Nghiên cứu xác định độc tố ruột (enterotoxin) của staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm

TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ SEA, SEB TRONG THỰC PHẨM .... Kết quả ELISA trực tiếp kiểm tra khả năng phát hiện độc tố SEA và SEB của kháng thể cộng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

………

NGUYỄN ĐỖ PHÚC NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ: VI SINH VẬT HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS NGUYỄN THỊ KÊ PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC

TP Hồ Chí Minh – năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Thị Kê, PGS.TS Trần

Linh Thước, người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện tốt

nhất trong suốt thời gian em thực hiện luận án Thầy, Cô đã dạy bảo em rất nhiều điều trong khoa học cũng như trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Hùng Vân, giảng viên trường Đại học Y

Dược TP HCM đã tận tình giúp đỡ cho em rất nhiều về kiến thức lẫn những kinh nghiệm thực tế cho em thực hiện tốt luận án

Em rất cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Vệ sinh Y tế Công cộng TP HCM đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, kinh phí và thời gian giúp cho em thực hiện tốt luận

án này

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Khoa Sau Đại học - Trường

ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn các anh, chị Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử A – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi thực hiện tốt luận án này

Tôi xin cảm ơn các anh, chị Labo Vi sinh thực phẩm, Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực phía Nam – Viện Vệ sinh Y tế Công cộngTP.HCM đã hỗ trợ rất nhiều cho tôi trong quá trình làm luận án

Xin gửi những lời thân thương đến vợ và hai con tôi đã luôn luôn ở bên tôi và động viên tôi trong những lúc mệt nhọc, lo lắng trong công việc và trong thời gian thực hiện luận án

Cảm ơn bạn Đặng Vũ Bích Hạnh, giảng viên Trường ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc gia TP HCM, là người bạn cùng khóa NCS, đã luôn luôn hỗ trợ và động viên tôi trong thời gian thực hiện luận án

Và trên hết, con xin chân thành cảm ơn công ơn sinh thành, dạy dỗ và tảo tần nuôi

con khôn lớn của Cha, Mẹ ruột; Cha, Mẹ vợ đã hết lòng thương yêu và lo lắng cho gia

đình và các con của con và mọi người trong gia đình hai bên nội ngoại để cho con yên tâm học tập và công tác tốt

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM CỦA S AUREUS 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học chính 3

1.1.2 Các nhân tố độc lực 5

1.1.3 Ngộ độc thực phẩm do S aureus 7

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S AUREUS 10

1.2.1 Đặc điểm chung và phân loại 10

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE 12

1.2.3 Hoạt tính của độc tố ruột SE 13

1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS

TRONG THỰC PHẨM 13

1.3.1 Định lượng S aureus trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy 13

1.3.2 Phát hiện và định lượng S aureus trong thực phẩm bằng

phản ứng PCR 14

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG SE TRONG

THỰC PHẨM 17

1.5 XÁC ĐỊNH TIỀM NĂNG SINH ĐỘC TỐ CỦA CÁC CHỦNG S AUREUS BẰNG PHẢN ỨNG PCR DỰA VÀO GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ 21

1.6 PHƯƠNG PHÁP TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG

VÀO VIỆC PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH ELISA 21

1.6.1 Phương pháp tạo kháng thể đa dòng 21

1.6.2 Tinh chế và đánh dấu kháng thể 23

1.6.3 Các bước qui trình ELISA sandwich 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU 28

2.1.1 Dụng cụ 28

2.1.2 Thiết bị 28

2.1.3 Hóa chất 29

2.1.4 Sinh vật phẩm 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP 34

2.2.1 Chọn mẫu và địa điểm thu mẫu 34

2.2.2 Định lượng S aureus trên mẫu thực phẩm bằng phương pháp MPN 35

2.2.3 Kiểm tra độ sống S aureus bằng phương pháp hộp trãi 36

2.2.4 Phân tích định tính SE bằng bộ kit Tecra 36

2.2.5 Phát hiện gen sinh độc tố SE bằng phương pháp multiplex- PCR 38

2.2.6 Phương pháp gây miễm dịch trên thỏ và kiểm tra hiệu giá

kháng huyết thanh 39

2.2.7 Tinh chế kháng thể 41

2.2.8 Kiểm tra độ sạch kháng thể bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 42

2.2.9 Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford 42

2.2.10 Đánh dấu kháng thể kháng độc tố A và B với enzyme HRP 43

2.2.11 Phương pháp ELISA trực tiếp phát hiện SEA, SEB bằng

kháng thể cộng hợp HRP 44

2.2.12 Kiểm tra phản ứng chéo của kháng thể cộng hợp HRP 44

2.2.13 Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB

trong thực phẩm 45

2.2.14 Đánh giá qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA/SEB 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

3.1 KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM S AUREUS TRONG

THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ VÀ TỶ LỆ GÂY NGỘ ĐỘC BỞI S AUREUS TẠI TP HỒ CHÍ MINH 49

3.1.1 Khảo sát tình hình nhiễm S aureus trong thực phẩm đường phố

tại TP HCM 49

3.1.2 Tỷ lệ gây ngộ độc thực phẩm bởi S aureus trong một số vụ ngộ độc

thực phẩm tại TP HCM 50

3.2 XÁC ĐỊNH LOẠI ĐỘC TỐ RUỘT PHỔ BIẾN GÂY NGỘ ĐỘC

BỞI S.AUREUS 51

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh độc tố ruột của các chủng phân lập

trên môi trường TSGM và BHI 51

3.2.2 Xác định loại độc tố SE bằng phương pháp ELISA 53

3.2.3 Xác định loại độc tố SE phổ biến bằng phương pháp multiplex-PCR nhân bản sao các gen mã hóa độc tố 55

3.3 TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ SEA, SEB TRONG THỰC PHẨM 62

3.3.1 Gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh thỏ kháng SEA và SEB 62

3.3.2 Thu nhận và tinh chế kháng thể đa dòng kháng SEA và SEB 65

3.3.3 Tạo kháng thể cộng hợp với enzyme HRP 67

3.3.4 Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA và SEB 69

3.3.5 Đánh giá hiệu lực qui trình ELISA sandwich phát hiện SEAvà SEB 79

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐỂ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN 82

4.2 ĐỀ NGHỊ 82

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 83

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

APS Ammonium persulfate

BHI Beef Heart Infusion

BP Baird - Parker

CFA Complete Freund’s Adjuvant

CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

entA Gen mã hoá độc tố SEA

entB Gen mã hoá độc tố SEB

entC Gen mã hoá độc tố SEC

entD Gen mã hoá độc tố SED

entE Gen mã hoá độc tố SEE

ETA Exfoliative exotoxin A

ETB Exfoliative exotoxin B

Fc Fragment crystalizable

HRP Horse radish peroxidase

IFA Incomplete Freund’sadjuvant

Ig G Immunoglobulin (Kháng thể lớp G)

IL Interleukin

INF Interferon

kDa Kilodalton

MHC Major histocompatiblity complex

MPN Most probable number

MSA Mannitol salt agar

MWCO Molecular weight cut off

ODTB OD trung bình

OD Optical density

OPD o-Phenylenediamine

ORF Open reading frame

PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase chain reaction

TEMED Tetramethyl ethylene diamine

TMB Tetramethybenzidine

TSA Trypticase soy agar

TSGM Tecra staphylococcal growth medium

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái của S aureus 3

Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc S aureus trên môi trường Bair-Parker (A)

và môi trường Manitol salt agar (B) 4

Hình 1.3 Các dạng thử nghiệm ELISA phổ biến 20

Hình 1.4 Cơ chế hình thành Schiffbase trong phương pháp cộng hợp

kháng thể - enzyme thông qua nhóm NH 2 24

Hình 2.1 Thang phân tử lượng protein 33

Hình 2.2 Bố trí mẫu trong phương pháp khuếch tán trong gel 40

Hình 3.1 Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S aureus

trong môi trường TSGM 52

Hình 3.2 Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S aureus

trong môi trường BHI 53

Hình 3.3 Kết quả phân tích gen mã hóa độc tố SE ở các chủng S aureus

phân lập từ thực phẩm và mẫu chất nôn 59

Hình 3.4 Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEA với độc tố

SEA ở thỏ trước khi gây miễn dịch 63

Hình 3.5 Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEB với độc tố

SEB ở thỏ trước khi gây miễn dịch 64

Hình 3.6 Kiểm tra độ sạch của kháng thể qua các bước tinh chế bằng điện di

SDS-PAGE 65

Hình 3.7 Định lượng kháng thể bằng phương pháp Bradford 66

Hình 3.8 Kết quả ELISA trực tiếp kiểm tra khả năng phát hiện độc tố SEA và

SEB của kháng thể cộng hợp bằng phương pháp ELISA trực tiếp 68

Hình 3.9 Kết quả khảo sát loại dung dịch đệm phủ giếng trong qui trình

ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB 70

Hình 3.10 Kết quả khảo sát loại tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA

phát hiện SEA, SEB 71

Hình 3.11 Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để

phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEA 72

Hình 3.12 Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng

để phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 73

Hình 3.13 Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA

phát hiện SEA, SEB 74

Hình 3.14 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng nguyên trong qui trình

