- Sử dụng phương phâp tổng họp hoâ học để tổng hợp ra sản phẩm trín nguyín tắc của phản ứng acyl hoâ.
- Theo dõi phản ứng bằng sắc kí lófp mỏng (SKLM), phât hiện vết chất trín bản mỏng bằng đỉn tử ngoại do chất tạo thănh có khả năng hấp thụ ânh sâng tử ngoại.
- Dùng kỹ thuật chiết tâch để loại dần câc tạp trong hỗn hợp phản ứng. - Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi thích hợp. - Xâc định cấu trúc của câc chất tổng hợp được dựa trín dữ liệu phđn tích phổ IR, MS, ‘H-NMR.
- Thử tâc dụng chống nấm in vitro của câc chất tổng hợp được trín một số chủng vi nấm theo phương phâp khuếch tân.
- LogP được tính bằng phần mềm KowWin. - Kp được tính bằng phần mem Derm Win.
Phần 3: THựC NGHIỆM VĂ KĨT QUẢ
3.1. TỎNG HỢP HÓA HỌC
Trong khoâ luận năy, chúng tôi đê tiến hănh câc phản ứng tổng hợp câc dẫn chất ỡ-acylfluconazol (I-V) theo sơ đồ phản ứng sau:
. 0 -OH + R—C.\ DMF C1 NaH R Chất -(CH2)4CH3 I -(CH^CHs II -(CH2)7CH3 III -(CTỈ2)8CH3 IV -(CH2)ioCH3 V
Tất cả câc phản ứng trín được tiến hănh trong dung môi dimethylformamid (DMF) khan vă xúc tâc NaH (dạng 60% trong dầu). Câc phản ứng đều thực hiện ở nhiệt độ phòng.
3.1.1. Tổng hợp ỡ-hexanoylfluconazol (I): • Sơ đồ phản ứng: ON n. í o -OH + C1- C - ( C H 2)4— CH3-DMF NaH G-(CH2)4— ch3
• Dụng cụ:
Bình cầu 50 ml, mây khuấy từ, bình gạn, micropipet, cột chạy sắc kí, bình chạy sắc kí lớp mỏng, mây cất quay chđn không.
• Tiến hănh:
Cđn 0,24 g NaH (dạng 60% trong dầu) (6 mmol) cho văo bình phản ứng hình cầu có sẵn thanh khuấy từ. Thím 4 ml DMF khan văo hoă tan.
Cđn 0,612 g FLC (2 mmol) cho văo lọ thuỷ tinh nhỏ, thím 6 ml DMF khan văo hoă tan. Nhỏ từ từ dung dịch FLC văo bình phản ứng đê đặt trín băn khuấy. Khuấy nhẹ trong khoảng 1 giờ. Sau đó nhỏ giọt từ từ 0,8 ml hexanoyl clorid (6 mmol) văo hỗn hợp phản ứng trong khi đang khuấy từ, đế khuấy tiếp ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ.
Chiết tâch: chuyển toăn bộ hỗn họp phản ứng sang bình chiết 100 ml,
thím 30 ml DCM. Sau đó thím khoảng 30 ml dung dịch NaHCƠ3 5%, lắc kỹ, để yín cho tâch lớp rồi gạn lấy lớp dưới DCM có chứa sản phẩm. Chuyển lớp DCM thu được văo bình chiết vă lặp lại quâ trình chiết với NaHCƠ3 5% 2 lần nữa. Dung dịch thu được lắc với 30 ml dung dịch NaCl bêo hoă để phđn lófp vă gạn lấy lớp DCM dưới. Lớp dung dịch năy cho đi qua chất hút ẩm natri sulfat khan đặt trín phễu lọc. Dịch lọc được cô bớt dung môi bằng mây cất quay chđn không thu được sản phẩm thô.
Chuẩn bị cột sắc kỷ silica geh nhồi cột silica gel cao 30 cm, đường kính 1
cm bằng hệ dung môi n-hexan vă aceton có tỉ lệ lă 8:1.
