a. Ly trích DNA
Chuyển 0,5ml canh khuẩn S. aureus (hoặc các chủng vi khuẩn khác) được tăng sinh trong mơi trường TSB ở 37oC trong 24h vào eppendorf, đun sơi ở 100oC trong 5 phút và ly tâm lạnh 13.000 vịng ở 4oC trong 7 phút. Dịch nước nổi được sử
dụng làm khuơn DNA cho phản ứng PCR. 2 μl dịch nổi được dùng với 48μl multiplex-PCR mix để thực hiện phản ứng PCR.
b. Chương trình multiplex-PCR và phân tích sản phẩm PCR
Phản ứng multiplex-PCR được thực hiện trong dung tích 50μl (như trên) với chương trình nhiệt như sau: (i) biến tính DNA ở 950C trong 3 phút; (ii) thực hiện 40 chu kỳ phản ứng PCR, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: 940C trong 35 giây, 550C trong 30 giây, 720C trong 60 giây; (ii) ủở 720C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trong gel agarose 2% với dung dịch đệm TAE 1X cĩ bổ sung ethidium bromide trước khi sử dụng. Trộn 15μl sản phẩm phản ứng PCR với 5μl
đệm nạp mẫu 5X, sau đĩ nạp vào giếng điện di. Thực hiện điện di ở điện thế 135V trong 20 phút. Soi gel và chụp ảnh bằng đèn UV cĩ bước sĩng 312nm với hệ thống chụp ảnh Gel/Chemi Doc của hãng BioRad. Nếu xuất hiện các vạch cĩ chiều dài 120bp thì kết luận là cĩ gen entA mã hĩa độc tố ruột SEA; tương tự, cĩ vạch 476bp thì kết luận cĩ gen entB mã hĩa SEB; cĩ vạch 257bp thì kết luận cĩ gen entC mã
hĩa SEC; cĩ vạch 317bp thì kết luận cĩ gen entD mã hĩa SED và cĩ vạch 170bp thì kết luận cĩ gen entE mã hĩa SEE.
c. Khảo sát độđặc hiệu của các cặp mồi
Độ đặc hiệu của 5 cặp mồi SEA1-SEA2, SEB1-SEB2, SEC1-SEC2, SED1- SED2 và SEE1-SEE2 dùng trong phản ứng nhân bản sao lần lượt của các gen entA, entB, entC, entD và entE được kiểm chứng bằng cách thực hiện phản ứng multiplex-PCR sử dụng 5 cặp mồi này với khuơn DNA từ các vi khuẩn khác như
E. coli ATCC25922, Salmonella typhimurium,Shigella dysenteria., Vibrio cholerae
Inaba NIH35, Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 và Pseudomonas aeruginosa. Nếu cĩ sự xuất hiện của một trong các vạch cĩ kích thước 120bp, 475bp, 257bp, 317bp hoặc 170bp thì kết luận cặp mồi tương ứng cho sản phẩm PCR dương tính giả với vi khuẩn được khảo sát. Điều kiện của phản ứng multiplex-PCR là tương tự
như mục b nêu trên.
2.2.6. Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ và kiểm tra hiệu giá kháng huyết thanh
Thỏ 2 - 3 kg được cung cấp từ Viện Pasteur TP.HCM được sử dụng cho các thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch. Trước khi tiêm, thu máu nền để kiểm chứng khẳng định thỏ khơng cĩ kháng thể kháng SEA, SEB. Độc tố SEA, SEB được nhũ
tương hĩa trong tá chất trước khi tiêm theo hướng dẫn của Fredderick M và Anon
[8] [10] như sau: chuẩn bị nhũ tương kháng nguyên độc tố với tá chất CFA hoặc IFA bằng cách trộn đều dung dịch CFA (hoặc IFA) và dịch chứa kháng nguyên (1v:1v) trong một sering thủy tinh cho đến khi tạo thành một nhũ tương keo. Kiểm tra chất lượng nhũ tương bằng cách chuyển một giọt nhũ tương lên bề mặt đá lạnh, nếu giọt nhũ tương khơng tan chảy là đạt yêu cầu. Tuy nhiên, gây đáp ứng miễn dịch bằng cách tiêm dưới da thỏ nhũ tương kháng nguyên với CFA (100µl nhũ
tương chứa 150ng SE và 10µl CFA trong dung dịch PBS). Sau 4 tuần thực hiện tiêm nhắc lại lần 1 (tiêm bắp) nhũ tương kháng nguyên với IFA (100µl nhũ tương chứa 150ng SE và 10µl CFA trong dung dịch PBS). Sau 2 tuần, thực hiện tiêm nhắc lại lần 2 bằng cách tiêm dưới da kháng nguyên khơng cĩ chứa adjuvant (100µl PBS
chứa 200ng SE). Sau 10 ngày, thực hiện thu máu, tách huyết tương. Máu sau khi thu được ủở 37oC trong 30 phút để kiểm tra hiệu giá kháng thể. Nếu nồng độ huyết thanh pha lỗng 1/4 cĩ tạo ngưng kết với SEA hoặc SEB ở nồng độ 2 µg/ml thì huyết thanh là đạt yêu cầu và tiến hành lấy máu từ tim để tách huyết thanh dùng cho tinh chế. Huyết thanh trước khi tinh chế được bảo quản ở -30oC, cĩ bổ sung thêm 0,02% sodium azid.
Hiệu giá của kháng huyết thanh được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên gel. Chuẩn bị bản gel agarose 1,5% bằng cách đun agarose trong nước cất cho tan chảy hồn tồn; chuyển 15ml dung dịch agarose lên bề mặt lam kính sạch (75 x 50mm, độ dày 0,96mm), dùng một ống trụ rỗng bằng thép khơng gỉđểđục các lỗ cĩ
đường kính 8mm trên bản gel, mỗi lỗ cách nhau 2cm. Trong đĩ một lỗở ngay trung tâm bản gel (lỗ số 7), sáu lỗ cịn lại bao quanh lỗ trung tâm được đánh số từ 1 đến 6. Kháng nguyên SEA hoặc SEB được pha ở nồng độ 2µg/ml trong dung dịch đệm PBS. Hút 50µl dung dịch kháng nguyên chuyển vào lỗ trung tâm (số 7). Kháng huyết thanh thỏ thu được sau 2 tuần, 4 tuần và 5 tuần được pha lỗng bậc hai thành các nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 sẽđược chuyển 50µl tuần tự vào các lỗ từ 1
đến 6 (Hình 2.2). 2 4 7 1 6 5 3
Hình 2.2. Bố trí mẫu trong phương pháp khuếch tán trong gel
Kháng huyết thanh ở các nồng độ tuần tự 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 Giếng 7, Độc tố nồng độ 2 µg/ml
Đặt bản gel vào một hộp trên miếng giấy thấm cĩ thấm nước để tạo độ ẩm cho bản gel trong thời gian 24 giờ. Ngâm bản gel trong dung dịch PBS cĩ bổ sung merthiolate trong 48 giờ ở nhiệt độ phịng. Làm khơ bản gel ở nhiệt độ 37oC qua
đêm. Ngâm bản gel trong dung dịch thuốc nhuộm Coomasie trong 7 phút. Rửa nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm trong thời gian 7 phút. Rửa sạch lại bằng nước cất. Để khơ tự nhiên và xem kết quả. Kháng huyết thanh tạo ngưng kết ở độ pha lỗng ¼ hoặc ở các độ pha lỗng cao hơn được dùng cho mục đích tinh chế.