Báo cáo nghiệm thu Tối ưu hóa điều KIỆN PHẢN ỨNG TỔNG hợp FELODIPIN

Hiện nay, tuy đã có nhiều công trình công bố qui trình điều chế felodipin (với nguồn nguyên liệu đầu, hệ xúc tác, dung môi phản ứng…khác nhau), nhưng phần lớn các công bố này khi áp dụng sản xuất vẫn còn nhiều bất cập, ví dụ hiệu suất không cao, nguyên liệu không sẵn có, điều kiện tiến hành không thực hiện được với trang thiết bị sẵn có trong nước.

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

 * 

BÁO CÁO NGHIỆM THU

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TỔNG HỢP FELODIPIN

Chủ nhiệm đề tài: TRẦN BỘI CHÂU

Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2011

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng tổng hợp Felodipin

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Trần Bội Châu

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện: 12/2009 -12/2010

Kinh phí được duyệt: 80.000.000

Kinh phí đã cấp: 62.250.000 theo TB số: 327/HĐ - SKHCN ngày 23/12/2009

2 Mục tiêu

Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng trong qui mô phòng thí nghiệm để tổng hợpfelodipin đạt tiêu chuẩn dược dụng (BP-2009) Đề tài nhằm làm tiền đề cho sựxây dựng qui trình sản xuất ở mức độ lớn hơn (pilot), từ đó có thể ứng dụng vàosản xuất công nghiệp góp phần phát triển ngành công nghiệp Hóa dược nướcnhà Cụ thể

- Chọn phương pháp với nguồn nguyên liệu để điều chế felodipin phù hợpđiều kiện trang thiết bị, hóa chất sẵn có

- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, tinh chế để thu được felodipin hiệu suấtcao, đạt tiêu chuẩn dược dụng

3 Nội dung

Hiện nay, tuy đã có nhiều công trình công bố qui trình điều chế felodipin (vớinguồn nguyên liệu đầu, hệ xúc tác, dung môi phản ứng…khác nhau), nhưngphần lớn các công bố này khi áp dụng sản xuất vẫn còn nhiều bất cập, ví dụhiệu suất không cao, nguyên liệu không sẵn có, điều kiện tiến hành không thựchiện được với trang thiết bị sẵn có trong nước

Vì vậy, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm

- Chọn một phương pháp điều chế felodipin phù hợp điều kiện trang thiết bị,hóa chất sẵn có

trợ của phần mềm JMP 4.0 để thu felodipin có hiệu suất cao

- Kiểm nghiệm sản phẩm theo một số tiêu chuẩn về định tính và định lượngtrong BP 2009

4 Sản phẩm của đề tài:

- Quy trình điều chế Felodipin với các thông số tối ưu : thực hiện được ở quy

mô phòng thí nghiệm cho sản phẩm đạt tiêu chuẩn dược dụng

- Bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành (Tạp chí Dược học hoặc Tạp chíHóa học)

- Soạn bài thực hành sau đại học dùng cho công nghệ hóa học, hóa dược

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. TỔNG QUAN VỀ FELODIPIN

1.1.1 Tên khoa học và tính chất của felodipin [6]

Tên IUPAC: 3-ethyl-5-methyl dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-Công thức cấu tạo:

Khối lượng phân tử: 384.26g/mol

Bảo quản:ở nhiệt độ phòng dưới 30oC, tránh ẩm và tránh ánh sáng

Thải trừ: khoảng 70% liều dùng được bài tiết dưới dạng chuyển hóa trongnước tiểu Felodipin có độ thanh thải cao với độ thanh thải trung bình trong máu là1200ml/phút Thời gian bán thải trung bình ở pha cuối là 14 giờ Không có sự tíchlũy đáng kể khi điều trị dài hạn.

