Nghiên cứu xác định độc tố saxitoxin trong cua biển bằng phương pháp LC MS MS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Mã sinh viên: 1101419 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ SAXITOXIN TRONG CUA BIỂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐÌNH QUÂN 1101419 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ SAXITOXIN TRONG CUA BIỂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên Hà ThS Nguyễn Thị Hà Bình Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia HÀ NỘI – 2016 i LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với hướng dẫn TS Trần Nguyên Hà ThS Nguyễn Thị Hà Bình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Trần Nguyên Hà định hướng nghiên cứu, hướng dẫn góp ý giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Bình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ em học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Đình Quân ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố sinh học biển 1.2 Độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.3 Giới thiệu STX 1.3.1 Tính chất vật lý hóa học 1.3.2 Nguồn phát sinh STX 1.3.4 Độc tính STX 1.4 Các phương pháp xác định STX 1.4.1 Phương pháp sinh học chuột 1.4.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 1.4.3 Sắc kí lỏng hiệu cao 1.4.4 Sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 11 1.5 Tổng quan tóm lược sắc kí lỏng khối phổ 13 1.5.1 Sắc kí lỏng hiệu cao 13 1.5.2 Khối phổ (Mass spectrometry) 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 iii 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 18 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.2 Dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.1 Khảo sát phương pháp 20 2.3.2 Thẩm định phương pháp 20 2.3.3 Ứng dụng phương pháp 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 20 2.4.2 Khảo sát, lưa chọn điều kiện sắc kí 20 2.4.3 Quy trình thẩm định phương pháp 21 2.4.3.1 Tính đặc hiệu 21 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) 21 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 22 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 22 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Khảo sát phương pháp phân tích độc tố STX 24 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 24 3.1.1.1 Khảo sát điều kiện bắn phá ion mẹ 24 3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion 24 3.1.2 Điều kiện sắc kí lỏng 26 iv 3.1.2.1 Chọn pha tĩnh 26 3.1.2.2 Chọn pha động 26 3.1.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 28 3.1.3.1 Chọn quy trình xử lý mẫu 28 3.1.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 32 3.1.3.3 Khảo sát trình pha loãng dịch chiết 34 3.1.3.4 Khảo sát thể tích dung môi chiết 35 3.2 Thẩm định phương pháp 37 3.2.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc 37 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 38 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính 39 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 40 3.2.5 Bàn luận 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 Kết luận 44 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonitrile Acetonitril Association of Official Hiệp hội nhà hóa phân Analytical Communities tích thống ASP Amnesic Shellfish Poisoning Độc tố gây trí nhớ CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lượng va chạm CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning AOAC dSPE Dispersive solid phase extraction Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy Chiết phân tán pha rắn Eq Equivalents Tương đương ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính GS1 Ion Source Gas Nguồn khí ion GS2 Ion Source Gas Nguồn khí ion HPLC HILIC IS High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Hydrophilic interaction liquid Sắc kí lỏng tương tác thân chromatography nước Ionspray Voltage Thế phun ion vi LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ mass spectrometry lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MBA Mouse bioassay MS Mass spectrometry PSP Paralytic Shellfish poisoning R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn STX Saxitoxin Độc tố saxitoxin TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn Thử nghiệm sinh học chuột Khối phổ Độc tố nhuyễn thể gây liệt vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học độc tính vài độc tố PSP Bảng 1.2: LD50 đường uống STX số loài động vật Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định STX 10 Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 24 Bảng 3.2: Kết bắn phá ion mẹ 24 Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá ion STX 25 Bảng 3.4: Chương trình gradient 27 Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu 32 Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 33 Bảng 3.7: Khảo sát trình pha loãng dịch chiết 34 Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết 35 Bảng 3.9: Ion mẹ ion STX 37 Bảng 3.10: LOD LOQ STX 39 Bảng 3.11: Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ STX 39 Bảng 3.12: Độ lặp lại độ thu hồi STX mẫu cua biển 41 Bảng 3.13: Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội 43 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sơ đồ máy khối phổ 15 Hình 1.2: Bộ nguồn ion hóa ESI 16 Hình 1.3: Bộ phân tích khối ba tứ cực 16 Hình 3.1: Phổ khối STX 25 Hình 3.2: Sắc kí đồ chương trình gradient 28 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 29 Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 30 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 31 Hình 3.6: Sắc kí đồ STX quy trình 32 Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt 33 Hình 3.8: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt 33 Hình 3.9: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng trình pha loãng đến hiệu suất thu hồi 34 Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu 36 Hình 3.11: Sắc kí đồ mẫu trắng 37 Hình 3.12: Sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn STX mức 50 ng/mL 38 Hình 3.13: Sắc kí đồ mẫu chuẩn STX mức 50 ng/mL 38 Hình 3.14: Sắc kí đồ STX LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg mẫu) 38 Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính diện tích píc nồng độ STX 40 43 3.3 Áp dụng phân tích mẫu thực tế Chúng áp dụng phương pháp phân tích hàm lượng STX 10 mẫu cua biển lấy chợ địa bàn Hà Nội Các kết tổng hợp bảng 3.13: Bảng 3.13: Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội Kí hiệu Địa điểm lấy mẫu ĐT01 ĐT02 (-)* Chợ Hà Đông ĐT1* ĐT03 ĐT04 ĐT05 ĐT06 ĐT07 ĐT08 ĐT09 ĐT10 Kết (-) 31,5 ng/mL; R(%) = 105,0 % Chợ Mơ Chợ Phùng Khoang Chợ Long Biên Chợ Nghĩa Tân (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) *Ghi chú: (-): không phát độc tố STX ĐT1*: Mẫu cua thêm chuẩn 30 ng/mL Nhận xét: Trên 10 mẫu cua biển khảo sát, không phát mẫu chứa độc tố STX Mẫu thêm chuẩn 30 ng/mL cho tín hiệu có độ thu hồi cao 105,0% Số lượng mẫu nên chưa thể đánh giá xác thực hàm lượng STX cua biển số chợ Hà Nội Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu thêm để đánh giá nguy nhiễm STX cua biển, đảm bảo an toàn cho người sử dụng 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích áp dụng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS để phân tách xác định độc tố STX cua biển, thu kết sau: Đã khảo sát chọn điều kiện tối ưu cho hệ thống LC-MS/MS - Khảo sát điều kiện bắn phá ion mẹ, ion định lượng định tính STX - Chọn pha tĩnh cột TSK-gel Amide-80® (3 µm; 2,0 x 150 mm) - Khảo sát pha động, chương trình gradient: + Pha động: Kênh A: acid fomic 0,1%; Pha động B: acetonitril + Chương trình gradient từ 1-10 phút (Hình 3.4) + Tốc độ dòng: 0,5 mL/ phút Đã khảo sát đưa quy trình xử lý mẫu tối ưu (Hình 3.10) Thẩm định phương pháp - Xây dựng đường chuẩn, phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính R ≥ 0,995 - Nghiên cứu đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi phương pháp: Hiệu suất thu hồi đạt từ 84,3 - 101,0% - Xác định giới hạn phát STX cua biển 100 µg/kg Giới hạn định lượng 300 µg/kg 45 Áp dụng phương pháp 10 mẫu cua biển địa bàn Hà Nội chưa phát mẫu chứa STX Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thêm độc tố khác nhóm - Mở rộng thêm đối tượng phân tích loài thủy sản khác vẹm, ngao, cá… TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Tập 2, tr 84-110, NXB Y học Bộ Khoa học công nghệ (2011), TCVN 8681:2011 nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, tr 15-58, NXB Khoa học & Kỹ thuật TIẾNG ANH Cusick K D., Sayler G S (2013), "An overview on the