ELISA phát hiện SEA, SEB 75

Hình 3.15 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng thể cộng hợp trong

qui trình ELISA phát hiện SEA, SEB 76

Hình 3.16 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của qui trình ELISA sandwich

phát hiện SEA, SEB ở các nồng độ kháng nguyên là 16, 14, 12, 10,

8, 6, 4, 2 (ng/ml) 78

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các đặc tính chính của S aureus 5

Bảng 1.2 Qui định về mức cho phép hiện diện của S aureus trong thực

phẩm tại Việt Nam 7

Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa chính cuảa độc tố ruột 12

Bảng 2.1 Trình tự các mồi dùng để nhân bản sao các gen mã hóa độc tố SAE

bằng phản ứng PCR 34

Bảng 2.2 Bố trí thực hiện dựng đường chuẩn bằng phươg pháp Bradford 43

Bảng 2.3 Xử lý kết quả đánh giá qui trình ELISA sandwich so với qui trình

ELISA của TECRA 47

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm S aureus trong thực phẩm đường phố tại TP HCM 49

Bảng 3.2 Tỷ lệ ngộ độc do S aureus trong một số vụ ngộ độc thực phẩm

tại TP HCM 51

Bảng 3.3 Kết quả định loại độc tố SE được tổng hợp bởi 19 chủng S aureus

phân lập từ thực phẩm 54

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra khả năng nhân bản và độ đặc hiệu của 5 cặp mồi

nhân bản sao 5 gen mã hóa 5 loại độc tố SE bằng phản ứng

multiplex-PCR 56

Bảng 3.5 Kết quả kiểm chứng loại độc tố được sản sinh bởi các chủng S aureus

bằng phản ứng multiplex-PCR nhân bản sao các gen mã hóa độc tố SE 58

Bảng 3.6 So sánh kết quả xác định loại độc tố tạo ra bởi các chủng S aureus

bằng phương pháp ELISA và kết quả xác định gen mã hóa độc tố

bằng phản ứng multiplex-PCR 60

Bảng 3.7 Kiểm tra sự hình thành kháng thể kháng SEA, SEB trong huyết thanh

thỏ được gây đáp ứng miễn dịch xác định bằng phương pháp khuếch

tán trên gel 62

Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra hoạt tính của kháng thể kháng SEA, kháng thể

kháng SEB cộng hợp HRP bằng phản ứng ELISA trực tiếp 67

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra phản ứng chéo giữa kháng thể kháng SEA cộng hợp

với SEA với SEB và của kháng thể kháng SEB cộng hợp với SEA 68

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát loại dung dịch phủ giếng 69

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát lọai tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA

phát hiện SEA, SEB 71

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để phủ giếng

trong qui trình ELISA phát hiện SEA 71

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng để phủ

giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 72

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA

phát hiện SEA, SEB.……… 74

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng nguyên trong qui trình

ELISA phát hiện SEA, SEB 75

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng cộng hợp trong qui trình

ELISA phát hiện SEA, SEB 76

Bảng 3.17 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của qui trình ELISA sandwich

phát hiện SEA, SEB 78 Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa qui trình ELISA sandwich

phát hiện SEA và qui trình ELISA của TECRA 79 Bảng 3.19 Kết quả đánh giá các thông số qui trình ELISA sandwich phát hiện

độc tố SEA 80 Bảng 3.20 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa qui trình ELISA sandwich

phát hiện SEB và qui trình ELISA của TECRA 80 Bảng 3.21 Kết quả đánh giá các thông số kỹ thuật tương đối của qui trình

ELISA sandwich phát hiện độc tố SEB 81

MỞ ĐẦU

An toàn Vệ sinh thực phẩm là vấn đề được nhiều quốc gia trên thế giới rất quan tâm Việc sử dụng thực phẩm không an toàn là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm lây qua thực phẩm Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm (Bộ Y tế) và Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm tại Việt Nam có khoảng 3 triệu người bị nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD Mặt khác, theo

số liệu của Bộ Y tế, trong các năm 2000-2007 cả nước có 1.358 vụ ngộ độc thực phẩm ở bếp ăn tập thể với 34.411 người bị ngộ độc và 379 người tử vong (Hội thảo

về Vệ sinh an toàn thực phẩm ngày 23/10/2007)

Hiện nay phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm là phương pháp nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa và miễn dịch Các phương pháp mới như PCR, ELISA đang được nghiên cứu ứng dụng trong phân tích vi sinh vật trong thực phẩm nhằm giúp cho công tác thanh tra giám sát thực phẩm hoặc điều tra nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật được nhanh chóng hơn

S aureus là một trong những vi khuẩn gây ra ô nhiễm thực phẩm và là nguyên

nhân thường gặp trong ngộ độc thực phẩm Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm 51% các vụ ngộ độc trong 6 tháng đầu năm 2007 có nguyên nhân là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật, 8% do hóa chất, và 27% là do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên Trong các vụ ngộ độc tập thể được xác định nguyên nhân là do vi sinh vật thì

S aureus chiếm 20-30%, đứng thứ hai sau Salmonella [65] Ngộ độc thực phẩm do

S aureus được gây ra bởi độc tố ruột của vi khuẩn này [64]

Để xác định nhanh S aureus có liên quan đến một vụ ngộ độc hay không phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt, nhân bản sao trình tự gen nuc mã hóa cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S aureus có thể được sử dụng để thay cho phương pháp nuôi cấy Tuy nhiên để kết luận S aureus là nguyên nhân gây ngộ

độc thực phẩm thì bên cạnh việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn cần phải xác định sự hiện diện của độc tố ruột của vi khuẩn

Xét nghiệm độc tố ruột của S aureus trong thực phẩm có thể được thực hiện

một cách gián tiếp thông qua việc xác định sự hiện diện của gen mã hóa độc tố trong vi khuẩn có trong thực phẩm bằng phản ứng PCR Mặt khác, độc tố ruột của

S aureus trong thực phẩm có thể được xác định một cách trực tiếp bằng phản ứng

ELISA sử dụng kháng thể kháng độc tố này Ở Việt Nam S aureus đã được các cơ

quan quản lý nhà nước xác định là một trong các chỉ tiêu vi sinh vật cần được kiểm soát trong thực phẩm Tuy nhiên, nguyên nhân trực tiếp gây ngộ độc thực phẩm do

S aureus là độc tố ruột của vi khuẩn này vẫn chưa được các cơ quan quản lý quan

tâm đúng mức Để góp phần xây dựng các công cụ phân tích hữu hiệu dùng cho

việc xét nghiệm, giám sát độc tố ruột do S aureus trong thực phẩm, luận án “ Nghiên cứu xác định độc tố ruột (enterotoxin) của S aureus gây ngộ độc thực phẩm” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định loại độc tố S aureus gây ngộ độc

phổ biến tại Việt Nam, xây dựng qui trình multiplex-PCR phát hiện các gen sinh độc tố và xây dựng qui trình ELISA phát hiện các độc tố này trong thực phẩm, góp phần xây dựng các công cụ phân tích hữu hiệu dùng cho việc xét nghiệm, giám sát

độc tố ruột do S aureus trong thực phẩm ở nước ta

Nội dung nghiên cứu của luận án

Nội dung của luận án tập trung và giới hạn vào các vấn đề sau:

1- Khảo sát tình hình nhiễm S.aureus trong thực phẩm đường phố và tỷ lệ gây ngộ độc bởi S aureus tại thành phố Hồ Chí Minh

2- Xác định loại độc tố ruột phổ biến gây ngộ độc bởi S.aureus bằng phương

pháp ELISA và phương pháp multiplex-PCR

3- Tạo kháng thể và xây dựng qui trình ELISA phát hiện độc tố phổ biến trong thực phẩm