Chạy sắc kỉ cột: hoă sản phẩm thô trong một lượng tối thiểu dung môi
aceton vă đưa nhẹ nhăng lín cột sao cho không lăm xâo trộn lớp silica gel. Dùng hệ dung môi n-hexan : aceton (2:l)lăm pha động để triển khai sắc kí cột. Mở van cho dịch chảy ra khỏi cột vă thu hồi câc ống nghiệm với thể tích 5-5,5 ml.
sắc kỷ ỉớp mỏng', chấm SKLM câc dung dịch trong ống nghiệm trín cùng dung dịch đối chiếu lă sản phẩm thô chạy sắc ký ở hệ dung môi n-hexan : aceton (1:1). Sau một thời gian lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi hữu cơ.
Phât hiện vết chất trín SKLM: dùng đỉn ânh sâng tử ngoại để phât hiện
câc chất hấp phụ trín bản mỏng ở bước sóng X = 254 nm.
Chọn ra những ống nghiệm có duy nhất một vết chất trín SKLM có Rf = 0,54 thu lại đem cất quay chđn không. Sản phẩm tinh khiết thu được dạng dầu đặc, mău trắng, hơi văng vă có khối lượng lă 0,42g.
• Kết quả:
- Hiệu suất: 51,9%.
- Khả năng hoă tan: ơ-hexanoylfluconazol không tan trong nước, tan tốt trong DCM vă aceton.
- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (1:1) thì sản phẩm có Rf = 0,54. - Phổ IR (KBr, cm'1): 1746,27 (-C=0), 2933,79 (-CH3), 2872,51 (-CH2-), 1599,32, 1506,48 ( O C (Ar)), 1207,02,1140,48 (Ar-F). 3.1.2. Tổng hợp O-octanoylfluconazol (II): • Sơ đồ phản ứng: F F II
• Dụng cụ:
Bình cầu 50 ml, mây khuấy từ, bình gạn, micropipet, cột chạy sắc kí, bình chạy sắc kí lớp mỏng, mây cất quay chđn không.
• Tiến hănh:
Tiến hănh phản ứng tương tự như chat I nhưng với hóa chất lă 1 ml octanoyl clorid ( 6 mmol). Sau thời gian phản ứng, tiến hănh câc bước chiết tâch, chuẩn bị cột sắc ký, chạy cột sắc ký, SKLM, phât hiện vết chất như 3.1.1. Ở đđy có một số điểm khâc lă cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỉ lệ 9:1, hệ dung môi khai triển sắc ký cột lă n-hexan : aceton có tỉ lệ 3:1 vă hệ dung môi chạy SKLM lă n- hexan : aceton có tỉ lệ 2:1. Thu hồi câc ống nghiệm mă trín sắc kí đồ cho một vết chất duy nhất có Rf = 0,50 để cất quay chđn không loại dung môi thu sản phẩm tinh khiết. Sản phẩm thu được ở dạng dầu lỏng, trắng ngă có khối lượng lă 0,47g.
• Kết quả:
- Hiệu suất: 54,3%.
- Khả năng hoă tan: ơ-octanoylfluconazol không tan trong nước, tan tốt trong DCM, aceton.
- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (2:1) thì sản phẩm có Rf = 0,50.
- Phổ IR (KBr, cm'1): 1746,67 (-C=0), 2929,91 (-CH3), 2858,93 (-CH2-), 1507,28 ( O C (Ar)), 1207,05, 1144,64 (Ar-F).
3.1.3. Tổng hợp ơ-nonanoylfluconazol (III):
• Sơ đồ phản ứng:
F F
III
• Dụng cụ:
Bình cầu 50 ml, mây khuấy từ, bình gạn, micropipet, cột chạy sắc kí, bình chạy sắc kí lóp mỏng, mây cất quay chđn không.
• Tiến hănh:
Tiến hănh phản ứng tương tự như chất I nhưng với hóa chất lă 1,1 ml nonanoyl clorid (6 mmol). Sau thời gian phản ứng, tiến hănh câc bước chiết tâch, chuẩn bị cột sắc ký, chạy cột sắc ký, SKLM, phât hiện vết chất như 3.1.1. Có một số điểm khâc biệt lă cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỷ lệ 9:1, hệ dung môi dùng triển khai sắc ký cột lă n-hexan : aceton có tỷ lệ 4:1 vă hệ dung môi chạy SKLM lă n-hexan : aceton có tỷ lệ 2:1. Thu hồi câc ống nghiệm mă trín sắc ký đồ cho một vết chất duy nhất có Rf = 0,53, sau đó cất quay chđn không loại dung môi. Sản phẩm tinh khiết thu được dạng dầu lỏng, trắng ngă vă có khối lượng lă 0,57g.