marine neurotoxin, saxitoxin: Genetics, molecular targets, methods of detection and ecological functions", Marine Drugs, 11(4), pp 991-1018 Deeds J R., Landsberg J H., Etheridge S M., et al (2008), "Non-traditional vectors for paralytic shellfish poisoning", Marine Drugs, 6(2), pp 308-348 Dell’aversano C., Hess P., Quilliam M A (2005), "Hydrophilic interaction liquid chromatography–mass spectrometry for the analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins", Journal of chromatography A, 1081(2), pp 190-201 Diener M., Erler K., Hiller S., et al (2006), "Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in dietary supplements by application of a new HPLC/FD method", European Food Research and Technology, 224(2), pp 147-151 Etheridge S M (2010), "Paralytic shellfish poisoning: seafood safety and human health perspectives", Toxicon, 56(2), pp 108-122 European Commission, (2004), “Commission Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin”, Official Journal of the European Union, L226, 22 - 82 10 Faber S (2012), "Saxitoxin and the induction of paralytic shellfish poisoning", Journal of Young Investigators, 23(1), pp 1-7 11 FAO (2004), Marine biotoxins, pp 5-49, Rome 12 Gerssen A (2009), The analysis of lipophilic marine toxins, Wageningen University, pp.2-5 13 Gerssen A., Pol-Hofstad I E., Poelman M., et al (2010), "Marine toxins: Chemistry, toxicity, occurrence and detection, with special reference to the Dutch situation", Toxins, 2(4), pp 878-904 14 Harju K., Rapinoja M L., Avondet M.-A., et al (2015), "Optimization of Sample Preparation for the Identification and Quantification of Saxitoxin in Proficiency Test Mussel Sample using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry", Toxins, 7(12), pp 4868-4880 15 Lawrence J F., Niedzwiadek B (2001), "Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish by using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 84(4), pp 1099-1108 16 Llewellyn L., Dodd M., Robertson A., et al (2002), "Post-mortem analysis of samples from a human victim of a fatal poisoning caused by the xanthid crab, Zosimus aeneus", Toxicon, 40(10), pp 1463-1469 17 Mattarozzi M., Milioli M., Bianchi F., et al (2016), "Optimization of a rapid QuEChERS sample treatment method for HILIC-MS analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in mussels", Food Control, 60, pp 138-145 18 Mons M., Van Egmond H., Speijers G (1998), Paralytic shellfish poisoning: A Review RIVM Report No 388802 005 19 Oikawa H., Fujita T., Satomi M., et al (2002), "Accumulation of paralytic shellfish poisoning toxins in the edible shore crab Telmessus acutidens", Toxicon, 40(11), pp 1593-1599 20 Oshima Y (1995), "Post-column derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins", Journal of AOAC International, 78(2), pp 528-532 21 Usleber E., Schneider E., Terplan G (1991), "Direct enzyme immunoassay in microtitration plate and test strip format for the detection of saxitoxin in shellfish", Letters in applied microbiology, 13(6), pp 275-277 22 Van De Riet J M., Gibbs R S., Chou F W., et al (2009), "Liquid chromatographic post-column oxidation method for analysis of paralytic shellfish toxins in mussels, clams, scallops, and oysters: single-laboratory validation", Journal of AOAC International, 92(6), pp 1690-1704 23 Wiberg G., Stephenson N (1960), "Toxicologic studies on paralytic shellfish poison", Toxicology and applied pharmacology, 2(6), pp 607 -615 24 Wiese M., D’agostino P M., Mihali T K., et al (2010), "Neurotoxic alkaloids: saxitoxin and its analogs", Marine Drugs, 8(7), pp 2185-2211 25 Yu H., Lim K S., Song K C., et al (2013), "Comparison of MBA and HPLC Post column Oxidation Methods for the Quantification of Paralytic Shellfish Poisoning Toxins", Fisheries and aquatic sciences, 16(3), pp 159164 26 Zhuo L., Yin Y., Fu W., et al (2013), "Determination of paralytic shellfish poisoning toxins by HILIC–MS/MS coupled with dispersive solid phase extraction", Food chemistry, 137(1), pp 115-121 PHỤ LỤC Sắc kí đồ khảo sát pha động Gradient Gradient Gradient Sắc kí đồ khảo sát chọn quy trình xử lý mẫu Chiết ACN/H2O (90/10, v/v) chứa HCOOH 0,1% - SPE Chiết ACN/H2O (90/10, v/v) chứa HCOOH 0,1% - dSPE Chiết HCL 0,1%- SPE Chiết HCL 0,1%- dSPE Sắc kí đồ khảo sát thể tích dung môi chiết xử lý mẫu Chiết lần mL Chiết lần: 2x2 mL dịch chiết Sắc kí đồ khảo sát độ pha loãng xử lý mẫu Pha loãng lần Pha loãng 10 lần Pha loãng 20 lần Sắc đồ thêm chuẩn nồng độ khác thẩm định độ lặp lại Spike 50ng/mL Spike 100 ng/mL Spike 150 ng/mL Sắc đồ dung môi, mẫu trắng Dung môi Mẫu trắng Mẫu thực tế Cua biển chợ Hà Đông Cua biển chợ Mơ Cua biển chợ Phùng Khoang Cua biển chợ Long Biên Cua biển chợ Nghĩa Tân Mẫu ĐT1* spike 30 ng/mL [...]