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY NGỘ ĐỘC

THỰC PHẨM CỦA S AUREUS

1.1.1 Đặc điểm sinh học chính

S aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây ngộ độc

thực phẩm S aureus thuộc giống Staphylococcus, là vi khuẩn hình cầu, không di

động, gram dương, đường kính 0,5 - 1,5µm, tế bào xếp thành hình chùm nho (Hình 1.1), không di động, có vách tế bào kháng lysozyme và nhạy với lysotaphin

S aureus có tính hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, tăng trưởng được trong khoảng

nhiệt độ rất rộng, từ 7 - 48oC, khoảng nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC; tăng trưởng được trong khoảng pH 4,2 - 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,5; có tính chịu mặn tăng trưởng được trong môi trường chứa trên 15% NaCl; chịu được áp suất thẩm thấu cao của 33-55%

saccharose nhưng bị ức chế ở 60% S aureus phân bố rộng trong tự nhiên được

phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng Vi khuẩn này còn hiện diện trong không khí, bụi, rất nhạy với kháng sinh và chất diệt khuẩn

Mặt khác S aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt khi bị xử lý ở 60oC từ 2 – 50 phút Vi khuẩn này có tính cạnh tranh yếu, dễ bị vi sinh vật khác ức chế [19]

Hình 1.1 Hình thái của S aureus

A Dưới kính hiển vi điện tử; B Dưới kính hiểm vi quang học

Về đặc điểm sinh hóa, S aureus có men catalase, cho phản ứng đông huyết

tương dương tính nhờ enzyme coagulase Phản ứng đông huyết tương là đặc trưng

để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác S aureus cho phản ứng DNAse,

phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose, nhạy với novobicine[4]. Một số chủng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng, thường

thấy rõ sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng [25] Trên môi trường Baird

Parker, khuẩn lạc S aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 - 1,5mm,

quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 - 5mm Trên môi trường Manitol salt agar

(môi trường Chapman), khuẩn lạc S aureus có dạng tròn, bờ đều và lồi, màu vàng

nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.2.)

Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc S aureus trên môi trường Bair-Parker (A) và môi

trường Chapman (B)

Đa số các chủng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều độc tố ruột

(enterotoxin) trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35 - 37oC [4].Các đặc tính sinh hóa chính của S aureus phân biệt

với Staphylococcus khác và Micrococcus được tổng hợp trên Bảng 1.1

S aureus có thể gây nhiễm trùng, tạo mủ ở những vết xây xước trên bề mặt

da, gây nhiều bệnh truyền nhiễm như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm

màng não, nhiễm trùng tiểu, viêm xương tủy, viêm màng trong tim S aureus cũng

là nguyên nhân gây nhiễm trùng vết mổ và nhiễm trùng dụng cụ y khoa Mặt khác

S aureus còn gây ngộ độc thực phẩm bởi độc tố ruột enterotoxin, và gây hội chứng

shock do siêu kháng nguyên trong máu [62] Độc lực củaS aureus được hình thành

do tác dụng phối hợp của nhiều nhân tố độc lực khác nhau sau đây

* Staphylococcus aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:

- Protein nhận diện và bám dính

Bề mặt tế bào S aureus có adhesin protein với vai trò nhận diện và bám

dính, tạo protein gắn kết fibrinogen và fibrinetin làm kích thích sự kết dính các khối

máu và mô bị chấn thương Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ở

những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp

- Các nhân tố xâm nhiễm

S aureus tạo ra nhiều protein giúp vi khuẩn xâm nhập và lan nhiễm trong vật

chủ, được gọi tên chung là invasins, là bộ phận đóng vai trò quan trọng trong độc

lực của vi khuẩn này Sau đây là các invasins chính của S aureus

+ Hemolysin: là độc tố tế bào có hoạt tính làm tan màng hồng cầu Ở S

aureus độc tố này gồm 3 loại: (i) α-Hemolysin: là độc tố tan màng mạnh nhất tác

dụng lên tiểu cầu và bạch cầu ở người; (ii) β-Hemolysin có tác dụng phân hủy màng

giàu lipid, thường được dùng làm thử nghiệm tan hồng cầu cừu; (iii) δ-hemolysin có

hoạt tính làm tan màng một số tế bào khác nhau

+ Hyaluronidase: phân huỷ chất gian bào ở tế bào chủ giúp S aureus lan

nhiễm các vùng xung quanh

+ Catalase: thủy phân hydrogen peroxide và ức chế sự hình thành các gốc tự

do bởi hệ thống myeloperoxidase trong tế bào chủ

+ Coagulase: được tiết ra khỏi tế bào S aureus gắn được với prothrombin

hình thành phức hợp staphylothrombin làm đông fibrinogen trong máu, giúp vi

khuẩn tránh được sự tấn công của đại thực bào

+ Staphylokinase: có hoạt tính phân giải fibrin giúp cho S aureus lan nhiễm

trong vật chủ

+ Các enzyme ngoại bào khác: Tnase là enzyme kháng nhiệt, xúc tác sự

hydrogen hóa DNA và RNA của tế bào chủ; DNase, protease, lipase thủy phân các

cơ chất đại phân tử để cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn; FAME (fatty acid

modifying enzyme) xúc tác phản ứng biến đổi giúp kéo dài sự sống của S aureus

- Các nhân tố chống lại sự phòng vệ của vật chủ

Ngoài các protein có vai trò tăng cường sự xâm nhiễm trong vật chủ

S aureus còn tạo ra các protein giúp vi khuẩn chống lại hệ thống phòng vệ của vật

chủ làm tăng độc lực của vi khuẩn, bao gồm:

+ Microcapsule: giúp vi khuẩn chống lại sự thực bào của vật chủ

+ Protein A: protein bề mặt có thể gắn phân tử IgG qua vùng Fc, cản trở

phản ứng opsonin hóa và sự thực bào của hệ thống phòng vệ ở vật chủ

+ Leukocidin: có hoạt tính phân hủy màng tế bào bạch cầu yếu hơn

α-hemolysin, chỉ có ở 2% các chủng S aureus được phân lập nhưng có đến gần

90% các chủng phân lập từ vết xước trên da

+ Siêu kháng nguyên (superantigen): S aureus tiết ra hai độc tố có hoạt tính

siêu kháng nguyên là TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) gây hội chứng sốc

nhiễm độc tụ cầu (TSS) và Enterotoxin gây nôn mửa, tiêu chảy, thường xảy ra ở các

vụ ngộ độc thực phẩm Hai siêu kháng nguyên này sẽ kích hoạt 1/5 tế bào T không

chuyên biệt vốn không nhận được những kháng nguyên thông thường gây ra hội

chứng sốc do S aureus [62]

1.1.3 Ngộ độc thực phẩm do S aureus

a Triệu chứng ngộ độc thường gặp

S aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực

phẩm ở nhiều nước sau Salmonella và Clostridium perfringens [31] [46] Triệu

chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do S aureus là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng,

có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết

áp Các triệu chứng này xuất hiện khoảng 3 - 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm, độ nhạy với độc tố và sức khỏe của từng người Thông thường, các triệu chứng ngộ độc chỉ kéo dài khoảng 6 - 8 giờ và hết bệnh sau 1 - 2 ngày [4]

b Ngộ độc do S aureus trên thế giới

Trên thế giới, vụ ngộ độc lớn đầu tiên do S.aureus xảy ra vào năm 1884 ở

Michigan (Mỹ) do phô mai Các vụ ngộ độc lớn sau này được ghi nhận do thịt bò, khô bò bị nhiễm, sữa, bánh kem,… [12]

Tại Mỹ, S aureus gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm, gây

thiệt hại khoảng 1,5 tỷ đô la hằng năm; trong đó độc tố ruột A (SEA) chiếm 77,8%, độc tố D (SED) 37,5% và độc tố B (SEB) 10% [46]

Ở Nhật Bản, năm 2000, ngộ độc sữa do độc tố A (SEA) của S aureus đã gây

ngộ độc cho 14.780 người lớn [42] Số liệu thống kê cho thấy trong các năm

1994-1998 số trường hợp ngộ độc do S aureus chiếm 3,1 - 11,9% các vụ ngộ độc thực

phẩm do vi khuẩn tại Nhật Bản

Ở Tây Ban Nha, năm 2002, đã xảy ra ba vụ ngộ độc do dùng thực phẩm bị

nhiễm độc tố A (SEA) hoặc độc tố C (SEC) của S aureus

Ở Đài Loan, S aureus là nguyên nhân gây 30% các trường hợp ngộ độc

trong thời gian từ 1986 đến năm 1995

Hầu hết các vụ ngộ độc liên quan đến S aureus là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt S aureus thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ

tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản thực phẩm không

phù hợp sẽ giúp vi khuẩn tăng nhanh số lượng và tạo ra độc tố (vi khuẩn tăng

trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 7 - 48oC) Sự hiện diện độc tố ruột của S

aureus không gây ảnh hưởng đến đặc tính cảm quan của thực phẩm nên khó được

phát hiện [53]

c Tình hình ô nhiễm và gây ngộ độc thực phẩm do S aureus tại Việt Nam

Tại Việt Nam ngộ độc thực phẩm đang rất được xã hội quan tâm vì sự bùng nổ

của việc tiêu thụ thức ăn nhanh, thức ăn đông lạnh và tình trạng các hàng quán

không hợp vệ sinh Trong số những vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thì