Tác dụng dược lý

Felodipin là một chất ức chế kênh calcium chọn lọc trên mạch máu, làmgiảm áp lực máu động mạch do làm giảm sức cản mạch máu toàn thân Do có tínhchọn lọc cao trên cơ trơn của tiểu động mạch nên khi sử dụng ở liều điều trị khôngtác dụng trực tiếp lên tính co bóp và dẫn truyền của cơ tim

Felodipin có tác dụng lợi tiểu, thải trừ natri nhẹ và không gây ứ dịch trong cơthể

Felodipin có hiệu quả ở tất cả các mức độ tăng huyết áp

Felodipin có tác dụng chống đau thắt ngực và chống thiếu máu cục bộ do cảithiện sự cân bằng cung-cầu oxi cơ tim

Felodipin có hiệu quả và dung nạp tốt trên người lớn không kể tuổi tác,chủng tộc, và khi bệnh nhân có bệnh lý khác cùng lúc như suy tim sung huyết, hen,các bệnh phổi tắt nghẽn khác,…

Tác dụng phụ: có thể gây đỏ bừng mặt, nhức đầu, đánh trống ngực, choángváng, mệt mỏi thoáng qua Hạ huyết áp, phù, dị ứng da (ngứa, phát ban,…)

Một số chế phẩm chứa felodipin: viên nén 2,5mg; 5mg; 10mg

1.1.2 Tiêu chuẩn felodipin dược dụng B.P 2009 [14]

Định tính

A: Hòa tan 50mg felodipin trong methanol và pha loãng tới vạch trong bình

định mức 100ml Hút 3ml dung dịch vừa pha tiếp tục pha loãng trong methanol đếnvạch định mức 100ml Kiểm tra ở bước sóng 220-400nm, dung dịch có 2 đỉnh hấpthụ cực đại ở bước sóng 361nm và 238nm là 0,34-0,36

B: Khảo sát bằng quang phổ hồng ngoại rồi so sánh với phổ hồng ngoại của

felodipin chuẩn

C: khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng tráng silicagel GF 254

- Dung dịch thử: hòa tan 10mg chất thử trong 10ml methanol

- Dung dịch đối chiếu (a): hòa tan 10mg felodipin chuẩn trong 10mlmethanol

- Dung dịch đối chiếu (b): hòa tan 5mg nifedipin chuẩn trong 5ml dung dịchđối chiếu (a)

- Chấm mỗi dung dịch 5l Khai triển trên bản mỏng với đường đi của dungmôi là 15cm, hệ dung môi là ethyl acetat : cyclohexan (40:60) Làm khô bảnmỏng trong không khí và kiểm tra dưới ánh sáng 254nm Vết chính trên sắc

ký thu được của dung dịch thử tương tự về vị trí, độ phát quang và kíchthước so với dung dịch đối chiếu (a) Kết quả sẽ không có giá trị nếu dungdịch đối chiếu (b) cho 2 vết không rõ ràng

D: hòa tan 150mg chất thử trong hỗn hợp 25ml 2-methyl-2-propanol và

25ml dung dịch acid percloric Thêm 10ml ceri sulphat 0,1M để yên 15 phút Thêm3,5ml NaOH đậm đặc và trung hòa bằng NaOH loãng Lắc với 25mldicloromethan Làm bay hơi lớp dưới đến khô trong bồn chứa nitrogen (chất cặn bãđược dùng để thử các chất liên quan) Pha loãng 20mg chất cặn bã trong 50mlmethanol Hút 2ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 50ml pha loãng đếnvạch định mức Kiểm tra ở khoảng phổ 220-400nm Dung dịch có độ hấp thụ cựcđại ở bước sóng 273nm

Thử

Dung dịch S: hòa 1g chất thử trong 20ml methanol.

Dung dịch S phải trong suốt

Độ hấp thu dung dịch S ở bước sóng 440nm không lớn hơn 0,1

Những tạp chất liên quan: khảo sát bằng sắc ký lỏng

Dung dịch thử: hòa 25mg chất thử trong 50ml pha động

Dung dịch đối chiếu (a): hòa 1ml dung dịch thử trong 100ml pha động.Dung dịch đối chiếu (b): hòa 1ml dung dịch đối chiếu (a) trong 10ml phađộng

Dung dịch đối chiếu (c): hòa 50mg chất cặn bã thu được ở định tính D (tạpchất A) và 25 mg felodipin chuẩn trong 50ml pha động Hút 1ml pha loãng thành100ml trong pha động

Quy trình sắc ký được tiến hành như sau:

 Cột sắc ký bằng thép không gỉ dài 0,125-0,15m, đường kính trong 4mmđược nhồi với octadecylsilyl silicagel kích thước hạt 5m

