Qui trình ELISA sandwich để định lượng một kháng nguyên hoặc kháng thể
bao gồm các bước sau: (i) Phủ kháng thể hoặc kháng nguyên lên bề mặt giếng, rửa sạch phần thừa; (ii) Khĩa các vị trí khơng cĩ kháng nguyên hoặc kháng thểđể tránh kết quả dương tính giả; rửa sạch phần thừa; (iii) Bổ sung kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện; rửa sạch phần thừa; (iv) Nếu chất phản ứng ở bước (iii) là kháng nguyên thì bổ sung kháng thể thứ hai kháng lại kháng nguyên (kháng thể này được cộng hợp enzyme); nếu chất phản ứng ở bước (iii) là kháng thể thì bổ sung kháng thể thứ cấp kháng kháng thể ban đầu (kháng thể thứ cấp được cộng hợp với enzyme); rửa để loại bỏ phần thừa; (iv) Bổ sung cơ chất; phản ứng chuyển hĩa cơ
chất được xác định bởi enzyme tạo sản phẩm cĩ màu và thơng qua cường độ màu
đểđịnh lượng nồng độ kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu.
a. Phủ giếng (Coating)
Hầu hết các đĩa microplate dùng cho ELISA hiện nay được làm từ
polystyrene. Việc gắn kháng nguyên hay kháng thể lên giếng chủ yếu dựa vào tương tác kỵ nước giữa protein với các chuỗi carbon chứa vịng benzen trên bề mặt giếng của microplate. Một số microplate cĩ bề mặt giếng được xử lý để làm tăng tương tác kỵ nước của các nhĩm carboxyl (COOH), hydroxyl (OH), nhĩm amin, hydrazine và N-oxysuccinimide. Mặt khác, do bản chất kỵ nước của bề mặt polystyren, việc phủ giếng cần tiến hành ở pH bằng hoặc lớn hơn pI của protein để
tránh lực đẩy tĩnh điện. Trong trường hợp kháng thể, sự bám vào bề mặt giếng diễn ra tốt ở pH 7 - 9 trong dung dịch muối giúp duy trì sự hịa tan và cấu hình tự nhiên
của protein. Ba loại dung dịch đệm phủ giếng được sử dụng rộng rãi là 50mM carbonate pH 9,5, 10mM Tris pH 8,5, 10mM Phosphate Buffer Saline pH 7,2.
Thời gian và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm sốt lượng protein được cố định. Sự bám dính tốt nhất và ít cĩ khác biệt giữa các giếng nhất khi đĩa được ủ qua đêm (16 - 18 giờ) ở 4oC. Thời gian ủ cũng cĩ thểđược rút ngắn bằng cách ủở nhiệt độ phịng (2 - 3 giờ) hoặc ở 37oC (2 giờ).
Nồng độ protein tối ưu cho bước phủ giếng cần được xác định qua thực nghiệm. Thường dao động trong khoảng từ 1µg/ml đến 5µg/ml đối với kháng thể
và 1µg/ml đến 20µg/ml đối với kháng nguyên..
Độ tinh sạch cao của protein giúp giảm phản ứng chéo và nâng cao độ nhạy.
b. Khĩa giếng (Blocking)
Việc phủ kháng thể hoặc kháng nguyên cĩ thể vẫn cịn để lại những vị trí cịn trống trên bề mặt giếng cần được khĩa để tránh sự gắn khơng đặc hiệu của các tác chất ở các bước tiếp theo dẫn đến hệ quả làm tăng tín hiệu nền và giảm độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Hai loại chất khĩa giếng thường được sử dụng là protein và các chất hoạt động bề mặt như Tween-20 và Triton X-100.
Các protein dùng để khĩa giếng phổ biến nhất là: sữa gầy nồng độ 1 - 5%.
