a. Tủa phân đoạn bằng amonium sulfate bão hịa
Kháng thể trong kháng huyết thanh được tinh chế qua các bước sau đây: Kháng huyết thanh được pha lỗng trong dung dịch PBS 1X theo tỷ lệ 1:2. Bổ sung từng giọt ammonium sulfate bão hịa vào dung dịch kháng huyết thanh được khuấy trộn nhẹ bằng máy khuấy từ cho đến khi nồng độ cuối cùng của ammonium sulfate trong hỗn hợp đạt 50%. Ly tâm thu tủa ở 3.000 vịng/phút trong 30 phút ở 4oC. Tủa
được hịa lại trong dung dịch ammonium sulfate bão hịa 50%, với tỷ lệ bằng ½ thể
tích ban đầu.
b. Loại muối bằng cột PD10
Trộn 500μl kháng huyết thanh đã tủa ở trên với 1,5ml wash buffer 1X. Cột loại muối PD10 được cân bằng cột bằng 20ml wash buffer. Nạp 2ml mẫu vào cột. Rửa cột bằng 5ml wash buffer, loại bỏ 2ml dung dịch qua cột chứa muối và thu nhận 5ml dung dịch rửa chứa kháng thểđã loại muối.
c. Tinh chế kháng thể bằng cột protein A
- Cân bằng cột protein A bằng 10ml wash buffer 1X. Nạp 5ml dung dịch kháng thể đã loại muối vào cột. Rửa cột bằng 10ml wash buffer 1X. Bổ sung 5ml dung dịch dung giải và giữ trong khoảng 7-10 phút bằng cách khĩa cột. Thu nhận dung dịch dung giải chứa kháng thể vào ống falcon cĩ chứa sẵn 2ml Tris HCl 1M pH = 9,0. Lặp lại nhiều lần quá trình tinh chế như trên cho đủ lượng kháng thể cần dùng đểđánh dấu.
Mẫu kháng thể sau tinh chế được cơ đặc bằng cột Amicon MWCO 100kDa ở
4oC đến khi cịn khoảng 200 - 250μl. Bổ sung 700μl PBS 5X; tiếp tục cơ đặc cho
đến khi cịn 200 - 250μl mẫu. Chuyển dung dịch kháng thể cơ đặc này vào eppendorft và bảo quản kháng thể cơ đặc ở -30oC cho đến khi dùng.
2.2.8. Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể bằng phương pháp điện di SDS- PAGE .
Độ tinh sạch của kháng thể sau khi tinh chếđược kiểm tra bằng phương pháp
điện di SDS-PAGE với gel polyacrylamide 12,5% kích thước 100 x 100 x 0,75mm. Pha chế dung dịch gel phân tách (Separating gel) chứa SDS cĩ thành phần 1480µl nước cất, 1110µl acrylamide 40%, 875µl Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 35µl Sodium dodecyl sulfat 10%, 17,5µl ammonium persulfate 10% và 1,4µl TEMED. Lắc đều hỗn hợp rồi dùng micropipette bơm dung dịch vào khuơn gel sao cho mức dung dịch cao khoảng 6cm. Sau đĩ, bơm nhẹ nhàng một lớp nước cất lên trên lớp gel vừa
đổ. Để yên đến khi gel đơng. Chuẩn bị dung dịch gel gom (Stacking gel) cĩ thành phần 650µl nước cất, 100µl acrylamide 40%, 252,5µl Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 10µl sodium dodecyl sulfate 10%, 5µl ammonium persulfate 10% và 1µl TEMED. Bơm dung dịch gel gom vào khuơn lên trên lớp gel phân tách đã đơng, đồng thời gắn lược vào. Mẫu kháng thể được làm biến tính bằng cách trộn với 1 dung tích dung dịch nạp mẫu 1X ở 100oC trong 10 phút; giữ ở 4oC trong 5 phút. Nạp mẫu vào giếng trên gel và tiến hành điện di ở điện thế 220V, 2mA/giếng. Nhuộm gel trong dung dịch Coomasie 30 phút, sau đĩ giải nhuộm cho đến khi bản gel trong. Chụp hình điện di.
2.2.9. Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford.
- Thiết lập 2 loạt ống nghiệm, mỗi loạt 6 ống được đánh số theo thứ tự 0a, 0b, 1a, 1b, …, 5a, 5b. Bổ sung các chất vào ống nghiệm như Bảng 2.2.
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút. Bổ sung 5ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a (t=0). Lắc đều, để yên.