• Kết quả :
- Hiệu suất: 63,8%.
- Khả năng hoă tan: ỡ-nonanoylfluconazol không tan trong nước, tan tốt trong DCM, aceton.
- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (2:1) thì sản phẩm có Rf = 0,53. - Phổ IR (KBr, cm'1): 1746,86 (-C=0), 2928,31 (-CH3), 2857,11 (-CH2-), 1507,07 (C=C (Ar)), 1207,09, 1144,57 (Ar-F). - Phổ ‘H-NMR (CDC13, ô ppm, 500 MHz): 7,95 (2H, s); 7,87 (2H, s); 6,8 8-6 ,8 6 (1H, m); 6,84-6,78 (2H, m); 5,13 (4H, dd); 2,34-2,28 (2H, m); 1,32- 1,28 (12H, m); 0,89 (3H, t). 3.1.4. Tổng hợp O-decanoylfluconazol (IV): • Sơ đô phản ứng: IV • Dụng cụ:
Bình cầu 50 ml, mây khuấy từ, bình gạn, micropipet, cột chạy sắc kí, bình chạy sắc kí lớp mỏng, mây cất quay chđn không.
• Tiến hănh:
Tiến hănh phản ứng tương tự như chất I nhưng với hóa chất lă 1,3 ml decanoyl clorid (6 mmol). Sau thời gian phản ứng, tiến hănh câc bước chiết tâch, chuẩn bị cột sắc ký, chạy cột sắc ký, SKLM, phât hiện vết chất như 3.1.1. Điểm khâc trong câc bước đó lă cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỷ lệ 9:1, hệ dung môi dùng triển khai sắc ký cột lă n-hexan : aceton có tỷ lệ 3:1 vă hệ dung môi chạy SKLM lă n- hexan : aceton có tỷ lệ 1:1. Thu hồi câc ống nghiệm mă trín sắc ký đồ cho
một vết chất duy nhất có Rf = 0,59, cất quay chđn không loại dung môi. Sản phẩm tinh khiết thu được dạng dầu, trắng ngă vă có khối lượng lă 0,55g.
• Kết quả :
- Hiệu suất: 59,7%.
- Khả năng hoă tan: ỡ-decanoylfluconazol không tan trong nước, tan tốt trong DCM, aceton.
- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (1:1) thì sản phẩm có Rf = 0,59. - Phổ IR (KBr, cm'1): 1748,75 (-C=0), 2927,89 (-CH3), 2857,07 (-CH2-), 1507,50, 1459,03 (C=C (Ar)), 1206,75, 1145,04 (Ar-F). - Phổ MS (ESI): m/z 461 (M+H). 3.1.5. Tổng hợp ỡ-lauroylfluconazol (V): • Sơ đồ phản ứng: V • Dụng cu:
Bình cầu 50 ml, mây khuấy từ, bình gạn, micropipet, cột chạy sắc kí, bình chạy sắc kí lóp mỏng, mây cất quay chđn không.
• Tiến hănh:
Tiến hănh phản ứng tương tự như chất I nhưng với hóa chất lă 1,4 ml lauroyl clorid (6 mmol). Sau thời gian phản ứng, tiến hănh câc bước chiết tâch, chuẩn bị cột sắc ký, chạy cột sắc ký, SKLM, phât hiện vết chất như
3.1.1. Tuy nhiín ở đđy cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỷ lệ 9:1, hệ dung môi dùng triển khai sắc ký cột lă n- hexan : aceton có tỷ lệ 4:1 vă hệ dung môi chạy SKLM lă n-hexan : aceton có tỷ lệ 3:1. Thu hồi câc ống nghiệm mă trín sắc ký đồ cho một vết chất duy nhất có Rf = 0,45, cất quay chđn không loại dung môi. Sản phẩm tinh khiết thu được dạng dầu, trắng ngă vă có khối lượng lă 0,4 lg.
