Nghiên cứu xác đinh hàm lượng phenol trong thủy sản bằng sắc ký khối phổ

Phương pháp xử lý mẫu Xử lý mẫu là một trong những bước quan trọng để có thể xác định phenol dạng vết trong các nền mẫu khác nhau.. Phương pháp xử lý mẫu thích hợp giúp loại bỏ, làm giả

BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Nguyên

Hà và TS Trần Cao Sơn là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm

nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp

đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Khoa Độc học và dị nguyên

và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian vừa qua

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, Bộ môn Hóa phân tích và độc chất, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người

đã dạy bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tốt nhất

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Lê Thị Thu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về phenol 2

1.1.1 Giới thiệu chung về phenol 2

1.1.2 Tính chất hóa lý của phenol 2

1.2 Nguồn gốc, độc tính của phenol 3

1.3 Độc tính của phenol đối với thủy sản 7

1.3.1 Ảnh hưởng của phenol đối với thủy sản 7

1.3.2 Một số khuyến cáo về liều lượng cho phép của phenol 8

1.4 Một số phương pháp xác định hợp chất phenol 10

1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 10

1.4.2 Phương pháp phân tích các hợp chất phenol 12

1.5 Giới thiệu về sắc ký khí khối phổ 15

1.5.1 Sắc ký khí 15

1.5.2 Detector khối phổ trong sắc ký khí 15

1.5.3 Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol bằng GC-MS 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.2.1 Nguyên vật liệu 18

2.2.2 Trang thiết bị 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách phenol trong thủy sản 20

2.3.2 Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích phenol bằng GC-MS/MS 20

2.3.3 Thẩm định phương pháp 21

2.3.4 Đánh giá hàm lượng phenol trên một số mẫu thủy sản 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ 21

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu 22

2.4.3 Phương pháp sắc ký khí - khối phổ hai lần (GC-MS/MS) 22

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS 23

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định phenol bằng GC-MS/MS 27

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS 27

3.1.2 Tối ưu các điều kiện sắc ký khí 28

3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 29

3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện cất kéo hơi nước 32

3.2.3 Điều kiện làm sạch phenol 33

3.3 Thẩm định phương pháp 38

3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 38

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 40

3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 41

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 42

3.4 Kết quả xác định phenol trong một số mẫu thủy sản 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

Kết luận 46

Kiến nghị 46

TÀI LIỆU KHAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

EFSA European Food Safety Authority Ủy ban an toàn thực phẩm Châu

Âu EPA Environmental Protection Agency Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ FID Flame Ionization Detector Detector ion hóa ngọn lửa PFB Pentafluorobenzyl Bromide Pentafluorobenzyl bromid

LLE Liquid - liquid Extraction Chiết lỏng - lỏng

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiên

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

MRM Mutiple Reaction Monitoring Giám sát đa phản ứng

MTBFTSA

N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide

metyltrifluoroacetamid

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

SPME Solid Phase Micro-Extraction Vi chiết pha rắn

TMCS Chlorotrimethylsilane Chlorotrimethylsilan

UV-Vis Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại – khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các thông số vật lý của phenol 3

Bảng 1.2: Một số khuyến cáo về giới hạn của phenol 8

Bảng 1.3: Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol trong mẫu môi trường 12

Bảng 1.4: Một số phương pháp phân tích các hợp chất phenol bằng GC-MS 16

Bảng 2.1: Quan hệ giữa các kỹ thuật khối phổ và số điểm IP đạt được 23

Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của phenol sau khi bắn phá 27

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian tạo dẫn xuất của phenol với MTBFTSA 30

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất của phenol với MTBSTFA 31

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát điều kiện chiết và làm sạch phenol 34

Bảng 3.5: Tỷ lệ các ion của phenol 39

Bảng 3.6: Giá trị LOD và LOQ của phenol 40

Bảng 3.7: Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính của phenol trên mẫu trắng thêm chuẩn 41

Bảng 3.8: Độ lặp lại và độ thu hồi của phenol tại các nồng độ 10 ng/mL, 100 ng/mL, 500 ng/mL 42

Bảng 3.9: Kết quả xác định hàm lượng phenol trong các mẫu thủy sản có phenol 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hóa của phenol trong cơ thể người và động vật 6

Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chung tạo dẫn xuất trimethylsilyl 15

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký khí - khối phổ 16

Hình 3.1: Phổ khối của phenol sau khi bắn phá ion 28

Hình 3.2: Sắc ký đồ TIC và 3 ion của dung dịch phenol chuẩn 500 ng/mL 29

Hình 3.3: Đồ thị thể hiện hiệu suất phản ứng tạo dẫn xuất của phenol với MTBSTFA trong thời gian khác nhau 31

Hình 3.4: Sắc ký đồ thu được khi thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của phenol với MTBSTFA ở nhiệt độ 70, 80, 90ºC 32

Hình 3.5: Quy trình cất kéo hơi nước mẫu 33

Hình 3.6: Đồ thị thể hiện diện tích pic thu được khi phân tích phenol sử dụng các phương pháp chiết và làm sạch khác nhau so với phenol chuẩn 100 ng/mL 35

