CHÍ MINH
3.1.1. Khảo sát tình hình nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM
Để đánh giá mức độ nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM, 450 mẫu thực phẩm thuộc 5 nhĩm thực phẩm khác nhau đã được thu nhận tại TP. HCM (phụ lục 1A). Sự hiện diện của S. aureus trong mẫu được xác định bằng phương pháp nuơi cấy và thử nghiệm sinh hĩa. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm
S. aureus trong thực phẩm tại TP. HCM được tổng hợp trên Bảng 3.1.( Kết quả
chi tiết được trình bày tại phụ lục 1A)
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM
STT Nhĩm mphẩẫm u thực Số mẫu phân tích Số mẫu nhiễm S.aureus (% nhiễm) Mức độ nhiễm (CFU/g thực phẩm) 1 Thịt, cá 210 29 (13,8) 4 – 4,3x104 2 Bánh, kẹo 80 12 (15,0) 4 - 23 3 Thực phẩm từ sữa 50 4 (8,0) 4 – 23 4 Kem 50 6 (12,0) 4 – 93 5 Nước giải khát, gia vị 60 8 (13,3) 43 x 100 – 3,9x104 Tổng cộng 450 59 (13,1)
Trong 450 mẫu thực phẩm thuộc 5 nhĩm thực phẩm đường phốđã thu được cĩ 59 mẫu bị nhiễm S. aureus, chiếm tỷ lệ 13,1%. Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong bánh kẹo đường phố là cao nhất (15%) mặc dù mật độ nhiễm khơng cao (4 – 23CFU/g thực phẩm). Tiếp theo, nhĩm thực phẩm từ thịt cá cĩ tỷ lệ nhiễm (13,8%) với mật độ nhiễm cĩ thể lên đến 4,3x104 CFU/g thực phẩm. Nước giải khát và mẫu gia vị cũng cĩ tỷ lệ nhiễm rất cao (13,3%) với mật độ nhiễm lên đến 2,9x104 CFU/g thực phẩm. Các sản phẩm từ bánh kẹo, sữa, kem cĩ mức độ nhiễm thấp nhất là 4 CFU/g thực phẩm, cao nhất là 23 CFU/g thực phẩm.
So với tiêu chuẩn an tồn vệ sinh thực phẩm về S. aureus của Bộ Y tế, kết quả phân tích trên cho thấy tất cả các mẫu bị nhiễm S. aureus đều cao hơn tiêu chuẩn cho phép, khơng đạt yêu cầu về an tồn vệ sinh thực phẩm. Một số kết quả đã cơng bốở nước khác cho thấy các sản phẩm từ thịt, cá cĩ mức nhiễm thấp nhất từ 7,7x102 cho đến cao nhất là 2,9x104 CFU/g.
Kết quả khảo sát của Normano G., ở Ý năm 2005 [46] cho thấy tỷ lệ các chủng S. aureus nhiễm trong các mẫu thực phẩm là 17,3%., trong đĩ các chủng cĩ nguồn gốc từ sản phẩm thịt, cá chiếm tỷ lệ trung bình là 21%. Ở Ấn Độ, khảo sát của Sneha Susan Simon năm 2007 [58] cho thấy 17% mẫu hải sản bị ơ nhiễm S. aureus trong đĩ tơm đơng lạnh chiếm tỷ lệ ơ nhiễm là 58,3%, mật độ nhiễm từ 1,1 - 9,7 x 102CFU/g, mực ống đơng lạnh chiếm tỷ lệ 20% với mật độ nhiễm từ 6,0- 7,1x102CFU/g và cá philê đơng lạnh bị nhiễm 33,3% với mật độ nhiễm từ 0,72- 2,4x103CFU/g. Theo nghiên cứu của Pesavento G. 2007 [48] tỷ lệ nhiễm S. aureus
trong mẫu thịt chưa chế biến là 23,86%, trong đĩ thịt gia cầm nhiễm 28,57%, thịt bị là 29,41% và thịt heo là 15,15% .
Ở Malaysia khảo sát của Fook Yee Chye , 2004 [24] cho thấy gần 61% các mẫu sữa là dương tính với S. aureus với mật độ nhiễm thấp nhất từ 6,3x103 cho đến 1,8x104 CFU/ml. Nghiên cứu mức độ ơ nhiễm S. aureus của Afshin năm 2006 tại Iran [7] cho thấy 65/127 mẫu cá muối và xơng khĩi là những thực phẩm truyền thống ở nước này bị nhiễm S. aureusở mức 102 - 105 CFU/g.
3.1.2. Tỷ lệ gây ngộ độc thực phẩm bởi S. aureus trong một số vụ ngộđộc thực phẩm tại TP. HCM phẩm tại TP. HCM
Bên cạnh nhĩm mẫu thực phẩm đường phố, 20 mẫu chất nơn từ 4 vụ ngộđộc thực phẩm tại TP. HCM trong năm 2005 và 2006 đã được thu nhận. Các mẫu này
đã được phân tích sự hiện diện của S aureus và kết quả được tổng hợp trên Bảng 3.2.(Kết quả chi tiết được trình bày tại phụ lục 1B).
Bảng 3.2. Tỷ lệ ngộ độc do S. aureus trong một số vụ ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM. Loại mẫu Số mẫu phân tích Số mẫu cĩ S. aureus (%) Mật độS. aureus trong mẫu (CFU/g) Chất nơn từ bệnh nhân bị ngộđộc thực phẩm 20 11 (55,0%) 4,3x10 1 – 3,9x104 Kết quả khảo sát cho thấy 55% mẫu chất nơn từ 4 vụ ngộđộc thực phẩm tại TP. HCM trong 2 năm 2005 và 2006 cĩ sự hiện diện của S. aureus với mật độ cao cĩ thể lên đến 3,9x104 CFU/g. Trong tất cả 4 vụ này cĩ mẫu bị nhiễm S. aureus như
vậy tất cả các vụ ngộđộc thực phẩm này đều cĩ liên quan đến S. aureus.
3.2. XÁC ĐỊNH LOẠI ĐỘC TỐ RUỘT PHỔ BIẾN GÂY NGỘ ĐỘC BỞI
S. AUREUS
3.2.1 Khảo sát khả năng sinh độc tố ruột của các chủng phân lập trên mơi trường TSGM và BHI. trường TSGM và BHI.
S. aureus cĩ thể tạo 5 loại độc tố khác nhau. Để xác định loại độc tố SE nào là nguyên nhân gây ngộ độc phổ biến tạo cơ sở cho việc phát triển phương pháp phát hiện độc tố SE trong thực phẩm, chúng tơi đã tiến hành xác định loại độc tố
SE tạo ra bởi 70 chủng S. aureus được phân lập từ 59 mẫu thực phẩm và 11 mẫu chất nơn do ngộđộc thực phẩm chứa S. aureus. Chủng S. aureusđược nuơi cấy để
xác định khả năng sinh độc tố của chúngtheo thời gian nuơi cấy trên hai loại mơi trường TSGM và BHI. Độc tố tạo thành được xác định bằng phương pháp ELISA sử dụng bộ kít TECRA và được biểu diễn bằng trị số OD405nm.
Ở mơi trường TSGM cĩ 19/70 chủng S. aureus phân lập cĩ khả năng sinh
độc tố ruột, chiếm tỷ lệ 27,1%. Kết quả theo dõi động học tăng trưởng và tạo độc tố của 19 chủng S. aureus trong mơi trường TSGM được minh họa trên Hình 3.1.
Ở mơi trường TSGM, sau 16 giờ nuơi cấy, sự hiện diện của độc tố ruột bắt
đầu được ghi nhận. Lượng độc tố tăng dần theo thời gian nuơi cấy. Mặt khác, sự
tăng trưởng của chúng đạt cực đại sau 16 giờ, sau đĩ chuyển đi vào pha ổn định. Như vậy, cĩ thể kết luận rằng ở mơi trường TSGM, các chủng S. aureus cĩ khả
năng sinh độc tố và sẽ tạo độc tố khi quần thể tế bào vi khuẩn vào giai đoạn cuối của pha tăng trưởng hàm mũ và đi vào pha ổn định.
