BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI *** pQ| *** CAO THI TUẢT TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ■ ■ ■ CÁC DẪN CHẤT O-ACYLFLUCONAZOL (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 2002 - 2007) Giáo viên hướng dẫn : TS. NGƯYẼN h ả i n a m DS. NGÔ ANH NGỌC Nơi thực hiện : BỘ MÔN HÓA DƯỢC Thời gian thực hiện : 8/2006 - 4/2007 \ Ku s t o v • > HÀ NỘI - 05/2007 jfe— j ■ I. ■— ■ I. II. - II [f £ Ỉ Ỉ 3 ( h  M .& H txĩvưêe. ítè t eltú p lié p tò i đutU' hàíỊ tó lồ i e ả m đ u oltủn th à n h tổ'i ^7cS. Qlfftttjen l ô ả i Qĩant, <7)&. Q lạ â cJh tlt (tỉĩtỊOt1 ĩtã t ậ n t in h liíió iitỊ d à n o à tiff) m oi ĩtìỉn Uièn th u ậ n lờ i eltú tồ i tiíìiKỊ q u á ỉiì tiíi tlttie hiên khéo. Luân tế t iMỊỈiìêp nin/. '“ĩồ ì x h i (‘h ân th à n h cảm (iti yĨỉis . Q lạu ụễti JHittli ^ ĩuâtt (p íiỏ ttt/ hét! liị - r()ièu Uínìtt Itúe h ìn h u i), ph òníỊ p it Ố eộtỉíỊ Ittt'tUnj từ h ạ t n h â n - (ĩỳiỉn h o a r ĩc S . @MO ^Otnt ((B& m òn (J)i sin h — ^ ĩrttà ttt/ (D ại húo "JCtL Q lệ iị đ ã ÍỊỈÚỊỊ lò i ln)àn th ành, Uítớtt lu ận tú t rtạhiẰỊL ttà ụ . (%>ỉn ehân th ành, eátit úti eáe tỉìầ tị cô tfiáú, eáe. a n h ehi Uĩị th u ậ t oỉên bê tn ôti Tỉôóíí ri)iìọ v - ^Jttitintf (Ị)ại học ^Otúie 'JÔÌL Q lộ i đ ã úntỊ lì ộ tò i trứng, iẤ iết q u á ỉr ì t t h là m ií t lie n ạ h iê tu tạ i. b ê tttôtt. (ẫuối eùnụ x iri tdtĩut th à n h í‘ám ổn g ia đình., ỉ)ạII h ỉ - những. IKỊIIÒÌ luồn, hát cá II ít, ĩtỏmị oièti, Ultíeh lỀ túi eố gắng, Itúe tập, phấn, (tail đế ỉinàtt th à n h Uỉìéa lu ân tố t ttạhiỀp,. ^ỈỖỈI Q lòì, utỊÙụ 15 ỉliáíH Ị 5 n ám 2 0 0 7 S in h , o iê a : ©a& ^7 h ì £7u â ú t MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH CÁC CHỮ VIÉT TẮT Trang ĐẶT VẤN ĐÈ 1 Phần 1: TỔNG QUAN 2 1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM VÀ CÁC THUỐC ĐIỀU TRỊ HIỆN NAY 2 1.1.1. Tình hình nhiễm nấm 2 1.1.2 . Các thuốc điều trị nấm hiện nay 3 1.2. FLC VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA FLC 5 1.2.1. Fluconazol 5 1.2 .2 . Các dẫn chất của FLC 8 1.3. CÁC ACID BÉO VÀ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM 8 1.4. ENZYM N-MYRISTOYL TRANSFERASE 11 1.5. PHẢN ỨNG ACYL HÓA VÀ ỨNG DỤNG TRONG TỒNG HỢP CÁC DẪN CHẤT O-ACYLFLUCONAZOL 13 1.5.1. Phản ứng acyl hóa 13 1.5.2. ứng dụng phản ứng acyl hoá để bán tổng hợp các dẫn chất ester của fluconazol: 17 Phần 2: NGUYỀN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. NGUYÊN LIỆU, DƯNG MÔI HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20 2.1.1. Nguyên liệu 20 2.1.2. Dung môi hoá chất 20 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 20 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u 21 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 21 Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 22 3.1.1. Tổng hợp ơ-hexanoylfluconazol (I): 22 3.1.2. Tổng hợp O-octanoylfluconazol (II): 24 3.1.3. Tổng hợp ỡ-nonanoylfluconazol (III): 26 3.1.4. Tổng hợp