... hóa Do vậy, trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp chúng tôi tập trung 2 tìm ra điều kiện phân tích tối ưu STX trên thiết bị LC- MS/ MS có tại phòng thí nghiệm Đề tài Nghiên cứu xác định độc tố saxitoxin trong cua biển bằng phương pháp LC- MS/ MS” với các mục tiêu như sau: - Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độc tố STX trong cua biển bằng phương pháp LC- MS/ MS - Áp dụng phương pháp phân tích... mẫu 2.3.2 Thẩm định phương pháp - Độ đặc hiệu/ chọn lọc của phương pháp - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) - Độ lặp lại (độ chụm), độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp 2.3.3 Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp mới xây dựng để phân tích phân tích một số mẫu cua biển trên địa bàn Hà Nội 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu thập và... thành các độc tố sinh học biển Độc tố sinh học biển có thể tích lũy trong nhiều loài sinh vật biển khác nhau như cá, cua hoặc thân mềm như trai, hàu, sò và ngao Trong các loài thân mềm, độc tố có thể tích luỹ trong hệ tiêu hoá mà không gây độc cho các loài đó Tuy nhiên, khi vào cơ thể con người, chúng có thể gây ngộ độc nghiêm trọng [12] Dựa trên các đặc tính hoá học của các độc tố sinh học biển có... trong nhuyễn thể cũng như cua biển 1.4 Các phương pháp xác định STX 1.4.1 Phương pháp sinh học trên chuột Hiện nay, thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phương pháp thử nghiệm chính trong hầu hết các chương trình giám sát ngộ độc thủy sản MBA được sử dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phương pháp chính thức của AOAC PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1 N,... and C1-4 ít mạnh hơn + Nhóm thứ 4 là deoxycarbamoyl nhưng độc tính của nó chưa được xác định 1 cách rõ ràng [8] STX là độc tố mạnh nhất trong nhóm PSP Độc tính của các PSP khác được xác định dựa trên độc tính của STX bởi Oshima được trình bày ở bảng 1.1 [20] 5 Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP Độc tố R1 R2 R3 Hệ số độc M STX -H -H -H 1 299 NEO -OH -H -H 0,92 315 GTX1 - OH... [4], [18], [24]: + Độc tố carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO), gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất + Độc tố decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), decarbamoyl neosaxitoxin (dcNEO), decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính trung bình, được báo cáo xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhưng ít được tìm thấy trong các loài tảo độc + Các độc tố N-sulfocarbamoyl... chất chung quy trình - Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất 2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) - Khái... phát hiện với mức tin cậy xác định Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn - Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) 22 Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N) Trong đó: S: Chiều cao... định độc tố STX và PSP khác trong nhuyễn thể như phương pháp thử nghiệm sinh học (MBA), phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang (HPLC-FLD) Tuy nhiên phương pháp MBA có độ nhạy thấp, không thể tự động hóa, bị ảnh hưởng bởi các đặc tính động vật và đặc biệt là về vấn đề đạo đức, còn phương pháp HPLC-FLD thì có độ nhạy và độ đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu nhưng đòi hỏi tốn kém... được xác định có độc tố PSP tại Nha Trang Hai mẫu thực phẩm là súp măng cua và tôm sú hấp đã được kiểm nghiệm và phát hiện thấy có độc tố PSP và độc tố tetrodotoxin Ngày 8/5/2015 ba người bị ngộ độc đã phải nhập viện khi ăn phải cua mặt quỷ ở đảo Lý Sơn (Quảng Ngải) Các triệu chứng như tê lưỡi và chân tay cho thấy khả năng bệnh nhân đã bị nhiễm độc tố PSP Một số ý kiến chuyên gia cho rằng, loài cua