Bảng 2.2. Bố trí thực hiện dựng đường chuẩn bằng phươg pháp Bradford
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch albumin 0,1 mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Ở thời điểm 1 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào ống nghiệm 0b. Lắc
đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5ml dung dịch thuốc thử tuần tự vào các ống 1a, 1b, 2a, 2b… ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời điểm 11 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào ống 6b. Lắc đều, để yên. Tính thời gian ống 0a được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sĩng 595nm (0D595). Tính thời gian ống 0b được 21 phút, tiến hành đo OD595 ở bước sĩng 595 nm. Tuần tự tiến hành đo OD595 của các ống cịn lại tại các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời
điểm 31 phút tiến hành đo ống 6b. Lấy giá trị trung bình của hai ống a và b. Lấy giá trị OD595 nm của ống thử thật (cĩ protein) trừ OD595 của ống thử khơng (khơng cĩ protein) được ∆OD595 nm. Vẽđường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật
độ quang (∆OD595) để cĩ được đường chuẩn.
- Nồng độ kháng thểđược xác định dựa vào đường chuẩn như sau đây: lấy 2
ống nghiệm sạch, khơ (X1, X2). Pha lỗng kháng thể sau tinh chế 103 lần trong nước cất. Hút 1ml dung dịch mẫu pha lỗng vào ống nghiệm. Bổ sung dung dịch thuốc thử Bradford và ủ chính xác trong 30 phút. Đo OD595nm của mẫu, lấy giá trị ∆OD595nm bằng cách trừ giá trị OD của ống thử khơng. Lấy giá trị trung bình của 2 lần đo. Chiếu lên đường chuẩn để suy ra nồng độ kháng thể.
2.2.10. Đánh dấu kháng thể kháng độc tố A và B với enzyme HRP
Hoạt hĩa enzyme HRP (horse-radish peroxidase) bằng cách hịa 10mg HRP trong 0,2 ml dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 6,8, bổ sung 0,8µl dung dịch glutaraldehyde, ủ 18 giờ ở nhiệt độ phịng. Loại bỏ lượng thừa GA và chuyển sang dung dịch NaCl 0,9% bằng màng lọc Amicon cĩ MWCO 30kDa. Ly tâm ở 5.000 vịng/ phút, trong 10 phút. Hịa 5mg kháng thể kháng SEA hoặc SEB vào 0,2ml
dung dịch carbonate 0,1M pH 9,5 và thực hiện phản ứng cộng hợp với HRP đã hoạt hĩa bằng GA trong 24 giờ ở 4oC. Dừng phản ứng cộng hợp bằng cách bổ sung 100µl dung dịch lysine 1M pH 7. Loại bỏ HRP thừa bằng màng lọc Amicon cĩ MWCO 100 kDa và loại bỏ các kháng thể kháng SEA hoặc SEB chưa đánh dấu HRP bằng cột Con-A (Amersham, Anh). Lọc dung dịch kháng thể đã đánh dấu qua qua màng lọc 0,22µm và bảo quản trong glycerol 20% ở -30oC.
2.2.11. Phương pháp ELISA trực tiếp phát hiện SEA, SEB bằng kháng thểcộng hợp HRP cộng hợp HRP
Độc tố SEA hoặc SEB được pha lỗng để đạt nồng độ 100ng/ml trong dung dịch phủ giếng. Phủ kháng nguyên các giếng trên các hàng 1 và 2. Ủở 37oC trong 2 giờ. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Bổ sung vào tất cả các giếng 100µl sữa gầy 5%. Ủ ở 4oC trong 30 phút. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Kháng thể cộng hợp HRP được pha lỗng trong Wash buffer. Các cột từ A đến H được ủ với 100µl kháng thể cĩ độ
pha lỗng bậc hai từ 1/100 đến 1/12.800. Ủ trong máy lắc ổn nhiệt trong 1 giờ ở
25oC. Rửa bằng Wash buffer 5 lần. Bổ sung 100µl cơ chất ABTS vào tất cả các giếng. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. Bổ sung 100µl H2SO4 2M để làm dừng phản ứng. Đo cường độ màu bằng máy đo OD ở bước sĩng 405nm. Lấy trị số trung bình cộng kết quả của 2 giếng cùng cột.
2.2.12. Kiểm tra phản ứng chéo của kháng thể cộng hợp HRP
Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng SEA và SEB được kiểm tra bằng phương pháp ELISA sandwich theo qui trình sau đây: Bổ sung 100µl dung dịch kháng thể
kháng thể SEA hoặc SEB nồng độ 20µg/ml trong dung dịch phủ giếng vào mỗi giếng. Ủở nhiệt độ phịng trong 3 giờ. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Bổ sung vào tất cả các giếng 100µl sữa gầy 5%. Ủ ở 4oC trong 30 phút. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Bổ sung 100µl độc tố SEA ở nồng độ 100ng/ml vào giếng được phủ bởi kháng thể kháng SEB. Bổ sung 100µl độc tố SEB 100ng/ml vào giếng đã phủ bằng kháng thể kháng SEA. Ủ ở 37oC trong 2 giờ. Rửa bằng Wash buffer 4 lần. Bổ sung 100µl kháng thể cộng hợp HRP vào mỗi giếng. Ủ ở 25oC trong 1 giờ. Rửa bằng Wash buffer 5 lần. Bổ sung 100µl dung dịch ABTS vào tất cả các giếng. Ủ ở nhiệt độ
phịng trong 30 phút. Bổ sung thêm 100µl H2SO4 2M để làm dừng phản ứng. Đo cường độ màu bằng máy đo OD ở bước sĩng 405nm.