S aureus, Salmonella và E coli là những tác nhân chiếm đa số Kết quả khảo sát

tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ tại

TP.HCM trong vài năm gần đây cho thấy tỷ lệ nhiễm S aureus là rất cao 53% ở các

mẫu bánh mì thịt nguội, 90% các mẫu thịt quay đã khảo sát [2] [3] Năm 2006, đã

ghi nhận được vụ ngộ độc thực phẩm của 105 người tại Nha Trang do thức ăn

nhiễm độc tố ruột của S aureus Cùng năm này đã ghi nhận vụ ngộ độc ở nhà trẻ tại

Huyện Phú Quốc, Kiên Giang do yaourt bị nhiễm độc tố A (SEA) của S aureus

Tháng 12/2007 đã ghi nhận được 2 vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus tại

một số trường tiểu học, mầm non với trên 100 trẻ em bị ngộ độc Hiện nay

S aureus đã được xem là một chỉ tiêu vi sinh vật cần được kiểm soát trong thực

phẩm bởi các cơ quan chức năng tại Việt Nam Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực

phẩm của nước ta qui định mật độ S aureus được phép hiện diện trong thực phẩm

thay đổi tùy theo loại thực phẩm (0, 3, 10, 102 CFU/g hoặc ml thực phẩm) và được

trình bày ở Bảng 1.2 Tuy nhiên, hiện nay chưa có tiêu chuẩn kiểm soát độc tố ruột

SE trong thực phẩm tại Việt Nam Các công trình khác nghiên cứu về độc tố ruột

và sản xuất bộ ELISA để xác định độc tố ruột cũng chỉ giới hạn phát hiện SEA,

trong đó các thành phần bộ kít ELISA đều nhập ngoại do nhóm tác giả Lê Quang Hà

và CS (2009) của Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu

Bảng 1.2 Qui định về mức cho phép hiện diện của S aureus trong thực phẩm tại

Việt Nam

0CFU/g 0CFU/g

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ - có xử lý nhiệt trước sử dụng

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ - không qua

Thịt và các sản phẩm

từ thịt

Thịt tươi, Thịt đông lạnh TCVN 7046:2002

TCVN 7047:2002 102CFU/g 102CFU/g Thịt chế biến không qua xử

Rau quả muối - rau

Sữa - các sản phẩm

từ sữa

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam; QĐ-BYT: Quyết định của Bộ Y tế

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S AUREUS

1.2.1 Đặc điểm chung và phân loại

Độc tố ruột của S aureus hay Staphylococcal enterotoxin (SE) là những

protein có trọng lượng phân tử 25 - 29 kDa, chứa vòng cystein bên trong phân tử giúp ổn định cấu trúc phân tử và có thể có vai trò trong sự kháng protease của các độc tố này Các SE dễ tan trong nước và nước muối, có điểm đẳng điện pI là 7 - 8,6, (SEG, SEH có pI là 5,6 và 5,7) [54]

SE chứa nhiều lysine, axít aspartic, axít glutamic và tyrosine, khá bền với hầu hết protease nên không bị thủy phân bởi các protease trong đường tiêu hóa Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain [41] Mặt khác, SE có tính bền nhiệt không bị mất hoạt tính ở 100oC trong 30 phút [4], thậm chí ở 121oC trong 28 phút Tuy nhiên tính bền nhiệt này của SE phụ thuộc vào môi trường, loại thực phẩm, độ pH, nồng độ muối và nhiều yếu tố khác Ở nồng độ thấp trong thực phẩm thì SE có thể bị bất hoạt trong điều kiện đóng hộp và xử lý nhiệt để khử trùng đồ hộp [41]

Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng Năm 1962, việc dựa vào tính kháng nguyên các độc tố SE được chia thành 5 loại theo mẫu tự la tinh là độc tố A (SEA), B (SEB), C (SEC), D (SED) và E (SEE)

[53] Trong đó, SEC lại được chia thành SEC1, SEC2, SEC3 Sau này, nhiều SE mới cùng với các gen tương ứng đã được công bố và được đặt tên từ SEG đến SER và SEU [38] Tuy nhiên, sự liên quan giữa các SE mới này trong ngộ độc thực phẩm thì chưa rõ Do vậy, hiện nay hầu hết các bộ bộ kít thương mại chỉ được phát triển đối với 5 độc tố SE là SEA, SEB, SEC, SED và SEE, chính là các độc tố thường

gặp nhất trong ngộ độc thực phẩm do S aureus [21] [38] Mặt khác, có khoảng 5%

các vụ ngộ độc do S.aureus được cho là có nguyên nhân bởi các độc tố chưa được

xác định [52]

- Độc tố A (SEA)

Độc tố SEA được mã hóa bởi gen entA được mang bởi một bacteriophage

ôn hoà trong vi khuẩn [14].Gen entA mã hóa cho pre-SEA chứa 257 acid amin Khi

- Độc tố B (SEB)

Độc tố SEB chứa 267 acid amin, trọng lượng phân tử 31,4 kDa được mã hóa

bởi gen entB trên DNA của vi khuẩn hoặc được mang bởi plasmid [55] [56]

- Độc tố C (SEC)

Độc tố SEC gồm 3 loại SEC1, SEC2 và SEC3 có trình tự acid amin rất giống nhau SEC1 chỉ khác SEC3 bởi 9 acid amin và SEC2 khác SEC3 4 acid amin Gen

entC3 có chiều dài 801bp mã hóa pre-SEC3 chứa 267 acid amin với một peptid tín

hiệu 27 acid amin ở đầu N Sự cắt loại bỏ peptid tín hiệu này khi được tiết ra khỏi tế bào tạo thành SEC3 với 240 acid amin có hoạt tính[32]

+ Độc tố SEG: chứa 233 acid amin được tạo thành từ pre SEG chứa 258 acid

amin có tính tương đồng cao với SEB, SEC và SSA[44]

+ Độc tố SEH: mới được phát hiện gần đây có trọng lượng phân tử 27 kDa không có phản ứng chéo miễn dịch với các SE xác định trước đây [60]

+ Độc tố SEI: là loại độc tố gồm 218 acid amin được hình thành từ preSEI,

chứa 242 acid amin, có tính tương đồng thấp với các SE khác [44]

+ Độc tố SEJ: có 245 acid amin có trình tự tương đồng đáng kể với SEA, SEE

và SED (64 - 66%) Bảng 1.3 tổng hợp các đặc tính sinh hóa chính của các độc tố

SE

Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa chính của các độc tố ruột

Chiều dài độc

tố (acid amin)

Trọng lượng phân tử (Da)

Điểm đẳng điện

Tài liệu tham khảo

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE

Mặc dù SE có thể được tạo ra ở khoảng điều kiện rất rộng nhưng cũng bị ảnh

hưởng bởi một số yếu tố môi trường Thông thường, khi S aureus tăng trưởng đến

mức 106 CFU/g thực phẩm thì có thể tạo SE [58] Các chủng S aureus khác nhau

có nhu cầu khác nhau về acid amin cho sự tăng trưởng và tạo độc tố Valine cần cho

sự tăng trưởng của S aureus; arginine và cystine cần cho sự tăng trưởng và sinh độc

tố; các acid amin khác thì có nhu cầu khác nhau tùy từng chủng [41] Điều kiện thích hợp nhất để tạo độc tố SE là pH trung tính Khi trị số pH giảm và độ ẩm thấp (dưới 0,86) thì sự tạo SE bị giảm hay bị ức chế [51] Tương tự, pH kiềm cũng làm giảm khả năng tạo độc tố SEB, SEC và SED Sự tạo SE cũng bị ức chế bởi dịch chiết từ lựu[18] Glucose cũng có tác dụng ức chế sự tạo độc tố SEB và SEC do sự biến dưỡng glucose làm giảm pH [41] Nồng độ muối cao (trên 12%) trong thực phẩm cũng làm ức chế sự tạo độc tố