Hình 3.7: Sắc ký đồ khảo sát điều kiện chiết và làm sạch phenol bằng cột SPE C18, HLB, chiết QuEChERS và dung dịch phenol chuẩn 100 ng/mL 36

Hình 3.8: Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng phenol trong thủy sản 37

Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 100 ng/mL 38

Hình 3.10: Sắc ký đồ thể hiện tỷ lệ các ion của mẫu thêm chuẩn phenol 500 ng/mL 39

Hình 3.11: Sắc ký đồ của phenol ở LOD 3 ng/mL 40

Hình 3.12: Đường chuẩn của phenol trên nền mẫu trắng thêm chuẩn nống độ từ 10 ng/mL đến 50 ng/mL 41

cá chết hàng loạt vùng biển ven bờ các tỉnh miền Trung được dư luận đặc biệt quan tâm gây ảnh hưởng đến sức khỏe, kinh tế và sinh thái biển nặng nề Từ những kết quả phân tích và đánh giá đưa ra nhận định: “Đã có một nguồn thải lớn chứa phenol và cyanid kết hợp phức sắt ở dạng keo xả ra môi trường biển xuất phát từ khu vực Vũng Áng, Hà Tĩnh

di chuyển theo dòng hải lưu tới Thừa Thiên Huế Phức sắt dạng keo sẽ hấp thụ phenol, cyanid và các chất độc khác làm giàu các độc chất này thậm chí tới hàm lượng có thể gây độc cấp tính” Như vậy, có thể thấy phenol là một trong các tác nhân hóa học chính gây ra sự cố cá chết hàng loạt ở bốn tỉnh miền Trung

Phenol là một hóa chất công nghiệp quan trọng do chúng tham gia vào nhiều ngành công nghiệp như than cốc, lọc dầu, luyện kim, sản xuất nhựa, dược phẩm, thuốc trừ sâu Sự hiện diện của phenol thậm chí ở nồng độ thấp trong nước thải công nghiệp

đã ảnh hưởng xấu đến các sinh vật dưới nước cũng như cuộc sống con người Do đó, cả

Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) và Liên minh châu Âu (EU) đã đưa phenol

và một số hợp chất phenol trong danh sách các chất gây ô nhiễm hàng đầu

Hiện nay, Việt Nam chưa có một quy định cũng như phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng phenol trong thực phẩm Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Xác định hàm lượng phenol trong thủy sản bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu chung về phenol

Các hợp chất phenol là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có một hoặc nhiều nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với một vòng thơm Trong đó phenol (C6H5OH) là chất

có cấu trúc đơn giản nhất Phenol tinh khiết ở dạng rắn không màu hoặc màu trắng, ở dạng lỏng phenol hóa hơi chậm hơi nước, có mùi đặc trưng [9], [17], [34] Phenol được hình thành cả trong tự nhiên và nhân tạo [8], [9], [17],[21], [34]

Hiện nay, phenol được sử dụng rông rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp như: sản xuất các alkylphenol, cresol, cylenol, nhựa phenolic, nilon, các sợi tổng hợp, anilin, dầu, chế tạo than, luyện kim, sản xuất thuốc diệt cỏ và là nguyên liệu ban đầu hoặc trung gian để sản xuất một số thuốc như: acid salicylic, acid acetyl salicylic, methyl salicylat

Vì có tính diệt khuẩn phenol còn có trong các chế phẩm dược như nước xúc miệng, thuốc chữa đau họng, thuốc xịt khử trùng Phenol cũng được sử dụng trực tiếp như một chất tẩy uế, khử trùng Tuy nhiên do tính độc và bền vững nên cả EPA và EU đã phân loại các hợp chất phenol là chất gây ô nhiễm hàng đầu [8], [9], [14], [15], [31]

1.1.2 Tính chất hóa lý của phenol

nước Phenol tan trong nước, ethanol; rất tan trong ete; đồng tan trong aceton, benzen; tan vô hạn trong nước ở 66°C Phenol ở dạng lỏng hóa hơi chậm hơn nước [8], [9], [17], [34]

Bảng 1.1: Các thông số vật lý của phenol

Trạng thái Tinh thể rắn màu trắng hoặc chất lỏng

1.1.2.2 Tính chất hóa học của phenol

Phenol có nhóm -OH gắn trực tiếp vào vòng thơm nên có hiệu ứng liên hợp mạnh giữa nguyên tử O của nhóm -OH với nguyên tử C của vòng thơm làm cho liên kết giữa

O và H của phenol phân cực hơn so với liên kết -OH của các alcol Do đó, ngoài tính chất của các alcol, phenol còn có tính acid và tính chất của vòng thơm [34]

- Tạo phức với kim loại: các hợp chất phenol có thể tạo phức với các kim loại như sắt, nhôm và magiê [34]

- Phản ứng oxy hóa: các hợp chất phenol dễ bị oxy hóa tạo thành hợp chất quinon như benzoquinon Tác nhân oxy hóa có thể là oxy trong không khí [34]