được pha mới 1 - 2 ngày trước khi sử dụng, casein 0,5 - 1%, gelatin cá 0,5 - 1%.
c. Rửa
Bước ủ cho phép các tương tác đặc hiệu cĩ ái lực cao được hình thành giữa các protein. Bằng cách rửa vài lần giữa mỗi lần ủ, các chất phản ứng dư thừa sẽ được loại bỏ. Mặt khác, bên cạnh những tương tác đặc hiệu cĩ ái lực cao, luơn cĩ những tương tác cĩ ái lực thấp giữa các chất phản ứng. Dung dịch rửa phải cĩ khả
năng phá vỡ các tương tác cĩ ái lực thấp để rửa sạch những tương tác này. Dung dịch rửa nên chứa một nồng độ muối thích hợp để tránh các phần đã tương tác bị
biến tính và duy trì hoạt tính enzym. Các dung dịch đệm thường được sử dụng là PBS, Tris.
d. Phát hiện
Hai enzyme thường được sử dụng phổ biến nhất là horseradish peroxidase (HRP) và alkaline phosphatase (AP). HRP cộng hợp với kháng thể ở trạng thái
đơng khơ cĩ thể bảo quản được nhiều năm. Dung dịch đệm thích hợp để hịa tan dạng cộng hợp là dung dịch đệm citrate hoặc dung dịch đệm phosphate 20mM, pH 5,0. 2,2’-azino- di(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic aicd) (ABTS) và 3,3’,5,5’ - tetramethylbenzidine (TMB) là hai cơ chất được dùng phổ biến nhất cho HRP cộng hợp. ABTS tạo sản phẩm màu xanh lục hấp thu cực đại ở bước sĩng 405nm. TMB tạo sản phẩm màu xanh hấp thu cực đại ở bước sĩng 650 nm. Nếu dùng acid để
ngừng phản ứng, TMB chuyển sang màu vàng cĩ độ hấp thu cực đại ở bước sĩng 450nm và độ nhạy tăng 2-3 lần. Ngồi ra, o-phenylenediamine (OPD), o- dianisidine (ODIA) và acid 5-aminosalicylic (5AS) cũng được sử dụng làm cơ chất nhưng ít phổ biến hơn.
Alkaline phosphatase (AP) là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân orthophosphoric monoester để tạo rượu và orthophosphate, cĩ pH tối ưu khoảng 9,0; thường được sử dụng với các dung dịch đệm là Tris, borate và carbonate. Cơ
chất phổ biến nhất cho AP cộng hợp kháng thể là p-nitrophenyl phosphate (pNPP), tạo sản phẩm cĩ màu vàng hấp thu tối đa ở bước sĩng 450nm, hoặc bromo-chloro- indoxylphosphate (BCIP). BCIP cĩ độ nhạy gấp khoảng 2 lần so với pNPP.
Màu được hình thành trong thử nghiệm được định lượng bằng máy đọc plate.
CHƯƠNG 2.
VẬT LIỆU
- PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Dụng cụ
- Chai dural 250ml - Trợ pippet
- Chai dural 500ml - Micropippet 100 - 1000µl - Ðĩa petri - Micropippet 10 - 100µl - Ống nghiệm 18 - Ống đong 500ml
- Ống nghiệm 12 - Cốc cĩ mỏ 50, 250, 500ml
- Pippet các loại 1ml, 5ml, 10ml - Bình cồn
- Ðầu típ 0,2ml, 1ml - Muỗng inox
- Bộ phân phối mơi trường - Phanh, dao , kéo inox - Que cấy, đèn cồn, giấy thử pH - Găng tay y tế, gịn, lame
- Kim tiêm - Eppendorf
- Kim trộn - Cột protein A - Chuồng nuơi thỏ - Bộ lọc analog
- Bản gel bằng thủy tinh - Ống Amicon MWCO 100kDa - Hộp nhựa - Ống Amicon MWCO 30kDa - Dây truyền dịch. - Cột PD10. - Đĩa ELISA 96 giếng 2.1.2. Thiết bị - Nồi hấp vơ trùng - Tủấm 37oC, 45oC - Tủ lạnh - Tủ cấy vơ trùng - Cân phân tích - Lị vi sĩng - Máy lọc chân khơng - Máy khuấy từ
- Máy vortex - Nồi cách thuỷ
- Tủđơng -30oC - pH kế
- Máy dập mẫu - Lị hấp khử trùng
- Tủ sấy - Máy luân nhiệt
- Máy chạy điện di ngang - Máy chạy điện di đứng
- Máy li tâm lạnh - Máy chụp hình điện di
- Máy ủ nhiệt độ khơ - Máy lắc
- Máy degas - Máy lắc ổn nhiệt
- Máy đọc OD - Máy rửa đĩa ELISA - Máy đo nồng độ kháng thể
2.1.3. Hĩa chất
a. Hĩa chất dùng đểđịnh lượng S. aureus bằng phương pháp MPN
- Pepton đệm
- Canh thang TSB (Trypticase Soy Broth) với 10% NaCl và 1% sodium pyruvate
- Thạch Chapman MSA (manitol salt agar) và thạch Baird-Parker
- Thạch dinh dưỡng NA (nutrient agar)
- Dịch lịng đỏ trứng gà
- Potassium tellurite
- Huyết tương thỏ
b. Hĩa chất dùng để thửđậm độ và khả năng sinh độc tố
- Mơi trường BHI (Brain Heart Infusion broth) - TSB (Tryptic Soy Broth)
- GSTM (growth staphylococcal Tecra medium)
- Các hĩa chất cĩ sẵn trong bộ kit xác định độc tố SE (Tecra-Úc): dung dịch rửa, đối chứng dương, đối chứng âm; đối chứng cộng hợp, dung dịch pha cộng hợp; cơ chất, dung dịch pha cơ chất; chất dừng phản ứng.