 Pha động: hỗn hợp methanol: acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH=3(0,8g/l H3PO4 và 8g/l NaH2PO4) theo tỷ lệ 20:40:40

 Phát hiện ở bước sóng 254nm

 Bơm 20l dung dịch đối chiếu (c) Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao chochiều cao của 2 peak không nhỏ hơn 20% tổng chiều cao của sắc ký đồ Sựphân giải giữa peak thứ nhất (tạp chất A) và peak felodipin nhỏ nhất là 2,5.Hai peak khác có thể quan sát được tương ứng với tạp chất B và tạp chất C.Các chất rửa giải theo thứ tự: tạp A, tạp B, felodipin và tạp C

 Bơm 20l dung dịch thử, 20l dung dịch đối chiếu (a) và 20l dung dịchđối chiếu (b), tiếp tục sắc ký lần thứ 2, thời gian lưu của felodipin là 12phút

 Trên sắc ký đồ của dung dịch thử: tổng diện tích của tạp B và C không lớnhơn diện tích của peak đặc trưng trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a)(1.0%) Đối với mỗi tạp chất có diện tích peak không lớn hơn diện tích peakđặc trưng trong sắc ký đồ ở dung dịch đối chiếu (b) (0.1%) Tổng diện tíchcác peak tạp chất không lớn hơn 3 lần diện tích của peak đặc trưng trên sắc

ký đồ của dung dịch đối chiếu (b) (0.3%) Bỏ qua peak có diện tích nhỏ hơn0,2 lần peak đặc trưng trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b) (0.02%)

Mất khối lượng do sấy khô: khối lượng không giảm quá 0.5% xác định trên

1.000g chế phẩm đã sấy khô ở 105oC trong 3 giờ

Tro sulphate: không lớn hơn 0.1% trên 1.0g chế phẩm

Định lượng: hòa tan 0.160g trong 25ml 2-methyl-2-propanol và 25ml dung

dịch percloric acid Thêm 0.05ml ferroin Chuẩn độ với ceri sulphat 0.1M cho đếnkhi mất màu hồng

Tạp chất

A ethyl methyl 4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat

B R = CH3: dimethyl dicarboxylat

4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-C R = C2H5: diethyl dicarboxylat.

4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-1.1.1. Các phương pháp tổng hợp felodipin

Felodipin là dẫn chất thuộc dãy hợp chất có khung cơ bản dihydropyridin(1,4-DHPs) Các dẫn chất thuộc dãy này ngày nay được xác định lànhững thuốc quan trọng, chủ yếu trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp Mộtvài đại diện thuộc nhóm này như nifedipin, felodipin, nicardipin và amlodipin…được đưa ra thị trường dược phẩm toàn thế giới Các dẫn chất này được tổng hợpchủ yếu theo 2 phương pháp sau:

COOR' ROOC

Giai đoạn 1: ngưng tụ methyl acetoacetat với diclorobenzaldehyd thu đượcsản phẩm trung gian benzyliden (I)

Giai đoạn 2: ngưng tụ (I) với ethyl-3-aminocrotonat tạo felodipin

CO OEt MeOOC

H3C CH3

Cl Cl

Cl Cl

Cl Cl

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp felodipin theo phương pháp Knoevenagel

Cơ chế

Phản ứng ngưng tụ của methyl acetoacetat với diclorobenzaldehyd thubenzyliden xảy ra theo cơ chế ghép ái nhân:

H 3 C C O C H

H COOCH 3

OH

C H

COCH 3

COOCH3

+ Cl

Cl C

Cl

Cl CH

- O CH

COOCH 3

COCH3+H2O Cl

Cl CH

Cl

HC +

CH COOCH 3

COCH3

-H +

Cl

Cl HC

C COOCH 3

COCH3Phản ứng ngưng tụ của benzyliden và ethyl-3-aminocrotonat tạo felodipin xảy ratheo cơ chế:

O R

O

O R' H2N R '

OR '' O

O R'

N H

O R'

N H

- Nguồn nguyên liệu ban đầu sẵn có

- Trang thiết bị và điều kiện phản ứng đơn giản nên quá trình triển khai sảnxuất lớn sau này là khả thi

- Theo các tài liệu, hiệu suất có thể thay đổi từ 25-86% tùy theo các phươngpháp và điều kiện tiến hành phản ứng