1.2 Nguồn gốc, độc tính của phenol

• Nguồn gốc: phenol có thể được sinh ra từ hai con đường tự nhiên và nhân tạo [7], [8], [9], [14], [17]

- Nguồn gốc tự nhiên: phenol được hình thành trong quá trình sinh tổng hợp thực vật và `phân hủy các chất hữu cơ Hợp chất này hình thành từ các aminoacid chứa trong hemicellulose của cây trồng dưới ảnh hưởng của bức xạ UV (ánh sáng mặt trời) và chuyển đổi tyrosin ở hệ thống tiêu hóa động vật có vú (bao gồm cả con người) Hầu hết các nguồn tự nhiên chỉ giải phóng một lượng dạng vết phenol vào môi trường nước [8], [21], [28]

Trong thực phẩm: phenol có trong mật ong, cà phê [20], nho đỏ, ca cao, cà chua, trong thực phẩm chế biến như xúc xích nướng, thịt hun khói và thịt lợn, gà chiên, trà đen lên men [7], [9], [17], [21], [34]

- Nguồn gốc nhân tạo:

+ Phenol có thể được tìm thấy trong không khí, nước và đất sau khi giải phóng từ quá trình sản xuất, sử dụng và xử lý các sản phẩm có chứa phenol Trong đất phenol có thể đi vào nguồn nước ngầm [8], [21]

+ Trong nước thải ngoài phenol còn chứa các chất khác như cyanid, anhydrid, rượu, acid hữu cơ và các chất khí như ammoniac, carbon đioxid [8], [20], [25] + Phenol còn xâm nhập vào môi trường thông qua khí thải xe cộ, lò sưởi, khói thuốc lá và khí từ lò đốt Mặc dù các khí này không giải phóng phenol trực tiếp vào nước nhưng có thể xâm nhập vào các nguồn nước do 1,3-15 µg/L phenol đã được tìm thấy trong nước mưa [8], [21]

• Con đường phenol xâm nhập vào cơ thể

- Qua đường hô hấp: trong không khí nơi gần với các cơ sở sử dụng chất đốt là than

và dầu mỏ hoặc lò đốt rác thải có chứa phenol Mặc dù có thể thâm nhập qua hệ

hô hấp nhưng phenol có mùi đặc trưng nên dễ nhận biết để phòng tránh [8], [16]

- Qua tiếp xúc trực tiếp lên da và mắt: là nhiễm độc hay gặp nhất Một lượng đáng

kể phenol có thể xâm nhập qua da khi tiếp xúc với phenol ở dạng hơi, dạng lỏng, hoặc chất lỏng có chứa phenol [8], [17]

- Đường xâm nhập thứ ba của phenol là đường tiêu hóa thông qua thực phẩm hoặc nước uống nhiễm phenol hoặc sử dụng chế phẩm dược như nước xúc miệng, thuốc ngậm trị viêm họng Nếu thường xuyên sử dụng các thực phẩm hoặc dược phẩm

có chứa phenol thì sẽ gây ra ngộ độc trường diễn [8], [17]

• Dược động học của phenol trong cơ thể: độc tính của phenol được nghiên cứu rộng rãi ở người và động vật thí nghiệm

- Hấp thu, phân bố: phenol hấp thu dễ dàng bởi tất cả các đường và nhanh chóng phân bố rộng khắp cơ thể chủ yếu ở gan, thận, não, cơ Phenol có thể đi qua não, nhau thai và thậm chí sữa mẹ [8], [9], [16]

- Chuyển hóa: nếu phơi nhiễm qua đường tiêu hóa phenol chuyển hóa bước 1 qua gan nhờ ba hệ thống enzym khác nhau Phenol sulfototransferases (PST) xúc tác chuyển lưu huỳnh vô cơ từ phân tử 3'-phosphoadenosin-5'-phosphosulfat hoạt hóa đến nhóm hydroxyl trên phenol Uridin diphosphat (UDP) - glucuronosyltransferases (UGT) xúc tác chuyển một phân tử acid glucuronic hoạt hóa đến nhóm hydroxyl của phenol để tạo ra một liên hợp O - glucuronid Cytochrom P450 2E1 xúc tác hydroxyl hóa phenol tạo thành hydroquinon và catechol Các chất này tiếp tục được chuyển hóa tương tự như phenol (tức là liên hợp với acid glucuronic và sulfat) hoặc trải qua các quá trình peroxy hóa tạo benzoquinon, trihydroxybenzen Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng các chất trung gian có thể liên quan đến độc tính của chất này [8]

+ Quá trình chuyển hóa của phenol phụ thuộc vào liều Ở người và chuột nếu uống phenol liều thấp thì sản phẩm liên hợp sulfat của phenol được cho là có ưu thế hơn còn ngược lại ở lợn và dơi thì các sản phẩm liên hợp glucuronid chiếm

ưu thế Khi người phơi nhiễm với phenol liều cao sản phẩm liên hợp glucoronid

và các chất trung gian được tạo ra từ quá trình peroxy hóa có nồng độ cao hơn do

đó nguy hiểm hơn [8]

+ Khi tiếp xúc qua da, phenol không qua chuyển hóa bước 1 ở gan nên khả năng giải độc phenol là tương đối thấp Điều này có thể làm tăng khả năng gây ra các phản ứng bất lợi của phenol [8]