2.2.13. Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB trong thực phẩm phẩm
Tiến hành xây dựng qui trình ELISA sandwich để phát hiện SEA, SEB trong thực phẩm bằng cách thực hiện các khảo sát nhằm xác định các thơng số tối ưu của qui trình. Các thơng sốđược khảo sát được thực hiện như dưới đây:
- Dung dịch đệm dùng để phủ giếng
Kháng thể kháng SEA hoặc SEB được pha lỗng thành 20µg/ml trong các dung dịch đệm PBS pH 7,2; carbonate buffer pH 7,2; Tris pH 8,5; Carbonate buffer pH 9,5 với thể tích 100µl. Ủở nhiệt độ phịng trong 3 giờ. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Khĩa giếng bằng 100µl sữa gầy 5%. Ủ ở 4oC trong 30 phút. Rửa bằng Wash buffer 3 lần. Bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch kháng nguyên 20ng/ml trong PBS buffer. Ủ ở 37oC trong 2 giờ. Rửa bằng wash buffer 4 lần. Ủ với kháng thể
cộng hợp HRP và thực hiện các thao tác tạo màu như mơ tả thực hiện 2 giếng cho mỗi trường hợp để lấy giá trị trung bình cộng.
- Tác chất khĩa giếng
Khảo sát các tác chất khĩa giếng khác nhau là sữa gầy 1% và 5%; casein 0,5% và 1%; gelatin 0,5% và 1%. Thực hiện phương pháp ELISA sandwich tương tự như trên với dung dịch phủ giếng được chọn.
- Nồng độ kháng thể thích hợp
Nồng độ kháng thể được khảo sát bao gồm 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 1µg/ml trong dung dịch phủ giếng. Thực hiện phương pháp ELISA sandwich với dung dịch
đệm phủ giếng, tác chất hĩa giếng đã được chọn. Từ kết quả thu được chọn nồng độ
kháng thể thích hợp cho các bước khảo sát tiếp theo.
- Thời gian ủ kháng thể
Thực hiện phương pháp ELISA sandwich ở điều kiện dung dịch đệm phủ
giếng, tác chất khĩa giếng, lượng kháng thể đã được chọn. Tuy nhiên, thời gian ủ
kháng thểđược nghiên cứu là 3 giờ, 2 giờ hoặc 4oC qua đêm. Từ kết quả thu được sẽ chọn được thời gian thích hợp nhất cho bước cốđịnh kháng thể.
- Thời gian ủ với kháng nguyên
Thực hiện phương pháp ELISA sandwich ởđiều kiện dung đệm phủ giếng, tác chất khĩa giếng, nồng độ và thời gian ủ kháng thể đã được chọn. Tuy nhiên trong bước ủ kháng nguyên thời gian ủđược nghiên cứu là 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Từ kết quả
thu được ta chọn ra được thời gian ủ với kháng nguyên tối ưu dùng để tiến hành khảo sát các bước tiếp theo.
- Thời gian ủ với kháng thể cộng hợp HRP
Thực hiện phương pháp ELISA sandwich với các điều kiện kiện đã chọn ở
trên. Tuy nhiên trong bước ủ với kháng thể cộng hợp, khảo sát ba thời gian ủ là 30 phút, 60 phút và 90 phút để chọn được thời gian ủ kháng thể cộng hợp tối ưu. Từ
các kết quả khảo sát trên đề xuất qui trình ELISA sandwich để phát hiện độc tố
SEA, SEB trong thực phẩm.
- Xác định giới hạn phát hiện của qui trình ELISA sandwich
Thực hiện qui trình ELISA sandwich đã đề xuất. Ủ với độc tố ở các nồng độ
khác nhau là 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 ng/ml. Từ kết quả này kết luận giới hạn nồng
độđộc tốđược phát hiện bởi qui trình ELISA sandwich đề xuất.