1.1.4 Cơ sở lựa chọn phương pháp tổng hợp felodipin

 Từ các tài liệu thu thập được, nhận thấy các nghiên cứu đa phần sử dụngphương pháp Knoevenagel, trong đó phản ứng tổng hợp felodipin được tiếnhành qua 2 giai đoạn có thể không hoặc có tách sản phẩm trung gian M.B.I(của giai đoạn 1) Trong đó, nhận thấy các quy trình tổng hợp theo kiểuinsitu thường cho hiệu suất thấp và nhiều sản phẩm phụ hơn, độ tinh khiết

của sản phẩm không cao (US Pat 6,858,747B2; 5,977,369)

 Ngoài ra, do sản phẩm hình thành sau giai đoạn 1 là M.B.I dưới dạng hỗnhợp đồng phân E và Z (chỉ dạng E mới thích hợp điều chế felodipin) và dạng

E dễ kết tinh ở nhiệt độ thấp (khoảng 15oC) trong khi dạng Z khó kết tinhnên việc tiến hành tách sản phẩm dạng E để thực hiện tiếp giai đoạn 2 khá

khó khăn cho giai đoạn tinh chế (US Pat 0204604)

Cl

O O O

nhiều hệ xúc tác đã được nghiên cứu như acid acetic và piperidin (US Pat

4,600,778), cloroacetic acid và N-methylbenzylamin, picolinic acid và

piperidin (US Pat 6,858,747B2)…

 Xúc tác cho giai đoạn 2: Phản ứng cộng vòng của DCB và EAC có thể đượcxúc tác bởi bazơ, axit, hệ acid-bazơ hoặc cũng có thể không cần dùng xúc

tác Trong đó:

- Với xúc tác axit (thường dùng HCl): thời gian phản ứng nhanh (dưới 1 giờ)nhưng phản ứng lại có quy trình tổng hợp phức tạp, chế độ làm lạnh dài

(hơn 1 tuần), hiệu suất thu được không cao và nhiều tạp chất (US Pat

5,310,917), gây khó khăn cho việc tách chiết.

- Với phản ứng nhiệt cộng vòng: Phản ứng cộng vòng này không cần dùng

xúc tác nhưng thời gian phản ứng lâu (12 giờ) (US Pat 6,858,747B2) hoặc

24 giờ (US Pat 4,600,778) nhưng hiệu suất felodipin thu được không cao

- Với xúc tác bazơ: Phản ứng có quy trình đơn giản, việc tinh chế sản phẩm

dễ dàng và hiệu suất thu được tương đối cao (khoảng 85%)

 Vì vậy, việc tổng hợp felodipin sẽ được tiến hành qua 2 giai đoạn với xúc tácgiai đoạn một là hệ acid acetic-piperidin và xúc tác giai đoạn 2 là một bazơ nhưpyridin

1.2 SƠ LƯỢC VỀ CÁC PHẦN MỀM MÁY TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG

TRONG ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Việc sử dụng các phương pháp thống kê trong công nghiệp ngày càng giatăng Trong đó, thiết kế thống kê các thử nghiệm là một phương pháp hữu hiệu giúpcải thiện hiệu suất Nghiên cứu thử bằng cách làm sai một vài yếu tố ảnh hưởng đếnhiệu suất thì rất tốn kém về thời gian và tiền của Nhờ những nghiên cứu trong lĩnhvực “bố trí thí nghiệm” đã cho thấy có tiềm lực mạnh và là một phương phápnghiên cứu nhanh, hiệu quả JMP là một phần mềm của SAS Institue Inc giúp thiết

kế các bố trí thí nghiệm với nhiều mô hình khác nhau nhằm mục đích có thể tìm rahoặc dự đoán được những điều kiện tối ưu để thực hiện phản ứng mà không phảimất thời gian tiến hành nhiều phản ứng Hơn nữa, JMP còn cho phép phân tích dữliệu với những thuật toán về xác suất thống kê, đưa ra những minh họa cụ thể bằnghình ảnh (đồ thị, biểu đồ…), cung cấp nhiều công cụ để xử lý số liệu [1]

Mỗi loại mô hình thiết kế của JMP có những tính năng và mục đích khácnhau, trong đó thiết kế theo phương pháp đáp ứng bề mặt (Respones Surface