1.2.3 Hoạt tính của độc tố ruột SE

a Hoạt tính siêu kháng nguyên

Phân tử SE có thể tác động trực tiếp lên chuỗi β của thụ thể tế bào T và phức hợp tương hợp mô MHC-2 không thông qua sự trình diện kháng nguyên APC và hoạt hóa tế bào này Ở người, tỷ lệ tế bào T được hoạt hóa khi bị nhiễm SE có thể lên đến 2 – 20% của các tế bào T Các tế bào T được hoạt hóa này tiết ra một lượng lớn bất thường các cytokine và thường gây sốt Các protein có đặc tính tương tự như SE được gọi là siêu kháng nguyên (superantigen) hay độc tố siêu kháng nguyên gây sốt (pyrogenic toxin superantigen, PTSA) [41]

b Hoạt tính gây nôn

Hoạt tính gây nôn chưa được hiểu rõ, người ta cho rằng độc tố SE có lẽ tác động trực tiếp lên biểu mô của đường tiêu hoá và lên thần kinh phế vị gây kích thích trung tâm nôn gây nôn mửa là một trong các triệu chứng ngộ độc của SE.Liều gây ngộ độc do SE khoảng 0,1µg, thay đổi tùy độ mẫn cảm của từng người Họat tính gây nôn được cho là có liên quan đến vòng cystine trong phân tử các SE [41]

1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS TRONG

Cân chính xác 25g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị hoặc hút chính xác 25ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào chai dural chứa sẵn 225ml nước đệm phosphat (hay 90ml nước đệm phosphat) Lắc đều 2-3 phút thì thu được dung dịch mẫu thử

có độ pha loãng 10-1 Mẫu được pha loãng tiếp tục 10-2, 10-3, …tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích mẫu xác định lên đĩa thạch Baird

Parker, thạch Chapman hoặc thạch máu sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc/ đĩa

Sau 48 giờ, khuẩn lạc S aureus trên môi trường Baid-Parker có đường kính

khoảng 0,5 - 1mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 1 - 2mm quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc của một số dòng có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên[54]

Trên môi trường Chapman khuẩn lạc lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm (do

sử dụng đường manitol màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng), đường kính khuẩn lạc 0,1 - 1mm; sau 48 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có màu vàng đậm

Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ, S aureus cho khuẩn lạc bóng

loáng, đục lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 - 2mm Hầu hết

S.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này

Chọn những khuẩn lạc đặc trưng để thử phản ứng coagulase, và dựa vào tỷ lệ các khuẩn lạc cho kết qua coagulase (+), tính kết quả

b Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp này được dùng để định lượng S aureus trong mẫu có mật độ

S aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng

phương pháp đếm khuẩn lạc Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ pha loãng liên tiếp Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể

sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng)

Trên cơ sở các ống cho kết quả dương tính trong ống môi trường canh cấy chọn lọc và khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker hoặc Chapman có phản ứng coagulase (+) và tính kết quả dựa vào bảng MPN 9 ống hoặc 15 ống để

suy ra mật độ S aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml) [54]

1.3.2 Phát hiện và định lượng S aureus trong thực phẩm bằng phản ứng PCR

Các tiến bộ về khoa học và công nghệ ngày nay đã giúp cho việc xét nghiệm

vi sinh vật trở nên nhanh, tiện, nhạy và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương

pháp nuôi cấy Tại Việt Nam, việc phát hiện S aureus trong thực phẩm được thực

hiện chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là thời gian phân tích kéo dài, phải mất 3 - 4 ngày mới cho kết

quả chính thức Năm 2006, phương pháp PCR để phát hiện S aureus trong thực

phẩm đã được thiết lập tại Việt Nam trong báo cáo nghiệm thu đề tài Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, KC.04-30, Bộ Khoa học và Công nghệ, 2006 của tác giả Trần Linh Thước[5]dựa trên việc nhân bản sao

đoạn gen nuc mã hóa cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S aureus với cặp mồi chuyên biệt cho sản phẩm PCR có kích thước là 276bp Do S aureus

thường hiện diện với mật độ thấp trong thực phẩm, vì vậy để làm tăng độ nhạy phát hiện, trước khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR cần phải qua bước tăng sinh trong

môi trường không chọn lọc Qui trình phát hiện S.aureus trong thực phẩm bằng

phản ứng PCR được tiến hành qua các bước sau:

- Đồng nhất và tăng sinh 25g mẫu 225ml môi trường Saline Peptone Water

(SPW) hoặc Trytone Soya Broth (TSB) bằng máy dập mẫu Stomacher trong 30 giây, ủ 37oC trong 24 giờ

- 1ml dịch canh khuẩn sau tăng sinh được ly tâm ở để thu sinh khối, rửa

bằng nước cất vô trùng, huyền phù hóa với 1ml nước cất và đun sôi cách thủy trong

10 phút Dịch đun sôi được ly tâm để thu dịch nổi chứa DNA mẫu

- Phản ứng PCR được thực hiện trong dung tích 25μl gồm các thành phần là 2,5μl đệm dùng cho phản ứng PCR (10X); 2,5μl dNTP 100μM; 1,0μl Taq polymerase 1U; 1,0μl mồi 1 (5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’) 6pM, 1,0μl mồi 2 (5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’) 6pM; 3,0μl DNA khuôn; 14,0μl nước cất Mẫu được ủ trong máy điều nhiệt theo chu kỳ ở 95oC trong

5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi DNA có trong mẫu Phản ứng PCR gồm

35 chu kỳ gồm các bước như sau: (i) Biến tính ban đầu ở 95oC trong 5 phút; 35 chu

kỳ gồm ba bước: biến tính ở 94oC trong 30 giây, bắt cặp ở 55oC trong 40 giây, kéo

dài ở 72oC trong 45 giây; (iii) ủ ở 72oC trong 10 phút và sau đó ở 30oC trong 15

phút

- Đọc kết quả: sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2%

ở điện thế 100V trong 45 phút và nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide; sau

đó quan sát kết quả trên hộp đèn UV có bước sóng 312nm, nếu xuất hiện 1 vạch

tương đương với 276bp thì kết luận là có S aureus

Đây là một phương pháp nhanh, có độ đặc hiệu cao cho phép phát hiện

S aureus ở mức 10CFU/25g thực phẩm sau 24 giờ tăng sinh, cho kết quả sau 28

giờ, ngắn hơn rất nhiều lần so với việc phát hiện bằng phương pháp truyền thống Qui trình PCR này đã được tiến hành đánh giá hiệu lực theo phương pháp được công nhận rộng rãi trên thế giới và cho thấy hoàn toàn có thể thay thế phương pháp

nuôi cấy để phát hiện S aureus trong thực phẩm Qui trình PCR xét nghiệm S

aureus trong thực phẩm này có thể được ứng dụng để xét nghiệm định tính

(0CFU/g) hoặc định lượng (≤ 10CFU/g, ≤ 102CFU/g) tùy thuộc vào tiêu chuẩn kiểm soát đối với từng phân nhóm thực phẩm theo qui định của cơ quan quản lý nhà nước Việc xét nghiệm định tính và xét nghiệm định lượng chỉ khác nhau ở bước đồng nhất mẫu và pha loãng trước khi tăng sinh Các bước còn lại của hai qui trình xét nghiệm này là như nhau Sau khi đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Trytone Soya Broth (TSB)

- Trường hợp xét nghiệm định tính (0CFU/g): hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 24 giờ trước khi thực hiện phản

ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S aureus ít nhất

1CFU/g (không đạt tiêu chuẩn)

- Trường hợp xét nghiệm định lượng:

+ Xét nghiệm theo tiêu chuẩn ≤10CFU/g thực phẩm: hút 10ml dịch đồng

nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 10 lần bằng cách trộn với 90ml môi trường TSB Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha loãng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 24 giờ trước khi

thực hiện phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 10CFU/g (không đạt tiêu chuẩn)

+ Xét nghiệm theo tiêu chuẩn ≤102CFU/g thực phẩm: hút 1ml dịch đồng nhất (tương đương 0,1g mẫu) pha loãng 102 lần bằng cách trộn với 99ml môi trường TSB Nếu mẫu chứa 100CFU/g thì 100ml dịch pha loãng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 24 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên

102CFU/g (không đạt tiêu chuẩn)

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ RUỘT SE TRONG THỰC PHẨM

Việc phát hiện độc tố ruột SE trong thực phẩm cần những phương pháp nhạy với lượng thấp, ít hơn 1ng/g thực phẩm và lượng độc tố SE gây ngộ độc thực phẩm thay đổi từ 1 đến 50 ng/g [54]

Các phương pháp để phát hiện và định lượng độc tố thường được sử dụng hiện nay là các phương pháp miễn dịch bao gồm phương pháp khuyếch tán trên gel (gel diffusion), phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immunoassay :RIA), phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination), ELFA (enzyme-linked fluorescent immunoassay), phương pháp ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)

Sau đây là một số phương pháp phổ biến được sử dụng để phát hiện độc tố SE

của S aureus

a Phương pháp khuếch tán trong thạch

Trong phương pháp ống thạch khuếch tán, kháng thể kháng SE được đặt ở đáy của ống thạch và dịch xét nghiệm được cho vào phần trên đỉnh của ống thạch Phản ứng giữa độc tố và kháng thể làm xuất hiện vạch ngưng kết có chiều dài tăng theo thời gian khi độc tố khuyếch tán vào trong gel Phương pháp này thường được

sử dụng làm phương pháp sàng lọc định tính để kiểm tra những chủng S aureus tạo

độc tố Đây là phương pháp miễn dịch được sử dụng trong nhiều năm trước Sử dụng microslide là phương pháp nhạy nhất trong các phương pháp khuếch tán trong

thạch (50 – 100ng/ml), tuy nhiên, cần có nhiều kinh nghiệm để giải thích kết quả Mặt dù vậy, độ nhạy của phương pháp khuếch tán trên gel không đáp ứng được yêu cầu phát hiện được liều gây độc của SE trong thực phẩm [54].

b Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immunoassay, RIA)

Miễn dịch phóng xạ là phương pháp đủ nhạy đầu tiên được sử dụng để phát hiện độc tố SE trong thực phẩm Trong phương pháp này, độc tố SE được đánh dấu bằng 125I Dịch chiết thực phẩm được cho vào cùng với kháng thể chuyên biệt trong một ống nhựa nhỏ trước khi bổ sung độc tố đánh dấu Đo lượng phóng xạ của 125I trong phức hợp SE được đánh dấu và kháng thể để xác định lượng độc tố Hiện nay không còn sử dụng phương pháp này vì đã có các phương pháp thay thế không cần dùng phóng xạ[54].

c Phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination)

Phương pháp RPLA được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm

hoặc các chủng S aureus tạo độc tố Trong phương pháp này, hạt nhựa được phủ

kháng thể kháng độc tố trước khi được bổ sung vào giếng Mẫu xét nghiệm được bổ sung vào phản ứng; sự hiện diện của độc tố trong mẫu sẽ tạo ra sự ngưng kết giữa độc tố và kháng thể với mức độ ngưng kết tương quan với lượng độc tố Phương pháp này có độ nhạy 10 - 20ng/ml đủ để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc [54].

d Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme

Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme ELISA (Eenzyme linked

immuno sorbent assay) được ứng dụng khá phổ biến để phát hiện độc tố SE trong

thực phẩm [35] [50] Đây là phương pháp đơn giản, nhạy, nhanh, có thể phát hiện

Trong phương pháp này, đầu tiên kháng thể được cố định lên bề mặt giếng, sau đó bổ sung kháng nguyên Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được phát hiện bằng một kháng thể đánh dấu với enzyme có khả năng bắt kháng nguyên tại một epitope khác Như vậy, kháng thể cố định lên giếng và kháng thể phát hiện phải tương tác với hai epitope không chồng lấp nhau (Hình 1.3) ELISA sandwich là phương pháp thường được sử dụng nhất Alkaline photphatase và horseradish peroxidase là 2 enzyme thường được chọn trong phương pháp này Alkaline photphatase dễ được cộng hợp với kháng thể hơn, màu được tạo ra với cơ chất ρ-nitrophenyl photphatase (pNPP) là màu vàng, Horseradish peroxidase cho phản ứng nhạy hơn, khi kết hợp với cơ chất cho màu xanh lá, xanh dương hay cam Phương pháp ELISA này có độ nhạy là 0,5ng độc tố/ml [54].

+ ELISA cạnh tranh ( Competitive ELISA)

Thường được sử dụng trong trường hợp kháng nguyên mục tiêu có kích thước quá nhỏ, kháng nguyên chỉ có một epitope duy nhất hoặc hiện diện trong mẫu với số lượng quá ít như độc tố vi sinh vật, dư lượng thuốc trừ sâu … Trong phương pháp này, kháng thể chuyên biệt sẽ được phủ lên giếng; kháng nguyên chuẩn cộng hợp với enzyme và kháng nguyên trong mẫu sẽ cạnh tranh với nhau để gắn lên lượng kháng thể giới hạn được cố định Kháng nguyên chuẩn cộng hợp enzyme sẽ được pha loãng ở nồng độ tối ưu mà kháng nguyên tự do trong mẫu có thể cạnh tranh dễ dàng Dựa vào sự giảm tín hiệu màu so với đối chứng để định lượng mức

độ hiện diện của kháng nguyên trong mẫu

+ ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

Phương pháp ELISA này được dùng để định tính và định lượng sự hiện diện

của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu Trong phương pháp này, đầu tiên kháng nguyên mục tiêu (hoặc kháng thể) được cố định lên giếng, sau đó kháng thể chuyên biệt (hoặc kháng nguyên chuyên biệt) đã được đánh dấu với enzyme được

bổ sung và đo OD Do chỉ hình thành một lớp phức hợp kháng nguyên - kháng thể nên ELISA trực tiếp có thao tác đơn giản, nhanh và tránh được những phản ứng

chéo của kháng thể thứ cấp trong mẫu Tuy nhiên, ELISA trực tiếp có độ nhạy thấp

và cần phải tự đánh dấu kháng thể tương ứng với từng kháng nguyên riêng biệt

A

Hình 1.10 EL ISA cạnh tranh C D

B

Hình 1.3 Các dạng thử nghiệm ELISA phổ biến A, ELISA sandwich; B,

ELISA cạnh tranh; C, ELISA trực tiếp; D, ELISA gián tiếp

+ ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

Đây là phương pháp ELISA phổ biến để kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên chuyên biệt trong mẫu kháng huyết thanh, đóng vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Trong phương pháp này, đầu tiên kháng nguyên được cố định lên giếng; sau đó bổ sung kháng thể sơ cấp Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được nhận biết bằng một kháng thể thứ cấp cộng hợp enzyme Kháng thể thứ cấp là một kháng thể đa giá, vì vậy có thể dùng để kiểm tra nhiều loại kháng thể khác nhau của cùng một loài

1.5 XÁC ĐỊNH TIỀM NĂNG SINH ĐỘC TỐ CỦA CÁC CHỦNG S

AUREUS BẰNG PHẢN ỨNG PCR DỰA VÀO GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ

Phương pháp PCR đã được ứng dụng để nhân bản sao các gen entA, entB,

entC, entD, entE mã hóa cho các độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE Phản ứng PCR

dựa trên gen mục tiêu là các gen mã hóa cho các độc tố SE này có thể được dùng

cho mục đích xác định phân biệt chủng S aureus theo độc tố hoặc để xác định khả

năng tạo độc tố của chủng theo gen mã hóa độc tố tương ứng Một phương pháp

multiplex-PCR với 5 cặp mồi chuyên biệt để nhân bản sao các gen gen entA, entB,

entC, entD và entE đã được thiết lập thành công và cho sản phẩm PCR của các gen

gen entA, entB, entC, entD và entE có độ dài tương ứng 120bp, 478bp, 257bp,

317bp và 170bp [49]

1.6 PHƯƠNG PHÁP TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG VÀO VIỆC PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH ELISA [20] [61]

1.6.1 Phương pháp tạo kháng thể đa dòng

Việc sản xuất kháng thể đặc hiệu cho một kháng nguyên là bước quan trọng

và cần thiết cho các thử nghiệm miễn dịch Hầu hết các kháng nguyên đều có cấu trúc phức tạp, chứa nhiều epitope khác nhau dẫn đến sự chọn lọc các dòng tế bào B khác nhau Kết quả của quá trình đáp ứng miễn dịch ở vật chủ là tạo ra kháng thể đa dòng gồm nhiều kháng thể đơn dòng, trong đó mỗi kháng thể đơn dòng là đặc hiệu cho một epitope của kháng nguyên [6] Để tạo được kháng thể có hiệu giá cao các yếu tố cần được quan tâm là:

- Liều lượng kháng nguyên: liều lượng kháng nguyên tối ưu giúp gây đáp ứng

miễn dịch mạnh nhất; lượng kháng nguyên quá thấp hoặc quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng dung nạp hơn là kích thích đáp ứng miễn dịch Thông thường, đối với thỏ, liều tiêm thấp nhất khoảng 10μg/lần tiêm, phổ biến là 100μg/lần tiêm Liều dành cho chuột thì giảm 10 lần so với thỏ

- Vật chủ: nhiều loài động vật có xương sống có thể dùng để sản xuất kháng

huyết thanh và kháng thể trong đó dùng trong phòng thí nghiệm chủ yếu là thỏ,

chuột và bọ Thông thường, có thể thu được 25ml huyết thanh/lần từ thỏ, 100 - 200

µl/lần từ chuột, 1 - 2 ml/lần từ bọ

- Tá chất (adjuvant): có vai trò kích thích hệ miễn dịch và tăng thời gian tồn

tại của kháng nguyên trong cơ thể vật chủ Tá chất thường được dùng là hỗn hợp dầu, complete Freund’s adjuvant (CFA), ngoài ra còn có thể chứa thành phần vách

tế bào vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Tuy nhiên, CFA có thể gây viêm,

loét khi được tiêm với liều cao hay tiêm nhiều lần Do vậy, CFA chỉ được dùng ở lần tiêm đầu tiên còn các lần tiếp theo nó được thay bằng incomplete Freund’s adjuvant (IFA) IFA có thành phần tương tự như CFA nhưng không mang vách tế bào vi khuẩn lao

- Vị trí tiêm: được chọn lựa tùy từng mục đích Tiêm dưới da thường được

dùng cho thỏ, chuột, bọ Các vật liệu được tiêm vào sẽ di chuyển nhanh chóng đến

hệ thống bạch huyết và tập trung tại hạch bạch huyết gần vị trí tiêm Thỏ thường được tiêm trên lưng; chuột, bọ được tiêm sau cổ hoặc hai bên háng Tiêm vào cơ được dùng nhằm mục đích phóng thích chậm kháng nguyên Chất tiêm vào sẽ tích

tụ tại các mô cơ và kháng nguyên sẽ di chuyển dần đến các khoảng gian bào lân cận

và sau đó đến các hạch bạch huyết lân cận Phương pháp này khó sử dụng cho những động vật gặm nhấm nhỏ như chuột, nhưng được dùng phổ biến cho thỏ và

những động vật lớn hơn Tiêm vào da tại nhiều vị trí khác nhau trên lưng được

dùng phổ biến cho những động vật lớn cho phép phóng thích kháng nguyên với tốc

độ rất chậm, thường dùng với kháng nguyên có nồng độ cao Tiêm vào tĩnh mạch được dùng đối với hầu hết các động vật nuôi ở phòng thí nghiệm khi tiến hành tiêm nhắc kể từ lần thứ hai trở về sau, hiếm khi dùng để tiêm lần đầu Tá chất không an toàn và không thích hợp cho phương pháp này, nên sử dụng các dung dịch đệm sinh

lý Tiêm vào khoang bụng được sử dụng cho chuột, bọ

1.6.2 Tinh chế và đánh dấu kháng thể [9] [37] [61]

a Tinh chế kháng thể

Việc tinh chế protein nói chung và kháng thể nói riêng được dựa trên các đặc điểm tính tích điện, kích thước, độ kỵ nước, sự hiện diện của các nhóm chức chuyên biệt, của protein Ngoài ra kháng thể còn có một số đặc điểm riêng rất thuận lợi cho việc tinh chế: điểm đẳng điện tương đối cao (khoảng 8,6; kháng thể thỏ có pI

từ 8,4 đến 9,2) so với các protein khác (khoảng 6 - 7), các protein trong huyết thanh

có pI dưới 5, các phân đoạn của kháng thể có ái lực với một số protein đặc biệt như vùng Fc có ái lực cao với protein A hoặc G

- Tủa phân đoạn protein bằng hóa chất

Khi hòa tan trong nước phân tử protein được hydrate hóa Khi có sự hiện diện của các muối có tính tan cao như ammonium sulfate bão hòa, protein bị khử nước và bị kết tủa Do vậy protein hiện diện trong dung dịch sẽ bị tủa với mức độ khác nhau (tủa phân đoạn) tùy thuộc vào đặc tính của protein bằng các nồng độ amonium sulfate khác nhau Việc kết hợp bước tinh chế này với một số phương pháp tinh chế khác như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký lọc gel cho phép thu nhận được kháng thể với độ tinh sạch mong muốn Mặt khác, acid caprylic có thể tủa hầu hết các protein trong huyết thanh trừ IgG nên có thể dùng phương pháp này kết hợp với tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hòa để tinh chế kháng thể Kết quả tinh sạch bằng phương pháp này có thể lên đến 99 %

- Phương pháp tinh chế kháng thể qua sắc ký cột protein A hoặc G

Phương pháp sắc ký ái lực bằng cột protein A hoặc G được sử dụng phổ biến trong tinh chế kháng thể vì có tính chọn lọc cao, có thể đạt độ tinh sạch lên đến

99% Protein A có nguồn gốc từ vách tế bào S aureus Protein G có nguồn gốc từ

Streptococcus Cả hai protein này đều có ái lực rất cao đối với vùng Fc của kháng

thể IgG Mặt khác, ái lực của hai loại protein này đối với kháng thể còn phụ thuộc vào điều kiện pH nên đặc tính này được ứng dụng để dung ly kháng thể ra khỏi cột

b Đánh dấu kháng thể

Trong phản ứng ELISA, kháng thể cần được đánh dấu bằng enzyme hiển thị

và giúp định lượng mức độ hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu thông qua sự thay đổi màu sắc, sự phát huỳnh quang trong phản ứng được xúc tác bởi enzyme Sự cộng hợp (gắn cộng hóa trị) enzyme vào kháng thể là tối ưu khi hiệu suất cộng hợp cao ở những vị trí xác định trên kháng thể và enzyme mà không làm mất hoạt tính của kháng thể hay enzyme Các nhóm chức trên kháng thể có thể được dùng để gắn cộng hóa trị với enzyme là:

+ Nhóm amin bậc 1 (-NH 2 ): hiện diện nhiều nhất ở vùng Fc của kháng thể

Đây là nhóm chức được biến đổi dễ dàng, được sử dụng phổ biến nhất trong việc đánh dấu kháng thể Các gốc đường trên phân tử enzyme được ôxi hóa thành nhóm aldehyde hay cetone, nhóm này tương tác với nhóm NH2 trên kháng thể tạo nên một hợp chất trung gian carbinolamine chứa nối NH - C Do nối NH - C dễ bị thủy giải nên đôi điện tử từ nhóm amin sẽ được chuyển vào nối đơn của carbinolamine hình thành nối đôi của phân tử Schiff base Các tác nhân ôxi hóa mạnh như periodate, glutaraldehyde thường được dùng để hoạt hóa các enzyme có bản chất là glycoprotein và hỗ trợ cho sự hình thành Schiff base trong phản ứng cộng hợp kháng thể - enzyme (Hình 1.4.)

Vùng carbohydrate chứa nhóm cis-diol: vùng này có thể bị ôxi hóa hình thành

nhóm aldehyde hoạt độ dùng cho mục đích cộng hợp, hiện diện ở vùng Fc Cộng hợp thông qua carbonhydrate cần nhiều bước hơn so với cộng in, tu

kháng thể sau khi cộng hợp có hoạt tính cao

ng

hợp am y nhiên

ủ hoạt tín g

+ Nhóm sulhydryl (-SH): nằm trong cystein hoặc là kết quả c a quá trình khử cầu nối disulfite ở vùng bản lề của kháng thể, cộng hợp thông qua sulhydryl cũng cần nhiều bước và cho h khán thể sau cộng hợp cao

1.6.3 Xây dựng qui trình ELISA sandwich

Hình 10 Cơ chế hình thành Schiff base trong phương pháp cộng hợp hai bước dùng GA Hình 1.4 Cơ chế hình thành Schiffbase trong phương pháp cộng hợp kháng thể -

enzyme thông qua nhóm NH 2

+ Vùng carbohydrate chứa nhóm cis-diol: vùng này có thể bị ôxi hóa hình

thành nhóm aldehyde hoạt động dùng cho mục đích cộng hợp, hiện diện ở vùng Fc Cộng hợp thông qua carbonhydrate cần nhiều bước hơn so với cộng hợp amin, tuy

nhiên kháng thể sau khi cộng hợp có hoạt tính cao

+ Nhóm sulhydryl (-SH): nằm trong cystein hoặc là kết quả của quá trình

khử cầu nối disulfite ở vùng bản lề của kháng thể; cộng hợp thông qua sulhydryl

cũng cần nhiều bước và cho hoạt tính kháng thể sau cộng hợp cao

1.6.3 Các bước qui trình ELISA sandwich

Qui trình ELISA sandwich để định lượng một kháng nguyên hoặc kháng thể bao gồm các bước sau: (i) Phủ kháng thể hoặc kháng nguyên lên bề mặt giếng, rửa sạch phần thừa; (ii) Khóa các vị trí không có kháng nguyên hoặc kháng thể để tránh kết quả dương tính giả; rửa sạch phần thừa; (iii) Bổ sung kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện; rửa sạch phần thừa; (iv) Nếu chất phản ứng ở bước (iii) là kháng nguyên thì bổ sung kháng thể thứ hai kháng lại kháng nguyên (kháng thể này được cộng hợp enzyme); nếu chất phản ứng ở bước (iii) là kháng thể thì bổ sung kháng thể thứ cấp kháng kháng thể ban đầu (kháng thể thứ cấp được cộng hợp với enzyme); rửa để loại bỏ phần thừa; (iv) Bổ sung cơ chất; phản ứng chuyển hóa cơ chất được xác định bởi enzyme tạo sản phẩm có màu và thông qua cường độ màu

để định lượng nồng độ kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu

a Phủ giếng (Coating)

Hầu hết các đĩa microplate dùng cho ELISA hiện nay được làm từ polystyrene Việc gắn kháng nguyên hay kháng thể lên giếng chủ yếu dựa vào tương tác kỵ nước giữa protein với các chuỗi carbon chứa vòng benzen trên bề mặt giếng của microplate Một số microplate có bề mặt giếng được xử lý để làm tăng tương tác kỵ nước của các nhóm carboxyl (COOH), hydroxyl (OH), nhóm amin, hydrazine và N-oxysuccinimide Mặt khác, do bản chất kỵ nước của bề mặt polystyren, việc phủ giếng cần tiến hành ở pH bằng hoặc lớn hơn pI của protein để tránh lực đẩy tĩnh điện Trong trường hợp kháng thể, sự bám vào bề mặt giếng diễn

ra tốt ở pH 7 - 9 trong dung dịch muối giúp duy trì sự hòa tan và cấu hình tự nhiên

của protein Ba loại dung dịch đệm phủ giếng được sử dụng rộng rãi là 50mM carbonate pH 9,5, 10mM Tris pH 8,5, 10mM Phosphate Buffer Saline pH 7,2 Thời gian và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát lượng protein được cố định Sự bám dính tốt nhất và ít có khác biệt giữa các giếng nhất khi đĩa được ủ qua đêm (16 - 18 giờ) ở 4oC Thời gian ủ cũng có thể được rút ngắn bằng cách ủ ở nhiệt độ phòng (2 - 3 giờ) hoặc ở 37oC (2 giờ)

Nồng độ protein tối ưu cho bước phủ giếng cần được xác định qua thực nghiệm Thường dao động trong khoảng từ 1µg/ml đến 5µg/ml đối với kháng thể

và 1µg/ml đến 20µg/ml đối với kháng nguyên

Độ tinh sạch cao của protein giúp giảm phản ứng chéo và nâng cao độ nhạy

b Khóa giếng (Blocking)

Việc phủ kháng thể hoặc kháng nguyên có thể vẫn còn để lại những vị trí còn trống trên bề mặt giếng cần được khóa để tránh sự gắn không đặc hiệu của các tác chất ở các bước tiếp theo dẫn đến hệ quả làm tăng tín hiệu nền và giảm độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Hai loại chất khóa giếng thường được sử dụng là protein và các chất hoạt động bề mặt như Tween-20 và Triton X-100

Các protein dùng để khóa giếng phổ biến nhất là: sữa gầy nồng độ 1 - 5% được pha mới 1 - 2 ngày trước khi sử dụng, casein 0,5 - 1%, gelatin cá 0,5 - 1%

c Rửa

Bước ủ cho phép các tương tác đặc hiệu có ái lực cao được hình thành giữa các protein Bằng cách rửa vài lần giữa mỗi lần ủ, các chất phản ứng dư thừa sẽ được loại bỏ Mặt khác, bên cạnh những tương tác đặc hiệu có ái lực cao, luôn có những tương tác có ái lực thấp giữa các chất phản ứng Dung dịch rửa phải có khả năng phá vỡ các tương tác có ái lực thấp để rửa sạch những tương tác này Dung dịch rửa nên chứa một nồng độ muối thích hợp để tránh các phần đã tương tác bị biến tính và duy trì hoạt tính enzym Các dung dịch đệm thường được sử dụng là PBS, Tris

d Phát hiện

Hai enzyme thường được sử dụng phổ biến nhất là horseradish peroxidase (HRP) và alkaline phosphatase (AP) HRP cộng hợp với kháng thể ở trạng thái đông khô có thể bảo quản được nhiều năm Dung dịch đệm thích hợp để hòa tan dạng cộng hợp là dung dịch đệm citrate hoặc dung dịch đệm phosphate 20mM, pH 5,0 2,2’-azino- di(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic aicd) (ABTS) và 3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine (TMB) là hai cơ chất được dùng phổ biến nhất cho HRP cộng hợp ABTS tạo sản phẩm màu xanh lục hấp thu cực đại ở bước sóng 405nm TMB tạo sản phẩm màu xanh hấp thu cực đại ở bước sóng 650 nm Nếu dùng acid để ngừng phản ứng, TMB chuyển sang màu vàng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 450nm và độ nhạy tăng 2-3 lần Ngoài ra, o-phenylenediamine (OPD), o- dianisidine (ODIA) và acid 5-aminosalicylic (5AS) cũng được sử dụng làm cơ chất nhưng ít phổ biến hơn

Alkaline phosphatase (AP) là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân orthophosphoric monoester để tạo rượu và orthophosphate, có pH tối ưu khoảng 9,0; thường được sử dụng với các dung dịch đệm là Tris, borate và carbonate Cơ

chất phổ biến nhất cho AP cộng hợp kháng thể là p-nitrophenyl phosphate (pNPP),

tạo sản phẩm có màu vàng hấp thu tối đa ở bước sóng 450nm, hoặc

bromo-chloro-indoxylphosphate (BCIP) BCIP có độ nhạy gấp khoảng 2 lần so với pNPP

Màu được hình thành trong thử nghiệm được định lượng bằng máy đọc plate

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Dụng cụ

- Chai dural 250ml - Trợ pippet

- Chai dural 500ml - Micropippet 100 - 1000µl

- Ðĩa petri - Micropippet 10 - 100µl

- Ống nghiệm 18 - Ống đong 500ml

- Ống nghiệm 12 - Cốc có mỏ 50, 250, 500ml

- Ðầu típ 0,2ml, 1ml - Muỗng inox

- Bộ phân phối môi trường - Phanh, dao , kéo inox

- Que cấy, đèn cồn, giấy thử pH - Găng tay y tế, gòn, lame

- Kim tiêm - Eppendorf

- Kim trộn - Cột protein A

- Chuồng nuôi thỏ - Bộ lọc analog

- Bản gel bằng thủy tinh - Ống Amicon MWCO 100kDa

- Hộp nhựa - Ống Amicon MWCO 30kDa

- Máy lọc chân không - Máy khuấy từ

- Máy vortex - Nồi cách thuỷ

- Tủ đông -30oC - pH kế

- Máy dập mẫu - Lò hấp khử trùng

- Máy chạy điện di ngang - Máy chạy điện di đứng

- Máy li tâm lạnh - Máy chụp hình điện di

- Máy đọc OD - Máy rửa đĩa ELISA

- Thạch Chapman MSA (manitol salt agar) và thạch Baird-Parker

- Thạch dinh dưỡng NA (nutrient agar)

- Dịch lòng đỏ trứng gà

- Potassium tellurite

- Huyết tương thỏ

b Hóa chất dùng để thử đậm độ và khả năng sinh độc tố

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion broth)

- TSB (Tryptic Soy Broth)

- GSTM (growth staphylococcal Tecra medium)

- Các hóa chất có sẵn trong bộ kit xác định độc tố SE (Tecra-Úc): dung dịch

rửa, đối chứng dương, đối chứng âm; đối chứng cộng hợp, dung dịch pha

cộng hợp; cơ chất, dung dịch pha cơ chất; chất dừng phản ứng

c Hóa chất chiết xuất DNA và điện di

- Agarose

- Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA

- Đệm nạp mẫu điện di: 30% glycerol, 0,15% bromophenol blue, 200mM Tris,

20 mM EDTA