- Xác định giá trị OD ngưỡng để kết luận kết quả xét nghiệm của qui trình ELISA sandwich
Thực hiện qui trình ELISA sandwich đề xuất với 30 mẫu chứng âm. Đo giá trị OD và định giá trị trung bình và SD. Giá trị OD ngưỡng (ODcutoff) cộng với 3 lần SD, nếu OD mẫu > ODcutoff thì kết luận dương tính (cĩ độc tố); nếu OD mẫu
ODcutoff thì kết luận âm tính (khơng cĩ độc tố). ≤
2.2.14. Đánh giá qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA/SEB
Qui trình ELISA sandwich đã thiết lập được đánh giá so sánh với bộ kit TECRA theo phương pháp đánh giá phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu được cơng nhận rộng rãi trên thế giới [29]. Gây nhiễm S. aureus ATCC 29213 cĩ khả năng sinh độc tố SEA hoặc S. aureus ATCC 14458 sinh độc tố SEB
vào các mẫu thực phẩm khác nhau đã được đồng nhất với lượng tế bào trong 25g hoặc 25ml thực phẩm trong 225ml mơi trường đệm phosphate là 10 CFU/ml (g) bao gồm: sữa tươi, sữa chua, pate, thịt xíu mại. Mẫu sau được ủ ở 4oC hoặc nhiệt độ
phịng trong 72 giờ. Tiến hành thu mẫu vào các thời điểm 4 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 44 giờ, 72 giờ. Dịch canh khuẩn được ly tâm 6.000 vịng trong 5 phút ở 40C. Thực hiện xét nghiệm ELISA bằng qui trình ELISA sandwich đã đề xuất và qui trình sử dụng bộ kít TECRA (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Kết quảđược xử lý và đưa vào Bảng 2.3 đểđánh giá các thơng số của qui trình ELISA đề xuất.
Bảng 2.3. Xử lý kết quả đánh giá qui trình ELISA sandwich so với qui trình ELISA của TECRA [1].
Qui trình ELISA sandwich
Qui trình ELISA tham chiếu (TECRA)
Số kết quả (+) Số kết quả (-)
Số kết quả (+) A B
Số kết quả (-) C D
Các thơng số kỹ thuật tương đối của qui trình ELISA sandwich so với qui trình tham chiếu được tính như sau:
- Độ nhạy (sensitivity) tương đối: C A A Se + = - Độđặc hiệu (specificity) tương đối: D B D Sp + =
- Tỷ lệ âm tính giả (false negative) tương đối:
) (A C C FN + =
- Tỷ lệ dương tính giả (false posity) tương đối:
) (B D B FP + = Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc
- Độ phù hợp (test effiency) của qui trình ELISA sandwich và qui trình tham chiếu: ) (A B C D D A + + + + = TE
Để qui trình ELISA sandwich cĩ kết quả phù hợp với qui trình ELISA của TECRA, các thơng số kỹ thuật cần đạt được là Se≥ 98%, Sp ≥ 90,4%, FN <2%, FP
< 9,6%, TE≥ 94% [29].
CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM S. AUREUS TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ VÀ TỶ LỆ GÂY NGỘĐỘC BỞI S. AUREUS TẠI TP. HỒ ĐƯỜNG PHỐ VÀ TỶ LỆ GÂY NGỘĐỘC BỞI S. AUREUS TẠI TP. HỒ CHÍ MINH
3.1.1. Khảo sát tình hình nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM
Để đánh giá mức độ nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM, 450 mẫu thực phẩm thuộc 5 nhĩm thực phẩm khác nhau đã được thu nhận tại TP. HCM (phụ lục 1A). Sự hiện diện của S. aureus trong mẫu được xác định bằng phương pháp nuơi cấy và thử nghiệm sinh hĩa. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm
S. aureus trong thực phẩm tại TP. HCM được tổng hợp trên Bảng 3.1.( Kết quả
chi tiết được trình bày tại phụ lục 1A)
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM
STT Nhĩm mphẩẫm u thực Số mẫu phân tích Số mẫu nhiễm S.aureus (% nhiễm) Mức độ nhiễm (CFU/g thực phẩm) 1 Thịt, cá 210 29 (13,8) 4 – 4,3x104 2 Bánh, kẹo 80 12 (15,0) 4 - 23 3 Thực phẩm từ sữa 50 4 (8,0) 4 – 23 4 Kem 50 6 (12,0) 4 – 93 5 Nước giải khát, gia vị 60 8 (13,3) 43 x 100 – 3,9x104 Tổng cộng 450 59 (13,1)
Trong 450 mẫu thực phẩm thuộc 5 nhĩm thực phẩm đường phốđã thu được cĩ 59 mẫu bị nhiễm S. aureus, chiếm tỷ lệ 13,1%. Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong bánh kẹo đường phố là cao nhất (15%) mặc dù mật độ nhiễm khơng cao (4 – 23CFU/g thực phẩm). Tiếp theo, nhĩm thực phẩm từ thịt cá cĩ tỷ lệ nhiễm (13,8%) với mật độ nhiễm cĩ thể lên đến 4,3x104 CFU/g thực phẩm. Nước giải khát và mẫu gia vị cũng cĩ tỷ lệ nhiễm rất cao (13,3%) với mật độ nhiễm lên đến