ỡ-decanoylfluconazol (IV): 27 3.1.5. Tổng hợp O-lauroylfluconazol (V): 28 3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 30 3.2.1. Nguyên tắc 30 3.2.2. Chất thử 31 3.2.3. Giống vi nấm kiểm định 31 3.2.4. Môi trường thử nghiệm 31 3.2.5. Tiến hành 31 Phần 4: BÀN LUẬN 33 4.1. HÓA HỌC 33 4.1.1. Tổng hợp hóa học 33 4.1.2. Khẳng định cấu trúc của các chất đã tổng hợp được 34 4.2. TÁC DỤNG SINH HỌC 38 Phần 5: KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 5.1. KẾT LUẬN 44 5.2. ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Nồng độ ức chế tối thiểu của các acid béo đối với 4 loại nấm 9 Bảng 2: Các tác nhân acyl hoá thường gặp 14 Bảng 3: Các dẫn chất ơ-acylfluconazol tổng hợp được 30 Bảng 4: Dữ liệu phổ hồng ngoại của các chất tổng hợp được 35 Bảng 5: Kết quả phân tích phổ khối cuả 3 chất II, IV, V 37 Bảng 6 : Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được 39 Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính sinh học của 3 chất III, IV, V 39 Bảng 8 : Giá trị LogP và Kp của fluconazol và các chất tổng họp được 41 Bảng 9: Kết quả docking của fluconazol và các chất tổng họp được 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Cơ chế tác dụng của FLC 6 Hình 2: cấu trúc 3D của NMT 11 Hình 3: Phản ứng xúc tác quá trình myristoyl hóa protein của NMT 12 Hình 4: Quá trình myristoyl hóa peptid 12 Hình 5: Hình ảnh docking của O-lauroylfluconazol (V) 42 CÁC CHỮ VIÉT TẮT AMB Amphotericin B FLC Fluconazol DCM Dicloromethan DMF Dimethylformamid SKLM Sắc ký lớp mỏng Rf Độ phân giải IR Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại) MS Mass spectroscopy (phổ khối) ESI Electrospray ionization 'H-NMR Nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ proton Mđl Mốc đen 1 Mđ2 Mốc đen 2 Mxl Mốc xanh 1 Mx2 Mốc xanh 2 ĐẶT VẤN ĐÊ • Nhiễm nấm là một căn bệnh ngày càng phổ biến, bệnh có thể xảy ra ở bề mặt cơ thể như da, tóc móng, niêm mạc hoặc sâu trong nội tạng như tim, não, phổi, Nguy cơ nhiễm nấm đặc biệt cao khi cơ thể giảm sức đề kháng: ví dụ nhiễm HIV/AIDS, cấy ghép cơ quan, dùng thuốc ức chế miễn dịch, Do các tổ chức nấm phát triển chậm và thường tồn tại ở các mô khó thấm thuốc nên việc điều trị các bệnh do nấm thường lâu hơn và khó hơn nhiễm khuẩn. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều thuốc điều trị bệnh nhiễm nấm song mỗi thuốc lại có một số hạn chế như độc tính cao, bất tiện trong sử dụng hay tình trạng xuất hiện kháng thuốc mạnh, Đây là những nguyên nhân chính dẫn đến điều trị bệnh kém hiệu quả và thất bại. Fluconazol (FLC) là một thuốc chống nấm triazol đường uống có độc tính thấp được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh. Tuy nhiên thuốc có phổ tác dụng hẹp, không phải là thuốc diệt nấm, không thể dùng qua da và tỷ lệ kháng thuốc ngày càng tăng. Trong những năm qua các nhà khoa học trên thế giới không ngừng nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất của FLC nhằm tạo ra các sản phẩm