5 7.86 8.27 8.25 7.77 0 1.54 1.84 2.11 2.3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 16 24 48 72 Thời gian (giờ) T ă ng t r ưở ng ( logC F U /m l 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Tăng trưởng (logCFU/ml) Độc tố (OD405nm)
Hình 3.1. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus trong mơi trường TSGM
Ở mơi trường BHI cũng chỉ cĩ 19/70 chủng S. aureus cĩ khả năng sinh độc tố, chiếm tỷ lệ 27,1%. Kết quả theo dõi động học tăng trưởng và tạo độc tố của 19 chủng S. aureus ở mơi trường BHI được minh họa trên Hình 3.2.
Tương tự như ở mơi trường TSGM, ở mơi trường BHI quần thể tế bào vi khuẩn bắt đầu đi vào pha ổn định sau 16 giờ nuơi cấy và sự hình thành độc tố bắt
đầu được ghi nhận. Lượng độc tốđược tạo ra tăng dần theo thời gian. Tuy nhiên,
ở mơi trường BHI lượng độc tố tạo ra cao hơn so với mơi trường TSGM (ở thời
điểm 24 giờ và 48 giờ).
Kết quả nghiên cứu của Soejima T., và cs năm 2007 [59]tại Nhật cho thấy khi nhiễm S. aureus vào mẫu sữa với mật độ 1 logCFU/ml, sau 10 giờ lưu giữ
mẫu ở 35oC đậm độ vi khuẩn đạt mức 7,3 logCFU/ml và lượng độc tốđo được với OD405nm=1,6.
4.98 8.03 8.19 7.88 7.55 0 1.62 1.98 2.19 2.37 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 16 24 48 72 Thời gian (giờ) T ă ng t r ưở ng ( log C F U /m l 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Tăng trưởng (logCFU/ml) Độc tố (OD405nm)
Hình 3.2. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus trong mơi trường BHI
Kết quả khảo sát của luận án này cũng cho thấy khi gây nhiễm chủng S. aureus mang gen entA, với mật độ 1 logCFU/g (ml) vào một số thực phẩm và lưu giữở nhiệt độ phịng thì ở trường hợp sữa chua vi khuẩn hầu như khơng phát triển và khơng tạo độc tố sau 72 giờ lưu mẫu. Ở các trường hợp sữa tươi, patê gan, vi khuẩn phát triển nhanh. Tuy nhiên, trên mỗi loại thực phẩm này sự phát triển và khả năng sinh độc tố cũng khác nhau: vào thời điểm 24 giờ, vi khuẩn đạt đậm độ
6,65 log CFU/ml và độc tố OD=0,258 ở mẫu patê gan và 7,85 logCFU/ml, OD=1,259 ở mẫu sữa tươi. Như vậy khi bị nhiễm S. aureus dù ở mật độ ban đầu thấp (10CFU/g), thực phẩm để ở nhiệt độ phịng, khơng được bảo quản ở trong lạnh cĩ thể bị ngộđộc do sự tăng trưởng của S. aureus và tạo độc tố.
