Nghiên cứu hệ protease trùn quế (perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ BÍCH TRÂM NGHIÊN CỨU HỆ PROTEASE TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus)TRONG QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2010 ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ BÍCH TRÂM NGHIÊN CỨU HỆ PROTEASE TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus)TRONG QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành:Hóa Sinh Học Mã số : 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG 2. PGS. TS HÀ THANH TOÀN Tp. Hồ Chí Minh – 2010 ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Phan Thị Bích Trâm iii LỜI CẢM ƠN Với tất cả tình cảm chân thành và sâu sắc nhất, tôi vô cùng biết ơn: PGS.TS. Phạm Thị Ánh Hồng ñã tận tình hướng dẫn, truyền thụ những tri thức khoa học và tạo ñiều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu ñể tôi hoàn thành luận án. PGS. TS. Hà Thanh Toàn, ñã tận tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận án. Th.S Dương Thị Hương Giang ñã chỉ bảo tận tình về chuyên môn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi về trang thiết bị cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. PGS. TS. Trần Thị Thanh Hiền ñã giúp tôi thiết lập công thức phối chế các loại thức ăn và tạo ñiều kiện thuận lợi về trang thiết bị, trại thực nghiệm ñể tôi hoàn thành phần ứng dụng của luận án. Ban Giám ðốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học - ðại Học Cần Thơ ñã tạo mọi ñiều kiện trang thiết bị ñể hoàn thành luận án. Quý Thầy Cô của Bộ môn Sinh Hóa, Trường ðại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM ñã tạo mọi ñiều kiện tốt cho tôi trong thời gian hoàn thành luận án. Cảm ơn các em Nguyễn Thị Xuân Dung, Phạm Thị Quỳnh Trâm, Tạ Duy Tiên, Châu Thị Loan và Châu Tài Tảo luôn sẵn lòng giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin gởi lời cảm ơn chân thành ñến Khoa Nông Nghiệp & Sinh học Ứng Dụng và Trường ðại Học Cần Thơ, các bạn bè ñồng nghiệp ñã hỗ trợ, ñộng viên và tạo ñiều kiện cho tôi trong thời gian học tập. Cám ơn những người thân trong gia ñình ñã luôn ñộng viên và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi vượt qua mọi khó khăn trong học tập và thực hiện luận án này. Phan Thị Bích Trâm iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt ix Danh mục các bảng x Danh mục các hình vẽ và ñồ thị xii MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1.Trùn quế 3 1.1.1 ðặc tính sinh lý học 3 1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng 4 1.2. Hệ protease và các nghiên cứu ứng dụng 5 1.2.1 Phân loại về protease 7 1.2.2 Cơ chế phản ứng của nhóm serine peptidase 9 1.2.3 Ứng dụng nhóm serrine protease trong quá trình thủy phân fibrin 11 1.2.3.1 Khái quát về phân tử fibrinogen và fibrin 11 1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong ñiều trị tim mạch 15 1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin 16 1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình thủy phân protein 18 1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình tự phân 18 1.2.4.2 Các phương pháp ñánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein . 20 1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tích protein hiện ñại 21 1.3.1 Thu nhận và xử lý mẫu 22 1.3.1.1 Nguyên liệu 22 1.3.1.2 Một số thiết bị nghiền mẫu và phá vỡ tế bào dùng trong 22 chiết tách mẫu 1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein 23 1.3.1.4 Tủa sơ bộ 25 1.3.2 Các kỹ thuật sắc ký thường sử dụng trong tinh sạch protein 25 v 1.3.3 Kỹ thuật ñiện di 27 1.3.3.1 Kỹ thuật ñiện di SDS-PAGE 27 1.3.3.2 ðiện di hai chiều 27 1.3.3.3 Phát hiện protein 28 1.3.4 Phân tích protein bằng phương pháp phổ khối lượng 29 1.3.4.1 Giới thiệu về phổ khối lượng trong phân tích peptide, protein 29 1.3.4.2 Các bước phân tích protein theo phương pháp phổ khối lượng 29 1.4 ðặc ñiểm sinh học và dinh dưỡng của ấu trùng tôm sú 32 1.4.1 Sự phát triển của ấu trùng tôm sú 32 1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường ñến quá trình sống của tôm sú 34 1.