c.Hĩa chất chiết xuất DNA và điện di
- Agarose
- Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA
- Đệm nạp mẫu điện di: 30% glycerol, 0,15% bromophenol blue, 200mM Tris, 20 mM EDTA
- Đệm TAE 1x: 4,48g Tris, 2ml Na2EDTA 0,5M pH 8, 1,14ml glacial acetic acid, nước cất đủ 1000ml
- Dung dịch NaCl 0,85% vơ trùng
- Pha multiplex-PCR mix khơng UNG, dUTP, mồi của 5 cặp mồi (SEA1, SEA2, SEB1, SEB2, SEC1, SEC2, SED1, SED2, SEE1, SEE2), nồng độ mồi 25 pmol/phản ứng; Master mix 2x gồm: PCR buffer 2x, MgCl2 3 mM, dNTP 400ul (Nam Khoa) , Taq polymerase 2,5U (BioRad), nước cất vừa đủ 48 ul
- Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA
- Đệm PCR 10X cĩ thành phần như sau: 500mM KCl, 15mM MgCl2, 100mM Tris-HCl, pH 9, bảo quản ở nhiệt độ phịng.
d. Hĩa chất dùng cho gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể
- Tá chất CFA: Complete Freund’s adjuvant - Sigma USA - Tá chất IFA Incomplete Freund’s adjuvant - Sigma USA - Phosphate buffer saline (PBS)
e. Hĩa chất dùng cho thử nghiệm khuếch tán trên gel
- Gel agarose 1,5%: 1,5g agarose, nước cất vừa đủ 100ml
- Dung dịch PBS, pH = 7,2 (0,15M) (Dung dịch ngâm gel): 4g NaCl, 0,1g KCl, 0,575g Na2HPO4, 0,1g KH2PO4
- Thuốc nhuộm gel Coomasie: 40ml glacial acetic acid, 180ml ethanol 96%, 2g Coomasie, nước cất 180ml
- Thuốc giải nhuộm gel: 40ml glacial acetic acid, 180ml ethanol 96%, nước cất.
g. Hĩa chất dùng để phân tích và tinh chế kháng thể
- Dung dịch nạp mẫu (Sample buffer) 5X: 5ml glycerol, 3ml Bromphenol blue 0,1%, 4ml SDS 10%, 2ml β-mercaptoethanol, 0,2ml Tris Base 0,5M, 5,6ml nước cất, chỉnh pH 8,3
- Dung dịch điện di protein 5X: 15,1g Tris-HCl, 94g glycine, 5g sodium dodecyl sulfate, nước cất vừa đủ 1000ml
- Dung dịch nhuộm gel Coomassie: 0,625g Coomassie brilliant blue, 112,5ml ethanol tuyệt đối, 25ml glacial acetic acid, nuớc cất 112,5ml
- Dung dịch giải nhuộm: 100ml glacial acetic acid, 100ml ethanol tuyệt đối, nước cất 800ml
- Dung dịch amonium sulfate bão hịa (SAS): 697g (NH4)2SO4 pha trong 1 lít nước. Bảo quản lạnh; dung dịch amonium sulfate 50% bão hịa: pha từ dung dịch amonium sulfate bão hịa.
- Dung dịch đệm rửa cột 1X (20 mM sodium phosphate): 1,084g NaH2PO4, 3,273g Na2HPO4.7H2O, nước cất vừa đủ 1 lít hoặc 1,734g NaH2PO4.2H2O, 1,409g Na2HPO4.2H2O, nước cất vừa đủ 1 lít
- Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X (pha từ dung dịch PBS 50X)
- Dung dịch đệm PBS 5X (pha từ dung dịch PBS 50X) - Dung dịch đệm dung ly: 0,1M acid citric pH = 3-6 - Tris-HCl 1M pH 9,0
- Ethanol tuyệt đối 20%
- Gel polyacrylamide 100 x 100 x 0,75 mm, nồng độ 12,5%.
f. Hĩa chất dùng để đánh dấu kháng thể
- Glutaraldehyde (GA) 0,1%
- Horseradish peroxidase (HRP) (Piercenet, Mỹ)
- Dung dịch đệm carbonate: 0,42g NaHCO3 và cho nước cất vào vừa đủ 50ml, chỉnh pH=9,5 bằng dung dịch NaOH
- Dung dịch đệm photphate (sodium phosphate buffer 0,1 M pH 6,8): 3,56g Na2HPO4.2H2O, 2,76g NaH2PO4.H2O, nước cất vừa đủ 100ml
- Dung dịch đệm phosphate: sodium phosphate buffer 0,1 M pH 7,2, cách pha giống như SPB pH 6,8, nhưng chỉnh pH 7,2
- Dung dịch NaCl 0,9%
- Dung dịch lysine 1M pH 7: 1,46 g lysine cho vào 10ml nước cất - Dung dịch glycerol 20%.
h. Hĩa chất cho qui trình ELISA
- Phosphate buffer (PBS) 50X (pH 7,6-8,0) (Dung dịch A): 89g Na2HPO4.2H2O hoặc 71g Na2HPO4 trong 900ml nước cất, (Dung dịch B): 7,8g NaH2PO4 , nước cất 100ml. Trộn 2 dung dịch A và B
- Dung dịch PBS pH 7,2: Phosphate buffer pH 7,6 - 8,0, 14,61g NaCl
- Dung dịch Carbonate pH 7,2: 0,32g Na2CO3, 0,586g NaHCO3, 0,04g sodium azide, nước cất 200ml
- Dung dịch 10mM Tris-Cl pH 8,5: 0,242g Tris, nước cất vừa đủ 200ml; chỉnh pH bằng HCl đến pH 8,5.
- Sữa gầy 5% và 1% - Gelatin 1% và 0,5% - Casein 1% và 0,5%
- Dung dịch rửa (Wash buffer): 20ml PBS 50X, 14,61g NaCl, 1ml Tween 20, nước cất vừa đủ 1000ml
- Dung dịch PBS buffer: 20ml PBS 50X, 8,77g NaCl, 1ml Tween, nước cất vừa đủ vừa đủ 1000ml
- Dung dịch pha cơ chất tạo màu (Citrate buffer pH 4,0): 6,8ml acid citric 0,5 M, 13,2ml Na2HPO4 0,5 M, nước cất vừa đủ 100ml
- Dung dịch ABTS: Pha 40mg ABTS trong 100ml phosphate - citrate buffer 100mM, pH 4,0. Trước khi sử dụng cho thêm H2O2 với nồng độ 0,003%. - Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution): H2SO4 2N
2.1.4. Sinh vật phẩm
a. Kháng nguyên độc tố và động vật thí nghiệm
- Thỏ 2 - 3kg (Viện Pasteur TP.HCM)
- Độc tố Staphylococcal enterotoxin A, nồng độ 0,5mg/lọ (Sigma, Mỹ) - Độc tố Staphylococcal enterotoxin B, nồng độ 1mg/lọ (Sigma, Mỹ)
b. Chủng giống vi sinh vật
- S.aureus ATCC29213 mang gen sinh độc tố A - S.aureus ATCC14458 mang gen sinh độc tố B - S.aureus ATCC19095 mang gen sinh độc tố C - S.aureus ATCC23235 mang gen sinh độc tố D - S.aureus ATCC27644 mang gen sinh độc tố E
- E. coli ATCC 25922
- Salmonella typhimurium
- Shigella dysenteria
- Vibrio cholerae Inaba NIH35
- Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802
- Pseudomonas aeruginosa
c. Mồi cho phản ứng PCR
Mồi dùng để nhân bản sao các vùng trình tự chuyên biệt cho 5 gen entA, entB, entC, entD, entE mã hĩa 5 độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE được thiết kế để cho sản phẩm PCR cĩ độ dài tương ứng 120bp, 478bp, 257bp, 317bp và 170bp bởi David H.P., 1993 [49]. Trình tự mồi được trình bày trên Bảng 2.1.