3.2.2. Xác định loại độc tố SE bằng phương pháp ELISA
Độc tố được tạo ra bởi 19 chủng S.aureus cĩ khả năng sinh độc tố trên mơi trường TSGM và BHI được xác định các loại độc tố bằng kỹ thuật ELISA sử
dụng bộ kít TECRA SET ID. Trong trường hợp này, các chủng được nuơi cấy trên
mơi trường BHI, thu nhận canh trường, ly tâm loại tế bào và thu dịch nổi để định loại độc tố. Kết quảđược trình bày trên Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả định loại độc tố SE được tổng hợp bởi 19 chủng S. aureus phân lập từ thực phẩm và bệnh phẩm STT Mã số chủng Loại độc tố STT Mã số chủng Loại độc tố 1 M168/05 SEA 11 F72/06 SEB 2 N88/05 SEA 12 H29/05-KHTN SEB 3 V29/05 SEA 13 H100/05-KHTN SEB 4 V30/05 SEA 14 H79/05-KHTN SEB 5 M73/05 BVND SEA 15 H76/05-KHTN SEB 6 M156/05 SEA 16 H120/05-KHTN SEC 7 Tkk/GS/06 SEB 17 19058/06 SEB
8 E2/NĐ06 SEA 18 19153/06 SEB
9 M69/05-BVNĐ SEA 19 18898/06 SEA
10 G147/05 SEA
Bảng 3.3 cho thấy số chủng S. aureus sinh độc tố SEA là 10/19 chủng (chiếm tỉ lệ 52,6%) SEB là 8/19 chủng (chiếm tỷ lệ 42,1%) và SEC là 1/19 chủng (chiếm tỷ lệ 5,3%). Khơng phát hiện chủng nào sinh độc tố SED và SEE. Như vậy gần 95%
độc tố SE được tạo ra bởi các chủng S. aureus nhiễm trong thực phẩm tại TP. HCM là SEA và SEB. Kết quả này phù hợp với một số báo cáo trước đây là SEA, SEB là hai loại độc tố thường gặp trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ở một số
nước [11] [21] [63]. Đặc biệt độc tố SEA cĩ tần suất cao nhất trong các mẫu thực phẩm cĩ thể lên đến 61,5%. Tuy nhiên, các kết quả khảo sát khác lại cho thấy độc tố SE phổ biến nhất cĩ thể khơng phải là SEA và SEB. Một số kết quả khảo sát
được trình bày sau đây.
- Tay và cộng sự [45] cho thấy tần suất sinh độc tố SE ở 33 chủng S. aureus
phân lập từ thực phẩm nước giải khát và thức ăn nhanh tại Singapore năm 1992 là như sau 12% SEA, 40% SEB, 24% SEC, 18% SED và 6% SEA-C.
- Rosec và cộng sự đã phân tích tần suất sinh độc tố SE từ 55/213 chủng S. aureus phân lập từ mẫu thực phẩm và mẫu chất nơn tại Pháp năm 1996 cho kết quả
là 18% SEA, 11% SEB, 67% SEC, 4% SED [52].
- Năm 1998, Fang và cộng sự[30]đã xác định loại độc tố tạo ra bởi 17/36 chủng phân lập từ thực phẩm cĩ nguồn gốc thực vật với kết quả như sau: 34% SEA, 6% SEB, 6% SEC, 18% SED, 12% SEA-B, 24% SEA-D.
- Kết quả xác định loại độc tố tạo ra bởi 36/136 chủng S. aureus phân lập từ sữa bị bán thành phẩm tại Na Uy năm 2005 cho thấy hầu như khơng cĩ SEA, 6% SEB, 77% SEC, 11% SED và 6% SEA-C [38].
- Tại Ý, năm 2007, Morandi S.và cộng sự [43] đã đã xác định độc tố SE tạo ra bởi 58/66 chủng S. aureus phân lập từ sữa (bị, dê cừu, trâu) và các sản phẩm từ sữa cho kết quả là 31% SEA, 26% SEC, 19% SED, 19% SEA-D và 1,7% SEA-B.
Như vậy, loại độc tố SE gây ngộ độc thực phẩm tại các nước khác nhau là khác nhau. Trong trường hợp của Việt Nam, từ 470 mẫu thực phẩm và chất nơn do ngộđộc thực phẩm chúng tơi đã xác định các chủng S. aureus phân lập cĩ khả năng sinh độc tố SEA và SEB là phổ biến.