có hiệu quả điều trị cao hơn và an toàn hơn [15, 19, 22, 23]. Với mong muốn tổng hợp ra các dẫn chất của FLC có tác dụng tốt hơn và hạn chế được các nhược điểm của thuốc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất O- acylfluconazol”, với những mục tiêu nghiên cứu sau: • Tổng hợp một số dẫn chất acyl của FLC với các acid no mạch thẳng. • Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất đã tổng hợp được. • Sơ bộ thử hoạt tính chống nấm, mốc của các dẫn chất đã tổng hợp được. 1 Phần 1: TỎNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM VÀ CÁC THUÓC ĐIÈU TRỊ HIỆN NAY 1.1.1. Tình hình nhiễm nấm Trong những năm gần đây cùng với sự tăng lên của tuổi thọ trung bình của loài người thì bệnh nhiễm nấm cũng gia tăng một cách khủng khiếp. Có rất nhiều nguy cơ gây ra nhiễm nấm và đại dịch AIDS là một trong những nguy cơ chính quan trọng. Trong suốt hai thập kỷ qua, với hậu quả của đại dịch này bệnh nhiễm nấm Candida niêm mạc tăng lên mạnh mẽ trong đó nhiễm Candida hầu họng là nhiễm trùng cơ hội gặp nhiều nhất ở bệnh nhân nhiễm HIV chiếm đến 90% số bệnh nhân này [15]. Và có đến 10% bệnh nhân AIDS bị viêm màng não do Cryptococcus trong giai đoạn trước điều trị bằng liệu pháp kháng virus sao chép ngược hoạt tính cao [12]. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đặc biệt là trong lĩnh vực y học, các phương pháp hiện đại đã được áp dụng rộng rãi trong điều trị trong đó có phẫu thuật cấy ghép các cơ quan nội tạng nhưng nó lại là nguy cơ lớn phát sinh bệnh nhiễm nấm. Có nghiên cứu cho thấy có đến 5% bệnh nhân nhiễm nấm sau phẫu thuật cấy ghép thận, 35% sau phẫu thuật cấy ghép tim và phổi, trên 40% sau cấy ghép gan và tỷ lệ nhiễm nấm cao ở bệnh nhân sau cấy ghép tủy xương [12]. Ngoài ra mắc bệnh nấm còn là hậu quả của việc sử dụng các hóa chất trong hóa trị liệu ung thư, sử dụng kháng sinh bừa bãi và sử dụng corticoid kéo dài [12-14, 20]. Chúng ta thấy rằng bệnh nấm tăng lên nhanh chóng trong vài thập kỷ qua và còn tiếp tục tăng lên trong những năm tới. Bên cạnh tần suất mắc bệnh tăng lên, nhiễm nấm còn là nguyên nhân gây tử vong cao. Đến hơn 40% bệnh nhân tử vong do nhiễm nấm máu gây ra bởi Candida albicans và hơn 50% ở bệnh nhân bị nhiễm Aspergillus [13]. 2 Hơn nữa có báo cáo cho thấy trước kia có một số loài nấm được cho rằng chỉ là yếu tố xâm nhập không gây bệnh hoặc chỉ gây ô nhiễm môi trường, nhưng ngày nay một số loài này đã kháng lại tất cả các loại thuốc điều trị nấm có trên thị trường lại là nguyên nhân chính gây ra nhiễm nấm bề sâu và nhiễm trùng nặng nguy hiểm đến tính mạng. Một số loài nấm sợi như Scedosporium prolificans, Fusarium spp. và một số loài thuộc nhóm Zygomycetes gây ra các nhiễm trùng chết người nhưng không đáp ứng các phương pháp điều trị hiện nay [13]. Nhiễm nấm cơ hội nổi lên là một trong những nguyên nhân quan trọng sinh ra bệnh tật và tử vong ở cả bệnh nhân suy giảm miễn dịch, người có miễn dịch tốt và trở thành một thách