Xác định dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ THANH LOAN XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CĨ TRONG NƢỚC THẢI NI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ THANH LOAN XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CĨ TRONG NƢỚC THẢI NI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số : 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học – Khóa: 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS Đinh Thị Thanh Loan Thầy hƣớng dẫn: TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, LC –MS/MS, nƣớc thải, phenicol, quinolon Mở đầu: Kháng sinh đóng vai trị quan trọng chăm sóc sức khỏe nhân dân, phịng trị bệnh chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý gây nên tƣợng kháng thuốc, tồn dƣ thuốc nƣớc thải, vật ni Bên cạnh đó, lây lan chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày trở nên đáng báo động Do có phổ kháng khuẩn rộng khả phân bố tốt nên nhóm phenicol nhóm quinolon đƣợc dùng phổ biến Trong đó, đƣợc sử dụng nhiều cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin Hiện nay, có số nghiên cứu phân tích riêng lẻ kháng sinh phƣơng pháp LC-MS/MS nhƣng chƣa có cơng bố định lƣợng đồng thời kháng sinh trên, đặc biệt mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có mẫu nƣớc thải ni trồng thủy sản Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản kỹ thuật UPLC-MS/MS với phận ion hóa phun điện tử Các kháng sinh nội chuẩn đƣợc tách cột sắc ký pha đảo, sử dụng hệ pha động gồm acetonitril, methanol, nƣớc chứa acid formic Qui trình định lƣợng đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn EC-657/2002 Kết quả: Cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, nội chuẩn cloramphenicol-d5 norfloxacin đƣợc ion hóa kiểu ESI với kỹ thuật ghi phổ MRM để thu đƣợc mảnh mẹ mảnh dùng cho định lƣợng lần lƣợt nhƣ sau: m/z 321,14  152,01, m/z 356,14  335,94, m/z 354,14  184,98, m/z 362,22  261,03, m/z 332,29  231,08, m/z 360,35  245,17, m/z 326,14  156,95, m/z 320,16  233,01 Điều kiện sắc ký bao gồm cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4,6 mm; 3,5 µm), pha động gồm acetonitril, methanol, nƣớc chứa acid formic theo chƣơng trình gradient, tốc độ dòng ml/phút Miền giá trị kháng sinh nằm khoảng 1200 ppb (r > 0,99) Giới hạn phát giới hạn định lƣợng kháng sinh lần lƣợt nằm khoảng 0,1-1 ppb 0,4-4 ppb Các tiêu tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đề tài xây dựng thẩm định thành cơng qui trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacinn, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp UPLC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Do đó, qui trình đƣợc ứng dụng để xác định dƣ lƣợng kháng ản Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 SIMULTANEOUS DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN IN AQUACULTURE WASTEWATER BY LC-MS/MS Dinh Thi Thanh Loan Supervisor: Dr Do Chau Minh Vinh Tho, Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: LC-MS/MS, wastewater, chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, quinolone, phenicol Introduction: Antibiotics play an important role in people's health care, prevention and treatment in livestock and aquaculture However, unreasonably antibiotics use cause drug resistance, drug residues in wastewater, and livestock In addition, the spread of resistant strains of bacteria is becoming increasingly alarming Due to its broad spectrum of antibacterial activity and its ability to distribute well, phenol and quinolone are commonly used The most commonly used ones are chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin At present, there are some studies on analyzing separately these antibiotics by LC-MS/MS methods, but there is no published quantitative information on these antibiotics, especially in aquaculture wastewater samples Materials and methods Object of study: Chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin in aquaculture wastewater samples Methods: A method for quantification of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin in aquaculture wastewater was developed by UPLC-MS/MS equipped with an electrospray ionization source Six antibiotics and internal standards (IS) were seperated on a C18 reversed phase column, and finally eluted with acetonitrile, methanol, and water with formic acid The assay was validated in compliance with EC-657/2002 guideline Results: Electrospray ionization source operated in positive and negative mode, and multi reaction monitoring (MRM) mode were applied for analysis of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, chloramphenicol-d5 IS, and norfloxacin, using the transition of m/z 332.29  231.08, m/z 362.22  261.03, m/z 360.35  245.17, m/z 320.16  233.01, m/z 321.14  152.01, m/z 326.14  156.95, m/z 354.14  184.98, m/z 356.14  335.94, respectively for quantification LC conditions contain Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4.6 mm; 3.5 µm) column, mobile phase of acetonitrile – methanol - water with formic acid in gradient mode, and flow rate of mL/min This method was validated and met the requirements of widely linearity range (1-200 ppb) with high correlation coefficient (r > 0.99), very good accuracy (recovery of 81.2-109.2%) and intra-day precision (RSD < 6.63%), and typical LOD and LOQ values in the range of 0.1-1 ppb and 0.4-4 ppb for six antibiotics, respectively Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin in aquaculture wastewater was successfully developed and validated This method can be useful for monitoring level of these antibiotics in aquaculture wastewater samples LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn đƣợc đảm bảo tính trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Ngƣời cam đoan Đinh Thị Thanh Loan i MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA TĨM TẮT LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin 1.1.1 Tổng quan cloramphenicol 1.1.1.1 Cấu trúc, tên hóa học 1.1.1.2 Tính chất 1.1.1.3 Định tính 1.1.1.4 Định lƣợng 1.1.1.5 Dƣợc lý chế tác dụng 1.1.1.6 Tác dụng phụ độc tính 1.1.2 Tổng quan florfenicol 1.1.2.1 Cấu trúc, tên hóa