- Thải trừ: dữ liệu ở người và động vật thí nghiệm cho thấy phenol và các sản phẩm liên hợp của nó được bài tiết nhanh chủ yếu qua nước tiểu (dưới dạng phenyl sulfat và phenyl glucuronid) Một phần nhỏ được thải trừ qua da, phân và hầu như không tích tụ trong cơ thể [8], [9], [17]

Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hóa của phenol trong cơ thể người và động vật

• Độc tính của phenol đối với cơ thể người [7], [8], [9], [17], [21]: ảnh hưởng của phenol đối với cơ thể người phụ thuộc rất nhiều vào khả năng dung nạp và con

đường phơi nhiễm

- Triệu chứng ngộ độc cấp:

Ngộ độc nhẹ: rối loạn tiêu hoá như buồn nôn, nôn, ỉa chảy; rối loạn thần kinh và toàn thân như mệt mỏi, chóng mặt, nhức đầu, gầy sút nhanh Nếu hít phải hoặc tiếp xúc với phenol gây khó chịu cho da, mắt và màng niêm mạc ở người

Ngộ độc nặng: bỏng, hoại tử, ăn mòn tại chỗ, rối loạn tiêu hoá, giãy giụa, co giật, hôn mê, rối loạn tuần hoàn, hô hấp và sốc nặng dẫn đến tử vong Nếu bệnh nhân chưa tử vong ngay còn có thể bị viêm gan, viêm thận, đái ra huyết cầu tố

- Triệu chứng ngộ độc trường diễn: nếu nhiễm độc phenol lâu dài có thể gây suy

thận, kích thích dạ dày ruột, ảnh hưởng đến máu và gan cũng đã được báo cáo

Tiếp xúc với phenol bị rát, viêm da, kích ứng hoặc hoại tử da

- Ung thư: không có bằng chứng phenol gây ung thư trên con người Cơ quan

nghiên cứu ung thư quốc tế, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ và chương trình Độc

tố Quốc gia Hoa Kỳ (NTP) đã xác định rằng phenol không được phân loại là chất gây ung thư của con người [7], [8], [9], [17]

1.3.1 Ảnh hưởng của phenol đối với thủy sản

Phenol và các dẫn chất của phenol là các chất gây ô nhiễm nguồn nước từ các nguồn nước tự nhiên đến các nguồn nước thải của nhiều ngành công nghiệp hóa học như luyện kim, hóa dầu, sản xuất phenol, dược phẩm và các ngành công nghiệp nhựa, nhuộm, sơn, hóa dệt, thuộc da… Nồng độ nhỏ phenol trong nước cũng có thể gây độc đối với một số loài thủy sản và con người vì sự dung nạp và nhạy cảm của các cơ thể sống đối với phenol có thể khác nhau Điều này sẽ gây ra sự gián đoạn trong chuỗi thức ăn trong

hệ sinh thái biển [7] Độc tính của phenol rất khác đối với các sinh vật được thử, hàm lượng oxy hòa tan, nhiệt độ và thành phần các chất tan trong nước Nước thải phenol có chứa các hợp chất khác có độc tính cao hơn chỉ chứa mình phenol [7], [28]

Đa số các nghiên cứu về độc tính của phenol đối với thủy sản chỉ mới quan tâm tới phơi nhiễm của cá với các mức nồng độ phenol trong nước Cá phơi nhiễm với phenol cấp tính có các biểu hiện: chán ăn, tăng tiết chất nhầy từ da và mang, suy hô hấp cấp, ảnh hưởng đến thần kinh như mất thăng bằng, thay đổi giải phẫu bệnh đối với mang, thận và gan do đó ảnh hưởng dến chuyển hóa trong cơ thể, làm giảm sinh trưởng và phát triển của cá thậm chí còn ảnh hưởng đến máu [25], [26], [28] Cá nước ngọt nhạy cảm với phenol ở mức từ 5,02 mg/L (96h LC50) đối với cá hồi vân tới 85 mg/L (2,5h LC50) đối với cá vàng Độc tính mạn của phenol với các sinh vật nước ngọt cũng đã được báo cáo trong một số nghiên cứu Giai đoạn ấu trùng ở một số loài là đặc biệt nhạy cảm LC50

từ 6,5 đến 58 ngày ở cá dao động từ 0,07 đến 2,67 mg/L Đối với cá biển nồng độ tác động dao động từ 5,6 mg/L (96 giờ LC50) đến 30,6 mg/L (96 giờ LC50) [16]

1.3.2 Một số khuyến cáo về liều lượng cho phép của phenol

Hiên nay, tất cả các tài liệu Codex (Việt Nam), Liên minh Châu Âu, Hoa Kì hay Nhật Bản chưa có một cơ quan tổ chức nào quy định mức giới hạn của phenol trong hải sản Tuy nhiên, một số cơ quan và tổ chức có đưa ra các mức khuyến cáo để bảo vệ sức khỏe con người như sau:

Bảng 1.2: Một số khuyến cáo về giới hạn của phenol

Cơ quan ban

EPA Liều lượng tham khảo (reference dose-RfD) của phenol là

0,6 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2002)

[8]

EFSA Liều lượng tham khảo (reference dose - RfD) của phenol

là 0,3 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2005)

[17]

Ngưỡng phenol tối đa được phép hấp thụ hàng ngày mà không gây hại (Tolerable daily intake-TDI) là 0,5 mg/kg trọng lượng cơ thể/ ngày (2008)

Mức Rủi ro Tối thiểu (MRL) cho việc tiêu thụ thực phẩm

có chứa phenol trong ngắn hạn (dưới 14 ngày) là 1 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2006)

1.4 Một số phương pháp xác định hợp chất phenol

1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

Xử lý mẫu là một trong những bước quan trọng để có thể xác định phenol dạng vết trong các nền mẫu khác nhau Phương pháp xử lý mẫu thích hợp giúp loại bỏ, làm giảm các yếu tố gây cản trở, làm giàu và xác định cũng như định lượng đúng được lượng chất phân tích có trong mẫu Tuy nhiên, phenol là một chất phân cực và dễ bay hơi do

đó xác định các hợp chất này trong cá cũng như các nền mẫu khác ở mức 1 ng/mL rất

khó khăn [15], [20], [24]

1.4.1.1 Phương pháp tách phenol khỏi nền mẫu thủy sản

Phenol trong nền mẫu thủy sản thường ở dạng kết hợp và có lẫn các chất khác gây ảnh hưởng cho việc xác định chất này Vì vậy cần phải loại bỏ các yếu tố gây cản trở và tách phenol ra khỏi nền mẫu Cũng tương tự như nền mẫu nước, phenol trong thủy sản sẽ được tách bằng cất kéo hơi nước với sự có mặt của dung dịch đồng (II) sulfat trong môi trường acid Việc dùng đồng (II) sulfat khi cất mẫu đã được acid hóa nhằm tạo đồng (II) sulfua mà không tạo ra hydrosulfua, acid hóa mẫu để tránh tạo tủa đồng (II) hydroxid là chất có khả năng acid hóa các hợp chất phenol Như vậy toàn bộ phenol và dẫn xuất của phenol có trong mẫu cùng bị cất kéo theo hơi nước Vì tốc độ bay hơi của các hợp chất phenol chậm nên thể tích dịch cất thu được phải đủ lớn cỡ thể tích mẫu đem

cất [5], [11]

1.4.1.2 Phương pháp làm sạch phenol

Mục đích của quá trình làm sạch là đưa được tối đa lượng chất cần phân tích vào dung môi thích hợp để thực hiện các bước tiếp theo Hiệu quả của quá trình làm sạch được thể hiện bằng độ thu hồi Phương pháp chính thức của Hoa Kỳ để chiết phenol trong chất lỏng là chiết lỏng-lỏng bằng cách acid hóa mẫu đến pH=2 sau đó chiết diclorometan hoặc cloroform (phương pháp US EPA 604, 625) Phương pháp này có

nhược điểm như hình thành nhũ tương, sử dụng nhiều dung môi nên thường đắt tiền, độc hại, tốn nhiều thời gian phân tích do đó đã được thay thế bằng các phương pháp khác nhạy cảm, chọn lọc, nhanh chóng và thân thiện với môi trường hơn [15], [20]

Chiết pha rắn (SPE) được phát triển vào những năm 1980 và được đánh giá là một kỹ thuật tốt để tách chiết và làm sạch các chất do hiểu quả, chọn lọc, giảm mất chất phân tích và sử dụng dung môi Chất phân tích sẽ được hấp phụ vào chất hấp phụ và rửa giải bằng dung môi như etyl acetat, methanol, acetonitril hoặc aceton Loại dung môi được lựa chọn phụ thuộc vào loại chất hấp phụ và độ phân cực của từng chất phân tích Các chất hấp phụ pha đảo không phân cực chứa silica được sử dụng đầu tiên trong phân tích các hợp chất phenol trong nước trong đó cột C18 được sử dụng rộng rãi nhất, nhưng hiệu suất chiết vẫn còn thấp nhất là đối với phenol Theo một cuộc khảo sát, sử dụng các chất hấp phụ polymer hữu cơ sẽ ổn định hơn như cột Oasis HLB, ENV+, Lichrolut EN cho độ hấp phụ với các hợp chất phenol cao hơn Tuy nhiên, các cột chiết pha rắn thường phù hợp với một lượng mẫu nhỏ, chỉ sử dụng được 1 lần do đó rất tốn kém và quá trình chiết vẫn sử dụng dung môi hữu cơ [15], [20], [24]

Vi chiết pha rắn (SPME) được phát triển để giải quyết một số hạn chế trong kỹ thuật SPE Dụng cụ SPME bao gồm một sợi silica nung chảy được bao phủ các polymer khác nhau đặt trong kim tiêm của một ống tiêm SPME dựa trên sự cân bằng giữa nồng

độ chất phân tích trên mẫu và trong lớp sợi silica Xử lý mẫu bằng SPME sẽ tiết kiệm thời gian phân tích cũng như dung môi nhưng SPME có một nhược điểm là các sợi SPME rất đắt, tuổi thọ ngắn, dễ đứt nhất là trong một hệ thống hoàn toàn tự động [15], [18], [20]

Gần đây, một sự kết hợp độc đáo giữa các quy trình (chiết và làm sạch), dung môi, muối và chất hấp thụ cho thấy rất hiệu quả là phương pháp xử lý mẫu bằng chiết QuEChERS Hiện tại, đây là quy trình xử lý mẫu chuẩn cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong trái cây, rau quả và có thể mở rộng cho các chất phân tích khác Chiết

QuEChERS nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, bền vững, an toàn và chủ yếu được kết hợp với

GC-MS, GC-MS/MS hoặc LC-MS [23]

Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên qua các nghiên cứu

và điều kiện phòng thí nghiệm hiện có chúng tôi tiến hành làm sạch mẫu thủy sản sau khi cất kéo hơi nước bằng ba phương pháp sau đây:

- Chiết pha rắn bằng cột C18

- Chiết pha rắn bằng cột HLB

- Chiết QuEChERS

1.4.2 Phương pháp phân tích các hợp chất phenol

Các phương pháp phân tích thường được sử dụng để xác định các hợp chất phenol

là phương pháp quang phổ và phương pháp sắc ký với các detector khác nhau

Bảng 1.3: Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol trong mẫu môi trường

Nền

mẫu

Phương pháp xử lý

mẫu

Phương pháp phân tích

Giới hạn phát hiện

K3Fe(CN)6 ở

pH = 10

0,01 mg/L cho 500 ml mẫu

Nhanh, chính xác, rẻ, quá trình xử lý mẫu đơn giản Tuy nhiên, bất kỳ dẫn chất phenol nào đều hấp thụ bức xạ UV-Vis nên thường được sử dụng để xác định hàm lượng tất cả dẫn

[5], [11]

chất phenol có trong mẫu

0,05 - 0,50 µg/L

Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại cao,

có thể phân tích được các chất phân cực và không bền với nhiệt

mà không cần tạo dẫn xuất Tuy nhiên, quá trình xử lý mẫu phức tạp, dễ bị lẫn các yếu tố nhiễu từ môi trường, thiết bị đắt tiền

Đối với các chất có nhiệt độ hóa hơi cao hoặc kém bền với nhiệt có thể tạo dẫn xuất phù hợp Tuy nhiên quá trình xử lý mẫu phức tạp

15 - 75 ng/L

[30]

Tóm tại, sắc ký là phương pháp phân tích thường được sử dụng để xác định các hợp chất phenol dạng vết trong các mẫu nước nói riêng và mẫu môi trường nói chung Nhưng, sắc ký khí thường được sử dụng rộng rãi hơn do có độ phân giải, độ chọn lọc cao, dễ dàng kết hợp với các detector khác nhau cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao Sắc ký khí kết hợp ECD, FID hoặc MS là phương pháp phân tích được sử dụng trong một số phương pháp chuẩn như US EPA 604, 625 và 8041a [28], [29], [30], Phenol có khả năng thích ứng với GC mà không cần tạo dẫn xuất, tuy nhiên ở nồng độ thấp xảy ra kéo đuôi pic đặc biệt khi phân tích mẫu môi trường ngay cả khi sử dụng cột mao quản mới

Để khắc phục hiện tượng này, phenol được tạo dẫn xuất với một tác nhân thích hợp như tác nhân silyl- hóa, acyl- hóa và alkyl- hóa để tạo ra một chất mới ít phân cực và bền với nhiệt hơn Tuy nhiên, tác nhân acyl- hóa đòi hỏi pH kiềm từ 9 đến 11 Diazomethan là chất dễ nổ và gây ung thư do đó nếu quá trình tạo dẫn xuất tại chỗ sẽ gây độc [13] Pentafluorobenzyl bromid (PFB) được sử dụng rộng rãi để tạo dẫn xuất với các hợp chất phenol bao gồm các nitrophenol nhưng hiệu suất của phản ứng này với các nitrophenol được báo cáo là tương đối thấp Các ete PFB được phát hiện nhạy cảm nhất bằng detector cộng kết điện tử (ECD) nhưng một nhược điểm lớn của quy trình ete PFB là một lượng lớn các chất gây cản trở từ nền mẫu môi trường cũng được chiết và được phân tích với GC-ECD Ete PFB được phát hiện chọn lọc hơn bằng GC - MS nhưng không phải là một giải pháp tối ưu, bởi vì phổ khối electron ion hóa (EI) của chúng bị ảnh hưởng bởi ion pentafluorobenzylium m/z 181 được tìm thấy không chọn lọc do nó cũng có trong phổ khối của các hợp chất nền mẫu được dẫn xuất hóa Vì vậy, phương pháp tạo dẫn xuất với tác nhân silyl- hóa cùng với phân tích bằng GC-MS được coi là phương pháp tối ưu nhất để xác định các hợp chất phenol trong nền mẫu môi trường Tác nhân silyl- hóa có

ưu điểm nổi bật như: có nhiều tác nhân silyl- hóa, khả năng tạo dẫn xuất với nhiều hợp chất, quá trình xử lý mẫu đơn giản, trong đó tác nhân N-(t-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoracetamid ngoài những ưu điểm trên còn có độ ổn định cao, dẫn xuất của

nó với phenol có thể bảo quản trong 7 ngày mà không thay đổi ngay cả khi có độ ẩm cao [30]

Cơ chế phản ứng chung cho sự hình thành dẫn xuất trimethylsilyl như sau [19]:

Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chung tạo dẫn xuất trimethylsilyl

1.5.2 Detector khối phổ trong sắc ký khí

1.5.2.1 Khái niệm:

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân tử theo

tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z) [1]

Về bản chất có thể coi khối phổ là một loại detector nhưng nó là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện phối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng [1]

1.5.2.2 Nguyên tắc hoạt động:

Mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion

để tạo các phần tử mang điện, sau đó được mang đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỷ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ [1]

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký khí - khối phổ

Điều kiện xử lý mẫu LOD TLKK

1 GC-MS Lá Carica

Papaya L

Chiết bằng dụng cụ Soxhlet với methanol sau đó chiết LLE; tạo dẫn xuất với BSTFA+TMCS 1%

0,03-0,33 mg/g

[12]

2 GC-MS Mẫu nước

ngầm nhiễm bẩn

Mẫu được chiết pha rắn với cột ENV+, tạo dẫn xuất với MTBFTSA

Nhỏ hơn 0,1 µg/L

[22]

3 GC-MS Mẫu nước Mẫu được chiết pha rắn với chất

hấp thụ là styrenedivinylbenzen, tạo dẫn xuất với MTBSTFA

15-75 ng/L

[30]

4 GC-MS Mẫu nước Mẫu được chiết pha rắn trên cột

ENV+, tạo dẫn xuất với trimethylsilyl-N,N

dimethylcarbamat

0,01-0,25 µg/L

[13]

Như vậy, các hợp chất phenol trong mẫu môi trường thường được xác định như sau:

- Xử lý mẫu bằng dụng cụ Soxhlet với dung môi thích hợp đối với mẫu là chất rắn

và chiết pha rắn với chất hấp thụ là styrenedivinylbenzen đối với mẫu là chất lỏng

- Phân tích bằng GC-MS sau khi tạo dẫn xuất với các tác nhân silyl hóa

Tuy nhiên độ thu hồi của phenol sau khi chiết SPE còn thấp [22], [30] Do đó cần

có một phương pháp xử lý mẫu thích hợp hơn để có thể xác định chính xác phenol trong các mẫu môi trường dưới dạng vết

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là: phenol (C6H5OH)

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và để ứng dụng phương pháp bao gồm các mẫu thủy sản do Viện An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia lấy tại một số tỉnh miền Trung gặp sự cố môi trường

Đối tượng mẫu được lựa chọn để khảo sát các điều kiện và thẩm định phương

pháp là các mẫu thủy sản đã được xác định không có phenol (mẫu trắng)

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

2.2.1.1 Chất chuẩn

• Chuẩn phenol có độ tinh khiết là 99% (Sigma hoặc tương ứng) Chuẩn có hạn sử dụng trong 2 năm

• Pha dung dịch chuẩn:

- Dung dịch gốc phenol: cân chính xác khoảng 0,1 g chất chuẩn phenol bằng cân phân tích vào cốc có mỏ 50 mL, hòa tan bằng nước cất, chuyển vào bình định mức 100 mL và định mức tới vạch, lắc kỹ Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/L được bảo quản ở 2-8°C, có thể sử dụng được trong 2 tuần Lưu ý: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc được tính theo khối lượng cân thực tế

- Dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/L: dùng micropipette hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng nước cất đươc dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 10 mg/L Dung dịch chuẩn trung gian bảo quản ở 2-8°C, có thể sử dụng được trong 1 tuần

- Dung dịch chuẩn trung gian 100 ng/mL: dùng micropipette hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 10 mg/L vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng

nước cất đươc dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 100 ng/mL Dung dịch chuẩn trung gian bảo quản ở 2-8°C, có thể sử dụng được trong 1 tuần

- Dung dịch chuẩn làm việc: pha các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 10 đến 500 ng/mL từ dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/L trong mẫu trắng Các dung dịch chuẩn làm việc bảo quản ở 2-8°C, có thể sử dụng được trong 1 ngày

2.2.1.2 Hóa chất và dung môi

Tất cả các hóa chất đều là các chất tinh khiết:

- MTBSTFA (N-(t-(butyldimethylsily)-N-methyltrifluoracetamid) (Sigma hoặc tương ứng)

- Magie sulfat khan (MgSO4) hoặc có thể sử dụng magie sulfat heptahydrat (MgSO4.7H2O) nung ở 450ºC trong 5h trước khi sử dụng

- Natri clorid khan

- Đồng (II) sulfat ngậm 5 nước (CuSO4.5H2O)

- Máy chưng cất toàn bộ bằng thủy tinh, bình chưng cất 1L có sinh hàn (Graham)

- Cân phân tích (có độ chính xác đến 0,1 mg), Metler

- Cân kỹ thuật (có độ chính xác đến 0,01 g), Precisa

- Máy đồng nhất mẫu, Philips

- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

- Bơm chân không, Ca-mi

- Máy lắc Vortex Genie 3

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách phenol trong thủy sản

• Tối ưu hóa điều kiện cất kéo hơi nước

• Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu tốt nhất khi áp dụng trên các nền mẫu và mẫu thủy sản bằng cách sử dụng 3 kỹ thuật tách chiết khác nhau là:

- Chiết pha rắn với cột C18

- Chiết pha rắn với cột HLB

- Chiết QuEChERS

• Khảo sát và lựa chọn điều kiện tạo dẫn xuất của phenol với MTBFTSA: điều kiện thời gian và nhiệt độ phản ứng

2.3.2 Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích phenol bằng GC-MS/MS

• Tối ưu hóa điều kiện sắc ký khí

• Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ, lựa chọn các ion con phù hợp

2.3.4 Đánh giá hàm lượng phenol trên một số thủy sản

• Lấy mẫu thủy sản từ một số tỉnh miền trung gặp sự cố môi trường gửi về Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

• Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

• Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

- Lượng mẫu lấy phù hợp với thông tư 02/2011/TT-BYT

- Tổng số mẫu nghiên cứu: 65 mẫu

- Địa điểm lấy mẫu: mẫu thủy sản từ một số tỉnh miền Trung gặp sự cố môi trường gửi về Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

• Xử lý mẫu sơ bộ:

Sau khi lấy mẫu: mỗi mẫu lấy 250 g cho vào túi polyethylen khô, sạch, đóng kín, điền đầy đủ thông tin Mẫu thủy sản (toàn bộ con) được nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ, mịn và đồng đều sau đó cho vào túi nilon, bảo quản đông lạnh

ở nhiệt độ khoảng -20°C

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu

• Quy trình cất kéo hơi nước:

- Cân chính xác khoảng 25 g mẫu vào cốc có mỏ 100 mL, thêm 5 mL dung dịch CuSO4, điều chỉnh pH đến khoảng 1-2 bằng dung dịch H3PO4 đặc

- Cho hỗn hợp vào bộ dụng cụ cất, thêm 100 mL nước cất (tráng rửa cốc và cho vào bình chưng cất) Tiến hành chưng cất ở nhiệt độ khoảng 190°C

- Chưng cất đến khi thu được dịch cất tới gần 100 mL sau đó định mức đến 100

mL bằng nước cất

• Quy trình chiết QuEChERS:

- Lấy 10 mL dịch cất thu được cho vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm 10 mL acetonitril và lắc đều trong 1 phút

- Thêm hỗn hợp muối gồm 4,0 g MgSO4 khan và 1,0 g NaCl khan, lắc đều trong 1 phút

- Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút

• Quá trình tạo dẫn xuất:

- Hút 50 µL dịch lớp trên (phenol/acetonitril) cho vào insert 200 µL và thêm 50 µL MTBSTFA, lắc đều

- Thực hiện phản ứng ở 80°C trong 60 phút trên bếp cách thủy

• Tiêm 1 µL vào GC-MS/MS

2.4.3 Phương pháp sắc ký khí - khối phổ hai lần (GC-MS/MS)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị GC-MS/MS gồm:

- Chương trình nhiệt độ lò: nhiệt độ đầu 50°C giữ 2 phút, tăng 25°C/phút lên 250°C

và giữ trong 5 phút

- Injector: 250°C

• Nhiệt độ transferline: 260°C

• Khối phổ ba tứ cực 7000 QQQ: chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring)

- Nhiệt độ nguồn ion: 250°C

- Lựa chọn 1 ion mẹ và 3 ion con, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, các ion có cường độ thấp hơn để xác nhận

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu Cách tính điểm IP (Điểm nhận dạng-identification point) đối với các kỹ thuật khối phổ phân giải thấp khác nhau được quy định như sau:

Bảng 2.1: Quan hệ giữa các kỹ thuật khối phổ và số điểm IP đạt được

Kỹ thuật khối phổ Số điểm IP đạt được với 1 ion

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của phenol, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (mẫu trắng thêm chuẩn), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Xây dựng phương trình đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tuyến tính R Trong đó hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1

Kiểm tra lại bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn để xây dựng đường chuẩn, tính giá trị độ chệch theo công thức:

∆𝑖= 𝐶𝑡− 𝐶𝑐

𝐶𝑐 ×100

Trong đó:

∆i: Độ lệch chuẩn của từng điểm dùng để xây dựng đường chuẩn

Ct: Nồng độ tính ngược từ đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

2.4.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [4]

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử

có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết định lượng được trong điều kiện thí nghiệm

cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó

tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 3 (S/N=3)

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 10 (S/N=10) Có thể tính LOQ từ LOD bằng công thức: 𝐿𝑂𝑄 = 10

3 ×𝐿𝑂𝐷

2.4.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi [4]

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) thể hiện sự gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các

phép đo lặp lại, độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD%

Độ đúng là khái niệm định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