thức lớn đối với các nhà lâm sàng trong việc điều trị các bệnh do nấm gây ra cũng như các nhà nghiên cứu tổng hợp hóa dược nhằm tạo ra các thuốc mới có hiệu quả điều trị cao hơn và an toàn hơn. 1.1.2. Các thuốc điều trị nấm hiện nay Có 3 nhóm thuốc chính được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm nấm: các kháng sinh chống nấm, các allylamin và các azol. - Các kháng sinh chống nấm: amphotericin, nystatin, griseofulvin, - Các allylamin: naftifin, terbinafin, - Các azol: clotrimazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, miconazol, Ở đây chúng tôi trình bày về một số thuốc điển hình. • Amphotericin B (AMB): Đây là một kháng sinh chống nấm phổ rộng, tác dụng mạnh trên các nấm men sinh bệnh, mốc và nấm da. về cơ chế tác dụng, thuốc liên kết với các sterol của màng tế bào, làm thay đổi độ thấm của màng dẫn đến nấm bị tiêu diệt. Thuốc có tác dụng trên các loài c. albicans, c. neoformans, Blastomyces dermatỉtỉdỉs, Histoplasma capsulatum, Coccỉdỉoỉdes ỉmmitis, Aspergillus. AMB là thuốc được lựa chọn hàng đầu trong điều trị nhiễm nấm nặng toàn 3 [...]... dùng trong điều trị nhiễm nấm tại chỗ, nấm da chân, nấm râu, nấm da đầu, • Ketoconazol: Là một thuốc thuộc nhóm azol có tác dụng ức chế sinh tổng hợp ergosterol của màng tế b o nấm Ketoconazol được dùng để điều trị bệnh nấm do các loài Blastomyces, Candida spp gây ra Tuy nhiên ketoconazol ở liều cao tác dụng lên cả cytochrom P450 ở người nên gây ức chế sinh tổng hợp hormon steroid ở người Ngoài ra... Br(CH2)nCO OH 2.2 0.14 0.18 5 0.08 3.1 2.4 10 Ph(CH2)iiCOOH >5 0.04 1.1 2.3 11 N3(CH2)nCOO H 1.3 0.16 0.3 0.3 12 PhO(CH2)nCO OH >5 >5 >5 5.3 13 MeO(CH2)ioCOOH >5 0.36 0.72 1.4 14 EtS(CH2)ioCOOH 5.1 0.08 0.63 1.3 15 Br(CH2)ioCOOH 1.2 0.08 0.08 0.3 16 4-I-PhO(CH2)ioCOOH >5 >5 1.5 3.1 17 PhO(CH2)ioCOOH >5 0.14 1.1 2.2 18 Me(CH2)nCH(F)COOH >5 5.1... kháng nấm ỉn vitro cho thấy các chất tổng hợp được có tác dụng tốt hơn và có phổ tác dụng rộng hon FLC trong đó có các dẫn chất ester carboxylic và ester phosphat của FLC [15, 19, 22, 23] Từ những nghiên cứu trên đã gợi mở cho chúng tôi hướng kết hợp fluconazol với một số acid b o no mạch thẳng nhằm t o ra các dẫn chất mới có tác dụng kháng nấm ưu việt hơn 1.3 CÁC ACID B O VÀ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM Qua... cứu tổng hợp t o ra thuốc kháng nấm mới hiệu quả hơn, an toàn hon, phổ tác dụng rộng hơn và đã được áp dụng trong điều trị như các dẫn xuất của triazol: itraconazol, voriconazol, posaconazol, các thuốc ức chế tổng hợp glucan capsofungin Đây là thuốc có thể thay thế cho AMB (ít độc tính hơn) hoặc FLC (phổ rộng hơn) trong điều trị nhiễm Candida toàn thân 4 1.2 FLC VÀ MỘT SÓ DẪN CHẤT CỦA FLC 1.2.1 Fluconazol:... cách acetyl hoá - T o hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp hoá học Ví dụ: amid của homoveratrilamin với các acid carboxylic khác nhau là trung gian để tổng họp nhân isoquinolon trong tổng hợp các thuốc