3.2.3. Xác định loại độc tố SE phổ biến bằng phương pháp multiplex-PCR nhân bản sao các gen mã hĩa độc tố nhân bản sao các gen mã hĩa độc tố
Để khẳng định thêm loại độc tố tạo ra bởi các chủng S. aureus cĩ khả năng sinh độc tố ruột được phân lập từ các mẫu thực phẩm và mẫu chất nơn do ngộđộc thực phẩm tại TP. HCM đã được xác định bằng phương pháp ELISA ở phần trên, chúng tơi sử dụng phương pháp multiplex-PCR với 5 cặp mồi nhân bản sao vùng trình tự của 5 gen entA, entB, entC, entD, entE mã hĩa cho 5 loại độc tố tương
ứng. Phản ứng multiplex-PCR và 5 cặp mồi tương ứng được tham khảo từ cơng trình của David [49]. Tuy nhiên, trước khi áp dụng qui trình multiplex-PCR này, chúng tơi tiến hành kiểm tra khả năng nhân bản sao và độ đặc hiệu của các cặp mồi. Kết quảđược tổng hợp trên Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra khả năng nhân bản và độ đặc hiệu của 5 cặp mồi nhân bản sao 5 gen mã hĩa 5 loại độc tố SE bằng phản ứng multiplex-PCR.
TT Chủng vi khuẩn Sản phẩm PCR (bp)
TT Chủng vi khuẩn Sản phẩm PCR (bp)
1 S. aureus ATCC29213 (mang gen entA)
120 6 E. coli ATCC 259 -
2 S. aureus ATCC14458 (mang gen entB)
476 7 Salmonella
typhimurium -
3 S. aureus ATCC19095 ( mang gen entC)
257 8 Shigella dysenteria -
4 S. aureus ATCC23235 (mang gen entD)
317 9 Vibrio cholerae
Inaba NIH35
-
5 S. aureus ATCC27644 (mang gen entE)
170 10 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 - 11 Pseudomonas aeruginosa -
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy trường hợp S. aureus ATCC29213 mang gen
entA, sản phẩm PCR là dương tính với một vạch 120 bp của gen entA. Tương tự ,
ở trường hợp S. aureus ATCC14458 mang gen entB, một vạch sản phẩm PCR
được phát hiện cĩ kích thước 476 bp; trường hợp S. aureus ATCC19095 mang gen entC cho vạch sản phẩm 257bp; S. aureus ATCC23235 mang gen entD cho vạch 317bp và S. aureus ATCC27644 cho vạch sản phẩm 170bp. Các sản phẩm PCR này đều cĩ kích thước đúng như đã thiết kế. Khơng cĩ sản phẩm PCR ký sinh khác ở 5 trường hợp này. Kết quả này xác nhận 5 cặp mồi đã sử dụng cho phép nhân được bản sao một cách đặc hiệu của 5 gen tương ứng. Mặt khác, ở 6 trường hợp vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm khác khơng phải là S. aureus như
E. coli ATCC25922, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteria, Vibrio cholerae Inaba NIH35, Vibrio parahaemolyticus ATCC17802, và Pseudomonas
aeruginosa, khơng cĩ trường hợp nào cho sản phẩm PCR cĩ kích thước đã thiết kế. Kết quả này cho phép khẳng định 5 cặp mồi đã sử dụng trong phản ứng multiplex-PCR là chuyên biệt cho S.aureus, khơng cho sản phẩm PCR ở vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm khác (xem chi tiết hình ảnh điện di ở phụ lục 4).
Như vậy cĩ thểứng dụng qui trình multiplex-PCR 5 cặp mồi nhân bản 5 gen
entA, entB, entC, entD và entE của David để kiểm chứng một cách gián tiếp loại
độc tố do chủng S. aureus cĩ thể tạo ra thơng qua việc phát hiện gen mã hĩa độc tố tương ứng. Kết quả kiểm chứng được trình bày trên Bảng 3.5 và Hình 3.3 cho thấy trong số 70 chủng S. aureus đã phân lập chỉ cĩ 19/70 chủng cĩ mang gen mã hĩa độc tố, phù hợp với kết quả xác định khả năng sinh độc tố bằng phương pháp ELISA trên Bảng 3.3.
Mặt khác, kết quả xác định gen mã hĩa độc tố của từng chủng trong 19 chủng này bằng phản ứng multiplex-PCR cho thấy cĩ 10 chủng mang gen entA
mã hĩa SEA, 8 chủng mang gen entB mã hĩa SEB và 1 chủng mang gen entC mã