• Kết quả :
- Hiệu suất: 42,0%.
- Khả năng hoă tan: ơ-lauroylfluconazol không tan trong nước, tan tốt trong DCM, aceton.
- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (3:1) thì sản phẩm có Rf = 0,45.
- Phổ IR (KBr, cm'1): 1747,02 (-C=0), 2926,35 (-CH3), 2855,03 (-CH2-), 1506,82 (C=C (Ar)), 1206,83,1143,76 (Ar-F).
- Phổ MS (ESI): m/z 489 (M+H).
Nhđn xĩt:
Trong phần tổng họp hoâ học, chúng tôi đê tổng hợp được 5 dẫn chất O-
acylfluconazol có công thức chung như sau:
- ớ-hexanoylfluconazol (I). - ơ-octanoylfluconazol (II).
F
Bảng 3 : Câc dan chat O-acylfluconazol tống hợp được
Chđt R -C O — Mău săc Rf
Dung môi chạy SKLM
Hiệu suđt (%) I o — C - C C H ^ —ch3 Trăng, hơi văng 0,54 n-hexan: aceton (1:1) 51,9 II o —C-(CH2)6—ch3 Trắng ngă 0,50 n-hexan : aceton (2:1) 54,3 III 0 — " - ( C H ^ —c h3 Trắng ngă 0,53 n-hexan : aceton (2:1) 63,8 IV o —C— (CH2)8— ch3 Trắng ngă 0,59 n-hexan : aceton (1:1) 59,7 V 0 —C-(CH2)10— ch3 Trắng ngă 0,45 n-hexan : aceton (3:1) 42,0
Câc chất tổng hợp được đânh giâ lă tinh khiết dựa trín SKLM. cấu trúc của chúng được khẳng định thông qua câc phương phâp phổ như IR, MS, ’H- NMR (phổ IR, MS, 'H-NMR của câc chất được trình băy ở phụ lục 1-9). Chi tiết băn luận về khẳng định cấu trúc được trình băy ở phần 4.1.2.
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Đẻ đânh giâ hoạt tính sinh học của câc chất đê tổng hợp được chúng tôi tiến hănh khảo sât tâc dụng chống nấm của chúng. Trín cơ sở đó lựa chọn ra những họp chất có hoạt tính sinh học cao, định hướng cho những nghiín cứu tiếp theo ứng dụng trín thực tế. Trong nghiín cứu năy chúng tôi đânh giâ hoạt tính khâng nấm của câc chất đê tổng hợp được bằng phương phâp khuếch tân.
3.2.1. Nguyín tắc
Mầu thử (khoanh giấy lọc được tẩm hoạt chất thử) được đặt lín lớp thạch dinh dưỡng đê cấy vi nấm kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tân văo môi trường thạch sẽ ức chế sự phât triển của vi nấm kiểm định tạo thănh vòng vô nấm.
3.2.2. Chất thử
Chất thử bao gồm 5 chất I, II, III, IV, V vă fluconazol được pha trong dung môi DMF.
3.2.3. Giống vi nấm kiểm định
Do bộ môn Vi sinh-sinh học, trường đại học Dược Hă Nội cung cấp. Chủng vi nấm kiểm định:
- Candida albicans - Mốc xanh 2 (Mx2)
- Aspergillus niger - Mốc đen 1 (Mđl)
- Mốc xanh 1 (M xl) - Mốc đen 2 (Mđ2)
3.2.4. Môi trường thử nghiệm
> Môi trường Sabouraud lỏng nuôi cấy c. albicans: Pepton 1,0%; Glucose 2,0%; nước vđ 100 ml. > Môi trường thử nghiệm Sabouraud đặc:
Pepton 1,0%; Glucose 2,0%; thạch 1,6%; nước vđ 100 ml.
3.2.5. Tiến hănh
- Mầu thử được pha văo dung môi thích họp (DMF) để được nồng độ lmg/ml. Câc khoanh giấy lọc vô trùng được sấy khô vă tẩm 3 lần với mẫu thử, sau mỗi lần đều được sấy khô ở 60 c cho đến khi khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường vă cấy vi nấm kiểm định:
Nấm kiểm định (C. albicans) được cấy văo môi trường Sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phât triển trong tủ ấm 29-30 c trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế băo/ml. Câc loại nấm khâc được cấy văo môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng 121C/20 phút), rồi nuôi trong tủ ấm 29- 30 c trong thời gian 18-24 giờ, sau đó dùng dung dịch Tween 80 0,2% vô trùng lấy băo tử nấm. Lắc đều trong môi trường thạch theo tỷ lệ 2,5 ml (môi
kiểm định, rồi đổ văo đĩa petri vô trùng với thể tích 2 0 ml/đĩa vă để cho thạch đông lại.
- Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc đê được tẩm chất thử vă xử lý như trín được đặt lín bề mặt môi trường thạch kiểm định chứa vi nấm kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
- ủ câc đĩa Petri có mẫu thử được đặt như trín trong tủ ấm ở nhiệt độ 29- 30°c trong 24-72 h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô nấm nếu có bằng thước kẹp Parmer có độ chính xâc 0,02mm .
- Đânh giâ kết quả: Dựa trín đường kính vòng vô nấm vă được đânh giâ theo công thức:
- t D‘ ! < » . - / »
D : Đường kính trung bình vòng vô nấm Dji Đường kính vòng vô nấm thứ
S: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thí nghiệm lăm song song
Kết quả:
Khi tiến hănh thử tâc dụng chống nấm, mốc của 5 chất ở nồng độ 1 mg/ml kết quả sơ bộ cho thấy chỉ có chất III, IV, V có tâc dụng ức chế trín chủng M xl. Đẻ có dữ liệu phđn tích, đânh giâ mối liín quan giữa cấu trúc, câc chỉ số lý, hóa vă hoạt tính khâng nấm, mốc của câc chất năy sđu hơn chúng tôi đê tiến hănh thử chúng ở nồng độ 10 mg/ml với điều kiện vă phương phâp thử như trín. Kết quả thu được cho thấy cả 3 chất trín đều có tâc dụng mạnh đối với 4 chủng A. nỉger, M đl, Mđ2 vă M xl. Ket quả chi tiết ở bảng 6, 7 vă băn luận về hoạt tính sinh học sẽ được trình băy trong phần 4.2.. Hình ảnh minh họa tâc dụng khâng nấm được trình băy ở phụ lục 10-14.
Phần 4: BĂN LUẬN
4.1. HÓA HỌC
4.1.1. Tổng hợp hóa học
- Fluconazol lă một alcol bậc 3, đặc biệt trong công thức cấu tạo của FLC xung quanh nhóm -O H có nhiều nhóm cồng kềnh nín phản ứng tổng hợp câc dẫn chất ester của FLC bằng phản ứng acyl hoâ giữa FLC vă câc tâc nhđn acyl clorid thường rất khó xảy ra hoặc không xảy ra nếu tiến hănh phản ứng acyl hoâ theo phương phâp thông thường. Trong quâ trình tiến hănh thực nghiệm chúng tôi đê sử dụng NaH lăm chất xúc tâc để tâch loại proton ở nhóm -O H tạo ra một tâc nhđn âi nhđn mạnh RO- nín phản ứng xảy ra dễ dăng. Đồng thời chúng tôi đê âp dụng câc điều kiện trong tăi liệu tham khảo để tiến hănh tổng hợp câc chất. Câc phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng vă thời gian phản ứng lă 4 giờ trong đó 1 giờ đầu cho FLC vă xúc tâc văo khuấy trộn để tạo ra RO- sau đó cho acyl clorid văo khuấy trộn tiếp trong 3 giờ [15].
- Trong quâ trình tổng hợp câc ỡ-acylfluconazol, chúng tôi thấy có nhiều điếm cần phải chú ý sau đđy:
> Nguyín liệu FLC phải được bảo quản trânh hút ẩm trong bình hút ẩm. Câc tâc nhđn acyl hoâ, dung môi vă chất xúc tâc NaH phải được lăm khan, trânh hút ẩm. Dụng cụ phải được lăm khô trước khi sử dụng.
> Phản ứng acyl hoâ lă phản ứng tỏa nhiệt cho nín câc tâc nhđn acyl