học 1.1.2.2 Tính chất 1.1.2.3 Định tính 1.1.2.4 Định lƣợng 1.1.2.5 Dƣợc lý chế tác dụng 1.1.2.6 Tác dụng phụ độc tính ii 1.1.3 Tổng quan thiamphenicol 1.1.3.1 Cấu trúc, tên hóa học 1.1.3.2 Tính chất 1.1.3.3 Định tính 1.1.3.4 Định lƣợng 1.1.3.5 Dƣợc lý chế tác dụng 1.1.3.6 Tác dụng phụ độc tính 1.1.4 Tổng quan ofloxacin 1.1.4.1 Cấu trúc, tên hóa học 1.1.4.2 Tính chất 1.1.4.3 Định tính 1.1.4.4 Định lƣợng 10 1.1.4.5 Dƣợc lý chế tác dụng 10 1.1.4.6 Tác dụng phụ độc tính 10 1.1.5 Tổng quan ciprofloxacin hydroclorid 11 1.1.5.1 Cấu trúc, tên hóa học 11 1.1.5.2 Tính chất 11 1.1.5.3 Định tính 11 1.1.5.4 Định lƣợng 12 1.1.5.5 Dƣợc lý chế tác dụng 13 1.1.5.6 Tác dụng phụ độc tính 13 1.1.6 Tổng quan enrofloxacin 14 1.1.6.1 Cấu trúc, tên hóa học 14 1.1.6.2 Tính chất 14 1.1.6.3 Định tính 14 1.1.6.4 Định lƣợng 14 1.1.6.5 Dƣợc lý chế tác dụng 15 1.1.6.6 Tác dụng phụ độc tính 15 1.2 Ảnh hƣởng dƣ lƣợng kháng sinh nƣớc thải 16 iii 1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến phƣơng pháp định lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải phƣơng pháp LC-MS/MS 17 1.4 Tổng quan phƣơng pháp lấy mẫu bảo quản mẫu nƣớc thải 20 1.4.1 Phƣơng pháp lấy mẫu nƣớc thải 20 1.4.1.1 Địa điểm lấy mẫu 20 1.4.1.2 Thời gian lấy mẫu phân tích mẫu 20 1.4.1.3 Số lƣợng lấy mẫu 20 1.4.1.4 Yêu cầu chất lƣợng bình chứa mẫu 21 1.4.1.5 Phƣơng pháp lấy mẫu 21 1.4.1.6 Thiết bị lấy mẫu 22 1.4.1.7 Thể tích lấy mẫu 22 1.4.2 Phƣơng pháp bảo quản mẫu nƣớc thải 22 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 23 2.3.1 Hóa chất, thuốc thử 23 2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu nội chuẩn 23 2.3.3 Trang thiết bị 24 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 25 2.4.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn 25 2.4.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 25 2.4.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 26 2.4.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 27 2.4.1.5 Khảo sát ổn định mẫu 29 iv 2.4.1.6 Khảo sát ảnh hƣởng nhiễu lên chất phân tích 29 2.4.2 Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 29 2.4.2.1 Tính tƣơng thích hệ thống 29 2.4.2.2 Tính đặc hiệu 29 2.4.2.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 30 2.4.2.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 31 2.4.2.5 Độ độ xác 31 2.4.3 Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có số mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 33 3.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn 33 3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 34 3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 39 3.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 46 3.1.5 Khảo sát ổn định mẫu 47 3.1.6 Khảo sát ảnh hƣởng nhiễu lên chất phân tích 48 3.2 Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 49 3.2.1 Tính phù hợp hệ thống 49 3.2.2 Tính đặc hiệu 50 3.2.3 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 53 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 54 v 3.2.5 Độ độ xác 56 3.3 Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin số mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản phƣơng pháp LC-MS/MS 57 Chƣơng BÀN LUẬN 60 4.1 Xây dựng quy trình định lƣợng 60 4.1.1 Khảo sát nội chuẩn 60 4.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ƣu 60 4.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 64 4.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp 67 4.1.5 Khảo sát ổn định mẫu phân tích 68 4.1.6 Khảo sát ảnh hƣởng nhiễu lên chất phân tích 68 4.2 Thẩm định quy trình định lƣợng 68 4.2.1 Tính tƣơng thích hệ thống 68 4.2.2 Tính đặc hiệu 69 4.2.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 70 4.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 70 4.2.5 Độ độ xác 71 4.3 Ứng dụng quy trình định lƣợng thẩm định 71 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 5.1 Kết luận 72 5.2 Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-40 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-41 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Compound name: Thiamphenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-42 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-43 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-44 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Compound name: Florfenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-45 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-46 Phụ lục Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng S/N xác định LOD, LOQ ciprofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-47 S/N xác định LOD, LOQ ofloxacin S/N xác định LOD, LOQ enrofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-48 S/N xác định LOD, LOQ cloramphenicol S/N xác định LOD, LOQ thiamphenicol S/N xác định LOD, LOQ florfenicol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-49 Phụ lục Kết phân tích mẫu thử Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Cà Mau Compound name: Ciprofloxacin Compound name: Ciprofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Ciprofloxacin Compound name: Ciprofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-50 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Enrofloxacin Compound name: Enrofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-51 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Enrofloxacin Compound name: Enrofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-52 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Ofloxacin Compound name: Ofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-53 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Compound name: Ofloxacin Compound name: Ofloxacin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-54 ... Mã số: 8720210 XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC- MS/ MS Đinh Thị Thanh... THỊ THANH LOAN XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CĨ TRONG NƢỚC THẢI NI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC- MS/ MS Ngành: Kiểm... enrofloxacin có nước thải nuôi trồng thủy sản phương pháp LC- MS/ MS” đƣợc thực với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin,