Nghiên cứu xác định độc tố ergosin trong ngũ cốc bằng phương pháp LC MS MS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MẾN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ ERGOSIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MẾN MÃ SINH VIÊN: 1501328 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ ERGOSIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Hà Bình PGS TS Lê Đình Chi Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Hà Bình PGS.TS Lê Đình Chi – người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị khoa Độc học dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt Ths Nguyễn Thị Hà Bình nhiệt tình giúp đỡ em trình thực đề tài Viện Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình ln bên cạnh ủng hộ, động viên để em hồn thành khóa luận cách tốt Trong trình thực hiện, dù cố gắng không tránh khỏi nhiều thiếu sót, kính mong nhận bảo, đánh giá từ quý thầy cô người Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Mến i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ergosin 1.1.1 Khái quát Ergosin 1.1.2 Cấu trúc Ergosin 1.1.4 Tính chất hóa lý Ergosin 1.1.5 Độ ổn định Ergosin 1.1.6 Độc tính Ergosin 1.1.6.1 Biểu hiện, chế 1.1.6.2 Tình hình nhiễm độc 1.1.7 Quy định hành với Ergosin 1.2 Phương pháp xác định độc tố Ergosin 10 1.2.1 Phương pháp chiết 11 1.2.2 Phương pháp làm 11 1.2.3 Phương pháp xác định 13 1.2.3.1 ELISA 13 1.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng 13 1.2.3.3 Điện di mao quản 14 1.2.3.4 Sắc ký khí 14 1.2.3.5 Sắc ký lỏng 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị 17 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2.1.1 Thiết bị 17 2.2.1.2 Dụng cụ 17 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 18 2.2.3 Chất chuẩn 18 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Xây dựng quy trình xác định Ergsine yến mạch 19 2.3.1.1 Khảo sát điều kiện xác định độc tố Ergosin LC-MS/MS 19 ii 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 19 2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng 20 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20 2.3.4 Tiến hành phương pháp mẫu thực 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 20 2.4.1.1 So sánh lựa chọn quy trình chiết 21 2.4.1.2 Khảo sát phương pháp chiết 22 2.4.1.3 Khảo sát trình làm – chiết phân tán pha rắn (d-SPE): 23 2.4.1.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu: 24 2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 24 2.4.3 Phương pháp thẩm định 25 2.4.3.1 Độ thích hợp hệ thống 25 2.4.3.2 Tính đặc hiệu 25 2.4.3.3 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 25 2.4.3.4 Khoảng tuyến tính - Đường chuẩn 26 2.4.3.5 Độ lặp lại độ thu hồi 26 2.4.4 Phương pháp lấy mẫu 27 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố Ergosin ngũ cốc 28 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 28 3.1.1.1 Điều kiện MS/MS 28 3.1.1.2 Khảo sát điều kiện LC 29 3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 31 3.1.2.1 So sánh lựa chọn quy trình chiết 31 3.1.2.2 Khảo sát môi trường chiết 32 3.1.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 32 3.1.2.4 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 33 3.1.2.5 Khảo sát thời gian chiết 34 3.1.2.6 Khảo sát loại chất hấp phụ 34 3.1.2.7 Khảo sát khối lượng chất hấp phụ 35 3.1.2.8 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 36 3.2 Thẩm định phương pháp 37 iii 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 37 3.2.2 Độ đặc hiệu 38 3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 39 3.2.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 39 3.2.5 Độ lặp lại độ thu hồi 39 3.3 Tiến hành phương pháp mẫu thực 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng chi tiết kết phân tích mẫu thực Phụ lục Kết khảo sát phương pháp chiết sắc ký đồ Phụ lục Kết thẩm định phương pháp Phụ lục Sắc đồ phân tích mẫu thực iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân nhóm ergopeptin Bảng 1.2 Môi trường chiết Ergosin 11 Bảng 1.3 Phương pháp làm mẫu 12 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu xác định Ergosin sử dụng LC/MS-MS 15 Bảng 2.1 Độc tố Ergosin sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc Ergosin 19 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích Ergosin 28 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS để phân tích Ergosin 29 Bảng 3.3 Chương trình gradient phân tích Ergosin 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mẫu với Ergosin 37 Bảng 3.5 Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống 38 Bảng 3.6 Số điểm IP Ergosin 38 Bảng 3.7 Kết thẩm định khoảng tuyến tính - đường chuẩn 39 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi Ergosin 40 Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu thực tế 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hệ thống vịng ergolin tetracyclic Hình 1.2 Cấu trúc chung ergopeptin Hình 1.3 Cấu trúc Ergosin Hình 1.4 Đồng phân cấu hình R S Ergosin Hình 1.5 Phản ứng epimer hóa peptid alcaloids C-8 Hình 3.1 Phổ khối ion Ergosin 28 Hình 3.2 Sắc đồ mảnh 31 Hình 3.3 Sắc đồ mảnh 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng phương pháp chiết đến hiệu suất chiết 31 Hình 3.5 Ảnh hưởng môi trường chiết đến hiệu suất chiết 32 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến hiệu suất chiết 33 Hình 3.7 Ảnh hưởng thể tích dung mơi chiết đến hiệu suất chiết 33 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết 34 Hình 3.9 Ảnh hưởng pha rắn đến hiệu suất chiết 35 Hình 3.10 Ảnh hưởng khối lượng PSA đến hiệu suất chiết 35 Hình 3.11 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 36 Hình 3.12 Đường chuẩn dung môi mẫu thực Ergosin 37 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 38 Hình 3.14 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ µg/kg 39 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Communities Hiệp hội cộng đồng phân tích thức CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản d-SPE Dispersive Solid Phase Extraction Chiết phân tán pha rắn EAs Ergot Alkaloids Ergot Alcaloids ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent Assay Kỹ thuật thử miễn dịch liên kết enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat FLD Fluorescent Detector Detector huỳnh quang GC-MS Gas chromatography Sắc ký khí HLB Hydrophilic Lipophilic Balance Cân thân nước thân dầu HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ hai lần LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng m/z Mass to charge ratio Tỷ số khối lượng/điện tích MeOH Methanol MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng MS Mass spectrometry Khối phổ QCVN - Quy chuẩn quốc gia RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn SXC Strong Cation Exchange Trao đổi cation mạnh TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultra Violet Tử ngoại vii ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, giá trị dinh dưỡng đem lại, nhu cầu sử dụng ngũ cốc (như yến mạch, đại mạch, lúa mì, …) chế phẩm từ ngũ cốc (sữa bột, thực phẩm ăn kiêng, bảo vệ sức khỏe, làm đẹp…) nước tăng mạnh Trong đó, đặc biệt yến mạch nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu chất xơ hòa tan; giúp bảo vệ tim mạch, giảm nguy bị tiểu đường, béo phì, hen suyễn trẻ ngăn ngừa ung thư Vì vậy, chế phẩm yến mạch ăn kiêng, giảm cân; sản phẩm làm đẹp cho phụ nữ, dinh dưỡng cho trẻ ngày phổ biến nước ta Nhưng sản phẩm nguyên liệu chế biến gần phải nhập hoàn tồn nên việc kiểm định, kiểm sốt chất lượng thực phẩm cịn nhiều khó khăn Mặt khác, ngũ cốc tiềm ẩn nhiều loại độc tố vi nấm đe dọa đến sức khỏe người dùng [14] Trong có Ergosin độc tố thuộc nhóm ergot alcaloids (EAs) sáu chất EFSA khuyến cáo theo dõi [2] Ergosin sinh lồi nấm Claviceps spp ký sinh ngũ cốc như: lúa mì, lúa mạch, yến mạch, … hình thành nên hạch nấm, tiết loại độc tố Khi tiêu thụ ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc chứa hạch nấm, người bị ngộ độc cấp tính co giật với triệu chứng nhiễm độc thần kinh trung ương ngộ độc mạn tính hoại thư [14] Đồng thời, Ergosin dễ bị chuyển từ dạng có độc tính sang dạng khơng độc ngược lại trình bảo quản nguyên liệu, chế biến phân tích nên gây cản trở việc phát kiểm soát hàm lượng [25] Tại Việt Nam, Bộ Y tế có quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia giới hạn nhiễm độc vi nấm thực phẩm QCVN 8-1:2011/BYT với quy chuẩn aflatoxin, ochratoxin, patulin, deoxynivalenol, zearalenone, fumonisin thực phẩm Nhưng quy chuẩn chưa có quy định giới hạn cho phép hàm lượng độc tố vi nấm Ergosin EAs khác, đặt nhiều nước giới [12] Hiện nay, giới chưa có phương pháp kiểm nghiệm thức cho EAs quy định hàm lượng tối đa chưa cụ thể cho EAs [7],[13] Tại Việt Nam, chưa có khảo sát loại độc tố nhóm Do đó, đề tài “Nghiên cứu xác định độc tố Ergosin ngũ cốc phương pháp LC-MS/MS” thực với mục tiêu sau: PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng chi tiết kết phân tích mẫu thực STT Mã số mẫu Ergosin (µg/kg) Yến mạch ăn liền - 01 KPH Yến mạch ăn liền - 02 KPH Yến mạch ăn liền - 03 KPH Yến mạch ăn liền - 04 KPH Yến mạch ăn liền - 05 21,9 Yến mạch ăn liền - 06 KPH Yến mạch ăn liền - 07 KPH Yến mạch ăn liền - 08 KPH Yến mạch ăn liền - 09 KPH 10 Yến mạch ăn liền - 10 KPH 11 Yến mạch ăn liền - 11 KPH 12 Yến mạch ăn liền - 12 KPH 13 Yến mạch ăn liền - 13 KPH 14 Yến mạch ăn liền - 14 5,3 15 Yến mạch ăn liền - 15 KPH 16 Yến mạch ăn liền - 16 < LOQ 17 Yến mạch ăn liền - 17 KPH 18 Yến mạch ăn liền - 18 KPH 19 Yến mạch ăn liền - 19 KPH 20 Yến mạch ăn liền - 20 KPH 21 Yến mạch ăn liền - 21 KPH 22 Yến mạch ăn liền - 22 KPH STT Mã số mẫu Ergosin (µg/kg) 23 Yến mạch ăn liền - 23 KPH 24 Yến mạch ăn liền - 24 KPH 25 Yến mạch ăn liền - 25 KPH 26 Yến mạch ăn liền - 26 KPH 27 Yến mạch ăn liền - 27 KPH 28 Yến mạch ăn liền - 28 KPH 29 Yến mạch ăn liền - 29 < LOQ 30 Yến mạch ăn liền - 30 KPH 31 Bột ăn dặm yến mạch - 01 KPH 32 Bột ăn dặm yến mạch - 02 KPH 33 Bột ăn dặm yến mạch - 03 KPH 34 Bột ăn dặm yến mạch - 04 KPH 35 Bột ăn dặm yến mạch - 05 KPH 36 Bột ăn dặm yến mạch - 06 KPH 37 Bột ăn dặm yến mạch - 07 KPH 38 Bột ăn dặm yến mạch - 08 < LOQ 39 Bột ăn dặm yến mạch - 09 KPH 40 Bột ăn dặm yến mạch - 10 KPH 41 Bột ăn dặm yến mạch - 11 KPH 42 Bột ăn dặm yến mạch - 12 KPH 43 Bột ăn dặm yến mạch - 13 KPH 44 Bột ăn dặm yến mạch - 14 KPH 45 Bột ăn dặm yến mạch - 15 KPH 46 Bột ăn dặm yến mạch - 16 KPH STT Mã số mẫu Ergosin (µg/kg) 47 Bột ăn dặm yến mạch - 17 KPH 48 Bột ăn dặm yến mạch - 18 KPH 49 Bột ăn dặm yến mạch - 19 KPH 50 Bột ăn dặm yến mạch - 20 KPH 51 Bột ăn dặm yến mạch - 21 KPH 52 Bột ăn dặm yến mạch - 22 KPH 53 Bột ăn dặm yến mạch - 23 < LOQ 54 Bột ăn dặm yến mạch - 24 KPH 55 Bột ăn dặm yến mạch - 25 KPH 56 Bột ăn dặm yến mạch - 26 KPH 57 Bột ăn dặm yến mạch - 27 KPH 58 Bột ăn dặm yến mạch - 28 KPH 59 Bột ăn dặm yến mạch - 29 KPH 60 Bột ăn dặm yến mạch - 30 KPH 61 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 01 KPH 62 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 02 KPH 63 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 03 KPH 64 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 04 KPH 65 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 05 < LOQ 66 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 06 KPH 67 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 07 KPH 68 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 08 KPH 69 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 09 KPH 70 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 10 KPH STT Mã số mẫu Ergosin (µg/kg) 71 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 11 KPH 72 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 12 KPH 73 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 13 KPH 74 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 14 KPH 75 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 15 KPH 76 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 16 KPH 77 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 17 KPH 78 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 18 < LOQ 79 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 19 KPH 80 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 20 KPH 81 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 21 KPH 82 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 22 KPH 83 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 23 KPH 84 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 24 KPH 85 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 25 KPH 86 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 26 KPH 87 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 27 KPH 88 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 28 KPH 89 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 29 KPH 90 Cháo dinh dưỡng yến mạch - 30 KPH 91 Yến mạch ăn liền - thêm chuẩn µg/kg 1,08 92 Bột ăn dặm yến mạch - thêm chuẩn µg/kg 1,07 93 Cháo dinh dưỡng yến mạch - thêm chuẩn µg/kg 1,16 KPH: không phát Phụ lục Kết khảo sát phương pháp chiết sắc ký đồ Phụ lục 2-1 So sánh lựa chọn quy trình chiết Quy trình chiết Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) QT 2140000 127,4 QT 1920000 108,3 QT 3.1 1470000 87,5 QT 3.2 1020000 60,7 QT 314000 18,7 QT 174000 10,4 Phụ lục 2-2 Khảo sát mơi trường chiết Mơi trường chiết Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) Môi trường acid 1620000 70,7 Môi trường trung tính 1490000 65,1 Mơi trường kiềm 2040000 89,1 Phụ lục 2-3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Tỷ lệ dung mơi chiết Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) 75:25 1580000 79,8 80:20 1650000 83,3 85:15 1760000 88,9 90:10 1690000 85,4 Phụ lục 2-4 Khảo sát thể tích dung mơi chiết Thể tích dung mơi chiết (mL) Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) 10 1260000 75,0 15 1340000 79,8 20 1390000 82,7 25 1550000 92,3 30 1450000 86,3 35 1420000 84.52 Phụ lục 2-5 Khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết (phút) Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) 10 1570000 79,3 30 1770000 89,4 60 1630000 84,8 90 1590000 80,3 Phụ lục 2-6 Khảo sát loại chất hấp phụ Loại chất hấp phụ Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) 0,05 g C18 1630000 83,6 0,05 g PSA 1920000 98,5 0,05 g PSA + 0,05 g C18 1930000 98,9 0,05 PSA + 0,05 g C18 + 0,15 MgSO4 1670000 85,6 0,05 PSA + 0,15 MgSO4 254000 13,0 0,05 g C18 + 0,15 MgSO4 141000 7,23 Phụ lục 2-7 Khảo sát khối lượng chất hấp phụ Khối lượng chất hấp phụ (mg) Diện tích pic Hiệu suất chiết (%) 30 1610000 82,6 50 1970000 101,1 70 1900000 97,4 100 1870000 95,9 150 1850000 94,9 Phụ lục Kết thẩm định phương pháp Phụ lục 3-1 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Phụ lục 3-2 Độ thu hồi độ lặp lại Mức µg/kg Mức 10 µg/kg Mức 100 µg/kg Phụ lục Sắc đồ phân tích mẫu thực Mẫu âm tính Mẫu dương tính ... loại độc tố nhóm Do đó, đề tài ? ?Nghiên cứu xác định độc tố Ergosin ngũ cốc phương pháp LC- MS/ MS” thực với mục tiêu sau: 1 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định Ergosin yến mạch phương pháp. .. LUẬN 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố Ergosin ngũ cốc 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC- MS/ MS 3.1.1.1 Điều kiện MS/ MS Để xác định ion phân tử ion sản phẩm Ergosin, dung dịch chuẩn Ergosin. .. epimer hóa Bảng 1.4 liệt kê số nghiên cứu xác định Ergosin sử dụng LC/ MS- MS Bảng 1.4 Một số nghiên cứu xác định Ergosin sử dụng LC/ MS- MS Tác giả Nền mẫu Chế độ MS/ MS LOQ (µg/kg) Rayane Mohamed