d. Thang trọng lượng phân tử protein
Hình 2.1. Thang phân tử lượngprotein
Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng để nhân bản sao các gen mã hĩa độc tố SAE bằng phản ứng PCR
Mồi Trình tự nucleotide, 5’ đến 3’ Chiều dài sản phẩm PCR (bp)
SEA1 SEA2
TTG GAA ACG GTT AAA ACG AA
GAA CCT TCC CAT CAA AAA CA 120bp
SEB1 SEB2
TCG CAT CAA ACT GAC AAA CG
GCA ATA AAA GCT AGG AAT TT 478bp
SEC1 SEC2
GAC ATA AAA GCT AGG AAT TT
AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC 257bp
SED1 SED2
CTA GTT TGG TAA TAT CTC CT
TAA TGC TAT ATC TTA TAG GG 317bp
SEE1 SEE2
TAG ATA AAG TTA AAA CAA GC
TAA CTT ACC GTG GAC CCT TC 170bp
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Chọn mẫu và địa điểm thu mẫu
- Mẫu thực phẩm: Các loại thực phẩm thịt sữa, trứng, rau và các mẫu thực phẩm khác được thu mẫu theo phương thức chọn mẫu ngẫu nhiên.
- Cở mẫu được tính theo cơng thức chung như sau:
2 2 (1 ) e p p Z n= × − (1)
Trong đĩ: n là cỡ mẫu tối thiểu, p là tỉ lệ mẫu nhiễm từ các nghiên cứu trước, e là sai số chấp nhận, chọn trị số 5% (0,05), Z = 1,96 ứng với sai số 5%. Từ cơng thức (1) cĩ thể tính ra số mẫu thực phẩm cần thu nhận với p = 0,3 (là tỉ lệ mẫu thực phẩm bị nhiễm qua các chương trình giám sát vệ sinh thực phẩm) là 322 mẫu. Mặt khác cần bổ sung sai số mẫu 10% là 32 mẫu. Do vậy tổng số mẫu thực phẩm trong nghiên cứu tối thiểu là 354 mẫu, trong đĩ tập trung phần lớn vào mẫu
thịt, cá, sữa, kem và các mẫu trong vụ ngộ độc thực phẩm. Từ cở mẫu tối thiểu này, số mẫu thực tế tiến hành thu nhận là 450 mẫu thực phẩm tại các chợ, quán, xe
đẩy, các hàng quán giải khát và ăn uống trên đường phố để khảo sát tình hình nhiễm S. aureus trong thực phẩm và phân lập các chủng S. aureus. Danh sách các mẫu thực phẩm thu nhận được trình bày ở phụ lục 1A.
- Mẫu chất nơn do ngộ độc thực phẩm: 20 mẫu chất nơn từ một số vụ ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM được thu nhận để xác định tỷ lệ gây ngộ độc bởi
S. aureus và phân lập chủng. Danh sách các mẫu chất nơn do ngộđộc thực phẩm
được trình bày ở phụ lục 1B.
2.2.2. Định lượng S. aureus trong thực phẩmbằng phương pháp MPN
- Cân mẫu, đồng nhất mẫu và pha lỗng mẫu: cân 10g mẫu, bổ sung 90ml dung dịch đệm phosphate, dập đều mẫu, ta thu được dung dịch mẫu pha lỗng nồng
độ 10-1, từ nồng độ 10-1 tiếp tục pha lỗng 10-2, 10-3, 10-4, …