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng của tôm sú 35 1.4.4 Tình hình sử dụng nguồn thức ăn dinh dưỡng cho tôm 38 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 40 2.1 Vật liệu 40 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 40 2.1.2 Hóa chất 40 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 40 2.2 Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân 41 2.2.1.1 Xác ñịnh các thành phần nguyên liệu 41 2.2.1.2 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế 42 2.2.1.3 Khảo sát các yếu tố nhiệt ñộ, pH, ñiểm ñẳng ñiện và chất ức chế ảnh hưởng lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 43 2.2.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease trùn quế tự phân 43 2.2.2.1 Thu nhận bằng phương pháp tủa thích hợpdịch tự phân trùn quế 43 2.2.2.2 Tinh sạch protease trùn quế bằng kỹ thuật sắc ký, ñiện di 44 2.2.2.3 Khảo sát ñặc tính hóa học các protease sau khi tinh sạch 46 vi 2.2.3 Khảo sát các ñiều kiện tối ưu ñể thu nhận bột trùn quế tự phân 50 2.2.3.1 Xác ñịnh pH thích hợp cho quá trình tự phân 50 2.2.3.2 Xác ñịnh dung dịch thích hợp bổ sung cho quá trình tự phân 50 2.2.3.3 Xác ñịnh tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình tự phân 50 2.2.3.4 Xác ñịnh nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình tự phân 51 2.2.3.5 Xác ñịnh thời gian tự phân thích hợp 51 2.2.3.6 Khảo sát sự tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian 52 2.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế 53 tự phân 2.2.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá 54 khả năng sử dụng bột trùn quế tự phân 2.2.4.1 Phối chế thức ăn 54 2.2.4.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 54 tự phân lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú 2.2.4.3 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 55 tự phân lên tỷ lệ sống, tăng trưởng và chất lượng của hậu ấu trùng tôm sú 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân 57 3.1.1 Thành phần nguyên liệu 57 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế 58 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 58 3.1.4 Xác ñịnh ñiểm ñẳng ñiện protease trùn quế tự phân 59 3.1.5 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 60 3.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease 60 trùn quế tự phân 3.2.1 Thu nhận bằng phương pháp tủa thích hợpdịch tự phân trùn quế 60 3.2.2 Tinh sạch protease trùn quế tự phân bằng kỹ thuật sắc ký, ñiện di 62 vii 3.2.1.1 Sắc ký trao ñổi ion trên gel Unosphere Q 63 3.2.1.2 Sắc ký tương tác kỵ nước trên gel Phenyl sepharose 65 3.2.1.3 Sắc ký lọc gel trên cột Superose 12 66 3.2.3 Khảo sát ñặc tính hóa học các protease tinh sạch từ trùn quế tự phân 71 3.2.3.1 Tỷ lệ thu hồi mẫu và xác ñịnh hoạt tính các phân ñoạn protese 71 trên các cơ chất khác nhau 3.2.3.2 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease 73 3.2.3.3 Nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt 74 3.2.3.4 pH tối ưu và ñộ bền pH 75 3.2.3.5 ðộ bền các protease sau tinh sạch theo thời gian 76 3.2.3.6 Kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrinogen bằng ñiện di SDS-PAGE77 3.2.3.7 ðiểm ñẳng ñiện các protese sau tinh sạch 79 3.2.3.8 Phân tích các protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật 80 MALDI-TOF-TOF 3.3. Khảo sát các các ñiều kiện tối ưu ñể thu nhận bột trùn quế tự phân 83 3.3.1 Khảo sát pH thích hợp cho quá trình tự phân 83 3.3.2 Khảo sát loại dung dịch thích hợp cho quá trình tự phân 84 3.3.3 Khảo sát tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình tự phân 85 3.3.4 Khảo sát nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình tự phân 87 3.3.5 Khảo sát thời gian tự phân trùn quế thích hợp 89 3.3.6 Khảo sát sự tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian 91 3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế thủy phân 92 3.3.7.1 Khảo sát các chế ñộ sấy ảnh hưởng ñến chất lượng bột ñạm 92 3.3.7.2 Kết quả phân tích thành phần amino acid của bột trùn quế tự phân và trùn quế chưa thủy phân 93 3.3.7.3 Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật bột trùn quế tự phân 95 3.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá khả năng 95 sử dụng sản phẩm bột trùn quế thủy phân 3.4.1 Thành phần hóa học các loại thức ăn sử dụng ñể ương ấu trùng và hậu 95 viii ấu trùng tôm sú 3.4.2 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú 98 3.4.2.1 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 98 tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú 3.4.2.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 103 tỷ lệ sống và tăng trưởng của hậu ấu trùng tôm sú 3.4.3 So sánh hiệu quả kinh tế giữa thức ăn chế biến từ bột trùn quế thủy phân và thức ăn ngoại nhập 107 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 109 4.2 ðề nghị 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI 122 PHỤ LỤC 1 123 PHỤ LỤC 2 139 PHỤ LỤC 3 151 PHỤ LỤC 4 160 xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tựa hình Trang 1.1 Trùn quế (Perionyx excavatus) 3 1.2 Sơ ñồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 9 1.3 Hình dạng và gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 10 1.4 Mô hình phân tử fibrinogen 11 1.5 Cấu trúc phân tử fibrinogen 12 1.6 Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo fibrin 13 1.7 Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin 14 1.8 Quy trình lập bản ñồ phân tích protein theo phương pháp phổ 29 khối lượng 1.9 Vòng ñời của tôm sú 33 2.1 Sơ ñồ các bước thí nghiệm hệ protease trùn quế 49 3.1 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế theo thời gian tự thủy phân 58 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ, pH lên hoạt tính protease trùn quế 59 3.3 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế 60 3.4 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế tủa sơ bộ bằng AS bão hòa và aceton .61 3.5 Sắc ký ñồ trên cột DEAE-Cellulose dung dịch enzyme thô 63 3.6 Sắc ký trên cột Unosphere Q dung dịch enzyme thô 64 3.7 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột trao ñổi ion 64 3.8 Sắc ký ñồ tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose 65 3.9 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột tương tác kỵ nước 66 3.10 Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 các tiểu phân ñoạn 67 3.11 ðiện di ñồ SDS-PAGE các phân ñoạn sau lọc gel 68 3.12 Quy trình tinh sạch enzyme protease trùn quế 70 3.13 Hoạt tính thủy phân trên ñĩa fibrin các phân ñoạn enzyme tinh sạch 72 [...]