44. Sara E.M., (1997), “Use of electron microscopy to diagnose viral illnesses”,
Ann Saudi Med, 17, p. 66-76.
45. Scholtissek C., (1998), “Influenza in pigs and their role as the intermediate host”, Blackwell Science.
46. Scholtissek C., et al. (1978), “On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2”, Virology, 87, p. 13-20.
47. Shin-ichi T. (2005), “Mechanisms of Broad Cross-protection Provided by Influenza Virus Infection and their Application to Vaccinces”, Jpn. J. Infect. Dis., 58, p. 195-207.
48. Smith G.J., Nguyen T.D., et al. (2006), “Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam”,
Virology, 350(2), p. 258-68.
49. Songsermn T., Amonsin A., et al. (2006), “Avian influenza H5N1 in naturally infected domestic cat”, Emerg Infect Dis, 12(4), 681-3.
50. Stephenson I., et al. (2004), “Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic”, Lancet Infect Dis, 4, p. 499-509. 51. Stockton J. et al. (1998), “Multiplex PCR for typing and subtyping influenza
52. Subbarao K., et al. (1998), “Characterization of an avian influenza (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness”, Science, 279, p. 393-396.
53. Suzuki Y., “Sialobiology of Influenza Molecular Mechanism of Host Range Variation of Influenza Viruses”, Biol. Pharm., 28(3), p. 399-408.
54. Taisuke H. and Kawaoka Y. (2007), “Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses”, Trends in Molecular Medicine, 12(11), pp. 506-514.
55. Taubenberger J.K., Lourens R.M. et al. (2005), “Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes”, Nature, 437, p. 889-893.
56. Thanawongnuwech R., Rachod Tantilertcharoen and Yong P. (2005) “Probable Tiger-to-Tiger Transmission of Avian Influenza H5N1”,
Emerging Infectious Diseases, 11(5), 699-701.
57. The NSW Public Health Bulletin (2006), Factsheet: pandemic influenza, 17(9- 10): p. 152-3.
58. Tran T. H., et al. (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, p. 1179-1188.
59. Ungchusak K., Dowell S.F., et al. (2005), “Probable person-to-person transmission of avian influenza A (H5N1)”, The new England Journal of Medicine, 352, p. 333-340.
60. Vorndam V. and Beltran M. (2002), “Enzyme-linked immunosorbent assay- format microneutralization test for dengue viruses”, Am J Trop Med Hyg, 66(2), p. 208-12.
61. Webby R.J. (2001), “Emergence of influenza A viruses” Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 356, p. 1817-1828.
62. White D.O. and Frank L. F. (1994), Medical Virology, Academic Press.
63. WHO (2005), “WHO inter-country-consultation: influenza A/H5N1 in humans in Asia”, Manila, Philippines.
64. WHO (2006), “H5N1 avian influenza in domestic cats”.
65. WHO (2007), “Availability of H5N1 prototype strains for influenza pandemic vaccine development”.
66. WHO (2007), “H5N1 avian influenza: Timeline of major events 30 November 2007”.
67. World Organisation for Animal Health (2000), “Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000”
68. Yu, H.J., et al. (2006), “The first confirmed human case of avian influenza A (H5N1) in mainland, China”, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 27(4), p. 281-7.