papaverin, emetin 16 1.5.2 ứng dụng phản ứng acyl hoá để bán tổng hợp các dẫn chất ester của fluconazol: Nguyên liệu để thực hiện các phản ứng bán tổng họp là FLC và các tác nhân acyl clorid FLC... 3 + HCOOCH3 -► HCONH2 + CH3OH • Các amid: Đây là những tác nhân acyl hoá yếu nên ít được sử dụng Hai tác nhân hay được sử dụng là formamid (HCONH2) và carbamid (H2NCONH 2) Carbamid được sử dụng để acyl hoá alcol thành uretan: C2H5OH + H2NCONH2.HNO3 - ► C2H5OCONH2 + NH4NO3 • Các anhydrid acid: Anhydrid là những tác nhân acyl hoá mạnh, có thể acyl hoá được amin, alcol và phenol vì không t o ra nước... thấm của thuốc qua màng tế b o và thuốc bị bơm ra ngoài màng tăng • Một số enzym của nấm có tác dụng chuyển thuốc từ dạng không có hoạt tính sang dạng có hoạt tính bị ức chế nên làm thuốc bị mất tác dụng • Tế b o nấm tiết ra một số enzym ra ngoài màng tế b o làm phá hủy thuốc 1.2.2 Các dẫn chất của FLC Đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất của FLC, kết quả thử. .. o phổ ƯV Lambada EZ210 Spectrophotometer - Máy o phổ hồng ngoại (Perkin Elmer) - Máy o phổ khối LC-MDS-Trap-SL 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u - Tổng hợp các dẫn chất ester của fluconazol với một số acid no mạch thẳng - Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất đã tổng họp - Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất thu được với các chủng nấm 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u - Sử dụng phương pháp tổng họp hoá... Hexanoyl clorid C5HJ1COCI Octanoyl clorid C7H 15COCl Nonanoyl clorid C8H 17COCl Decanoyl clorid C9H19COCl Lauroyl clorid C,iH 23COC1 Các tác nhân này đều không bền trong môi trường nước Khi gặp nước chúng phân huỷ thành các acid carboxylic theo phương trình phản ứng sau: ọ 0 R —c // II HoO R- -C- -OH HC1 Y C1 Các acid carboxylic này là tác nhân acyl hoá yếu nên không thể acyl hoá được -OH của FLC Hiện tượng... trong tế b o nấm như ion kali, các acid amin và nấm bị tiêu diệt Ở mức độ phân tử, 1 trong các nguyên tử N của vòng azol liên kết với nguyên tử Fe của phần Hem của enzym cytochrom p 450 của lanosterol 14ademethylase ngăn sự hoạt hóa oxy cần thiết cho quá trình demethyl hóa lanosterol Và nguyên tử N thứ 2 tương tác trực tiếp với apoprotein của lanosterol demethylase làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng . NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 22 3.1.1. Tổng hợp ơ-hexanoylfluconazol (I): 22 3.1.2. Tổng hợp O- octanoylfluconazol (II): 24 3.1.3. Tổng hợp ỡ-nonanoylfluconazol (III): 26 3.1.4. Tổng hợp. ketoconazol ở liều cao tác dụng lên cả cytochrom P450 ở người nên gây ức chế sinh tổng hợp hormon steroid ở người. Ngoài ra một số thuốc azol khác như clotrimazol, miconazol, itraconazol,. 7: Kết quả thử hoạt tính sinh học của 3 chất III, IV, V 39 Bảng 8 : Giá trị LogP và Kp của fluconazol và các chất tổng họp được 41 Bảng 9: Kết quả docking của fluconazol và các chất tổng họp được