... Long M c tiêu ñ tài Nghiên c u h protease trùn qu trong quá trình t phân và kh năng ng d ng c a chúng N i dung nghiên c u ñ tài: 1 Kh o sát các y u t nh hư ng ñ n ho t tính protease trùn qu t phân 2 Thu nh n, tinh s ch và nghiên c u các ñ c tính hóa h c c a h protease trong trùn qu t phân 3 Nghiên c u các y u t nh hư ng ñ n quá trình t phân trùn qu 4 Nuôi th nghi m u trùng và h u u trùng tôm sú ñ ñánh... n quá trình t phân trùn qu 85 3.23 Bi u ñ nh hư ng t l pha loãng trùn qu ñ n quá trình t phân 86 3.24 D ch trùn qu chưa th y phân 3.25 D ch trùn qu 3.26 Bi u ñ nh hư ng c a nhi t ñ ñ n quá trình t phân trùn qu 88 3.27 Bi u ñ nh hư ng c a th i gian ñ n hàm lư ng ñ m amine và ammoniac 89 các hàm lư ng protein khác nhau 87 các hàm lư ng protein khác nhau sau 24 gi t phân 87 trong quá trình t phân. .. quá trình t phân trùn qu 90 3.29 ði n di ñ ti n trình t phân protein trùn qu 91 3.30 nh hư ng c a nhi t ñ và th i gian ñ n quá trình t phân trùn qu 92 3.31 B t trùn qu t phân s y b ng các ch ñ khác nhau 93 3.32 Các lo i th c ăn Frippak, th c ăn ch bi n t b t trùn qu t phân 97 và chưa th y phân xv 3.33 Bi u ñ t l s ng c a tôm giai ño n u trùng 100 3.34 Bi u ñ chi u dài c a u trùng... trong quá trình t phân trùn qu 3.28 Bi u ñ nh hư ng c a th i gian ñ n quá trình t phân trùn qu 90 3.29 ði n di ñ ti n trình t phân protein trùn qu 91 3.30 nh hư ng c a nhi t ñ và th i gian ñ n quá trình t phân trùn qu 92 3.31 B t trùn qu t phân s y b ng các ch ñ khác nhau 93 3.32 Các lo i th c ăn Frippak, th c ăn ch bi n t b t trùn qu t phân 97 và chưa th y phân xv 3.33 Bi u ñ t l... t phân trùn qu 85 3.23 Bi u ñ nh hư ng t l pha loãng trùn qu ñ n quá trình t phân 86 3.24 D ch trùn qu chưa th y phân 3.25 D ch trùn qu 3.26 Bi u ñ nh hư ng c a nhi t ñ ñ n quá trình t phân trùn qu 88 3.27 Bi u ñ nh hư ng c a th i gian ñ n hàm lư ng ñ m amine và ammoniac 89 các hàm lư ng protein khác nhau 87 các hàm lư ng protein khác nhau sau 24 gi t phân 87 trong quá trình t phân trùn qu... t phân trùn qu Nh ng ñi m m i và ý nghĩa th c ti n c a lu n án : 1 Lu n án ñã nghiên c u hoàn ch nh h protease trùn qu (Perionyx excavatus) trong quá trình t phân t khâu chi t tách, tinh s ch, kh o sát ñ c ñi m hóa h c c a h enzyme này ñ n vi c so sánh trình t amino acid v i lumbrokinase t các loài trùn ñ t khác ñã ñư c nghiên c u trên th gi i 2 Nghiên c u t n d ng ngu n protease trùn qu ñ th y phân. .. và ñã ñư c ñưa vào nuôi công nghi p v i các quy mô v a và nh Các kh o sát ban ñ u cho th y h protease trong loài trùn qu nuôi công nghi p cũng có kh năng th y phân m nh fibrin, ch u nhi t và b n v i pH ki m cao, ñ c bi t có kh năng t phân gi i chính protein c a nó t o ra s n ph m giàu ñ m amin Vì v y ñ nâng cao giá tr s d ng t trùn ñ t nói chung và trùn qu nói riêng, ñ tài Nghiên c u h protease trùn. .. kho ng 30°C và ñ m thích h p trùn qu sinh trư ng và sinh s n r t nhanh Th c ăn c a trùn là các lo i phân gia súc, gia c m, rác ñang phân h y… trong ñó phân bò tươi và phân trâu tươi là món ăn thích h p nh t M i ngày trùn qu tiêu th lư ng th c ăn tương ñương v i tr ng lư ng cơ th c a nó [48] 1.1.2 Các nghiên c u ng d ng v trùn ñ t nói chung và trùn qu nói riêng Trong y h c c truy n Vi t Nam, trùn ñ t ñư... Nghiên c u h protease trùn qu trong quá trình t phân và kh năng ng d ng” ñư c ti n hành nh m làm cơ s khoa h c cho vi c s d ng trùn qu trong ñi u tr b nh và b i b s c kh e, ñ ng th i t o ra ch ph m b t ñ m nuôi u trùng tôm sú ñ nâng cao giá tr thương 2 m i c a loài trùn ñ t nuôi công nghi p này góp ph n m r ng và phát tri n mô hình nuôi trùn qu ph c v trong y dư c h c và nuôi tr ng th y s n, c i thi... y phân fibrinogen các protease 78 sau khi tinh s ch các th i ñi m khác nhau 3.18 ði n di hai chi u các phân ño n protease sau tinh s ch 79 3.19 So sánh trình t amino acid FIII-1 trùn qu v i Lumbrokinase 81 3.20 So sánh trình t amino acid FIII-2 trùn qu v i Lumbrokinase 81 3.21 Bi u ñ nh hư ng c a pH ñ n quá trình t phân trùn qu 84 3.22 Bi u ñ nh hư ng lo i dung d ch ñ n quá trình t phân