a. Tinh chế kháng thể
Việc tinh chế protein nĩi chung và kháng thể nĩi riêng được dựa trên các đặc
điểm tính tích điện, kích thước, độ kỵ nước, sự hiện diện của các nhĩm chức chuyên biệt,...của protein. Ngồi ra kháng thể cịn cĩ một số đặc điểm riêng rất thuận lợi cho việc tinh chế: điểm đẳng điện tương đối cao (khoảng 8,6; kháng thể thỏ cĩ pI từ 8,4 đến 9,2) so với các protein khác (khoảng 6 - 7), các protein trong huyết thanh cĩ pI dưới 5, các phân đoạn của kháng thể cĩ ái lực với một số protein đặc biệt như
vùng Fc cĩ ái lực cao với protein A hoặc G.
- Tủa phân đoạn protein bằng hĩa chất
Khi hịa tan trong nước phân tử protein được hydrate hĩa. Khi cĩ sự hiện diện của các muối cĩ tính tan cao như ammonium sulfate bão hịa, protein bị khử
nước và bị kết tủa. Do vậy protein hiện diện trong dung dịch sẽ bị tủa với mức độ
khác nhau (tủa phân đoạn) tùy thuộc vào đặc tính của protein bằng các nồng độ
amonium sulfate khác nhau. Việc kết hợp bước tinh chế này với một số phương pháp tinh chế khác như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký lọc gel cho phép thu nhận
được kháng thể với độ tinh sạch mong muốn. Mặt khác, acid caprylic cĩ thể tủa hầu hết các protein trong huyết thanh trừ IgG nên cĩ thể dùng phương pháp này kết hợp với tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hịa để tinh chế kháng thể. Kết quả
tinh sạch bằng phương pháp này cĩ thể lên đến 99 %.
- Phương pháp tinh chế kháng thể qua sắc ký cột protein A hoặc G
Phương pháp sắc ký ái lực bằng cột protein A hoặc G được sử dụng phổ biến trong tinh chế kháng thể vì cĩ tính chọn lọc cao, cĩ thể đạt độ tinh sạch lên đến 99%. Protein A cĩ nguồn gốc từ vách tế bào S. aureus. Protein G cĩ nguồn gốc từ
Streptococcus. Cả hai protein này đều cĩ ái lực rất cao đối với vùng Fc của kháng thể IgG. Mặt khác, ái lực của hai loại protein này đối với kháng thể cịn phụ thuộc vào điều kiện pH nên đặc tính này được ứng dụng để dung ly kháng thể ra khỏi cột.
b. Đánh dấu kháng thể
Trong phản ứng ELISA, kháng thể cần được đánh dấu bằng enzyme hiển thị
và giúp định lượng mức độ hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu thơng qua sự thay đổi màu sắc, sự phát huỳnh quang trong phản ứng được xúc tác bởi enzyme. Sự cộng hợp (gắn cộng hĩa trị) enzyme vào kháng thể là tối ưu khi hiệu suất cộng hợp cao ở những vị trí xác định trên kháng thể và enzyme mà khơng làm mất hoạt tính của kháng thể hay enzyme. Các nhĩm chức trên kháng thể cĩ thể được dùng để gắn cộng hĩa trị với enzyme là:
+ Nhĩm amin bậc 1 (-NH2): hiện diện nhiều nhất ở vùng Fc của kháng thể.
Đây là nhĩm chức được biến đổi dễ dàng, được sử dụng phổ biến nhất trong việc
đánh dấu kháng thể. Các gốc đường trên phân tử enzyme được ơxi hĩa thành nhĩm aldehyde hay cetone, nhĩm này tương tác với nhĩm NH2 trên kháng thể tạo nên một hợp chất trung gian carbinolamine chứa nối NH - C. Do nối NH - C dễ bị
thủy giải nên đơi điện tử từ nhĩm amin sẽ được chuyển vào nối đơn của carbinolamine hình thành nối đơi của phân tử Schiff base. Các tác nhân ơxi hĩa mạnh như periodate, glutaraldehyde thường được dùng để hoạt hĩa các enzyme cĩ bản chất là glycoprotein và hỗ trợ cho sự hình thành Schiff base trong phản ứng cộng hợp kháng thể - enzyme (Hình 1.4.).
Vùng carbohydrate chứa nhĩm cis-diol:vùng này cĩ thể bị ơxi hĩa hình thành nhĩm aldehyde hoạt độ dùng cho mục đích cộng hợp, hiện diện ở vùng Fc. Cộng hợp thơng qua carbonhydrate cần nhiều bước hơn so với cộng in, tu
kháng thể sau khi cộng hợp cĩ hoạt tính cao. ng
hợp am y nhiên
ủ
hoạt tín g
+ Nhĩm sulhydryl (-SH): nằm trong cystein hoặc là kết quả c a quá trình khử cầu nối disulfite ở vùng bản lề của kháng thể, cộng hợp thơng qua sulhydryl cũng cần nhiều bước và cho h khán thể sau cộng hợp cao.
1.6.3. Xây dựng qui trình ELISA sandwich
Enzyme NH2 O C H (CH2)3 C O H Enzyme N CH (CH2)3 C O H Loại bỏ lượng thừa GA NH2 Antibody (CH2)3 C H N Enzyme HC N Antibody
Hình 10. CHình 1.4. ơ chCơ chế hình thành Schiffbase trong phương pháp cộng hợp kháng thể - ế hình thành Schiff base trong phương pháp cộng hợp hai bước dùng GA
enzyme thơng qua nhĩm NH2
+ Vùng carbohydrate chứa nhĩm cis-diol: vùng này cĩ thể bị ơxi hĩa hình thành nhĩm aldehyde hoạt động dùng cho mục đích cộng hợp, hiện diện ở vùng Fc. Cộng hợp thơng qua carbonhydrate cần nhiều bước hơn so với cộng hợp amin, tuy nhiên kháng thể sau khi cộng hợp cĩ hoạt tính cao.
+ Nhĩm sulhydryl (-SH): nằm trong cystein hoặc là kết quả của quá trình khử cầu nối disulfite ở vùng bản lề của kháng thể; cộng hợp thơng qua sulhydryl cũng cần nhiều bước và cho hoạt tính kháng thể sau cộng hợp cao.