Methodology) cho phép tối ưu hóa thông số đáp ứng khi đã xác định các khoảng giátrị sẽ khảo sát cho từng yếu tố

Thiết kế đáp ứng bề mặt rất hữu dụng cho mô hình mặt cong (phương trìnhbậc 2) với các yếu tố liên tục Nếu một đáp ứng tối thiểu hay tối đa tồn tại bên trongmiền yếu tố thì mô hình đáp ứng bề mặt có thể xác định được điểm tối thiểu hay tối

đa đó [1] Với phương pháp đáp ứng bề mặt có thể lựa chọn mô hình CentralComposite Design hay mô hình Box-Benhken Một trong các điểm khác biệt quantrọng giữa 2 loại thiết kế này là thiết kế Box-Behnken không có điểm đỉnh trên hìnhkhối mà chỉ là dãy các yếu tố Điều này đôi khi có lợi trong trường hợp cần tránhcác điểm mà cần cân nhắc các điều kiện kỹ thuật Vào năm 1960, Box và Behnken

đã thiết kế mô hình thí nghiệm cho 3 yếu tố, trong đó mỗi yếu tố đều có 3 mức -1,

0, +1 ứng với mức thấp, mức trung bình, mức cao của một yếu tố thực Với 3 yếu tốkhảo sát này, số thí nghiệm tối thiểu cần phải tiến hành là 15 thí nghiệm, trong đó

có 12 thí nghiệm được đặt giữa các cạnh của khối lập phương (12 cạnh) và 3 thínghiệm nằm ở tâm của khối lập phương Với sự bố trí này thì khoảng cách từ cácđiểm thí nghiệm tới tâm phương án đều bằng nhau, hay nói cách khác là các điểmthí nghiệm nằm trên một hình cầu

Hình 1.1: Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Benhken

1.1.3. Phần mềm Matlab R2010b [4], [6]

Matlab (Matrix Laboratory) là một môi trường tính toán số và lập trình, đượcthiết kế bởi công ty MathWorks, cho phép tính toán số với ma trận, vẽ đồ thị hàm sốhay biểu đồ thông tin, thực hiện thuật toán, tạo các giao diện người dùng và liên kếtvới những chương trình máy tính viết trên nhiều ngôn ngữ lập trình khác

Matlab, nguyên sơ được viết bởi ngôn ngữ Fortran Đến năm 1983, JackLittle đã viết lại Matlab bằng ngôn ngữ C và được xây dựng thêm các thư viện phục

vụ cho thiết kế hệ thống điều khiển, hệ thống hộp công cụ (tool box), mô phỏng…

Từ đó, Matlab trở thành mô hình ngôn ngữ lập trình trên cơ sở ma trận Như vậy,Matlab không chỉ là một phần mềm mà còn là một ngôn ngữ lập trình, cho phépthực hiện các giải thuật, giao tiếp đồ họa dễ dàng Theo đó, các mã nguồn được viếtbằng ngôn ngữ matlab có thể chạy được ngay trên máy tính mà không cần phải biêndịch qua các tập tin thi hành

Như vậy, trong đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng Matlab như là một công cụdùng để thiết lập chương trình xử lý hình ảnh giúp tính toán diện tích vết sắc ký đồ.Theo đó vết sắc ký sẽ được tính toán diện tích với đơn vị đo lường là pixel ảnh

Một số khái niệm về kiểu ảnh trong Matlab

Ảnh grayscale: Mỗi ảnh được biểu diễn bởi một ma trận hai chiều, trong đógiá trị của mỗi phần tử cho biết độ sáng (hay mức xám) của điểm ảnh đó và có thểtrình bày theo 2 kiểu:

Kiểu double: mỗi phần tử có giá trị trong khoảng từ 0 – 1 Mức 0 tương ứng

với màu đen, mức 1 tương ứng với màu trắng

Kiểu uint8: Mỗi phần tử được biểu diễn dưới dạng là một số nguyên nằm

trong khoảng từ 0 đến 255, với mức 0 biểu diễn cho mức cường độ đen nhất và 255biểu diễn cho mức cường độ sáng nhất

Ảnh nhị phân: Ảnh được biểu diễn bởi một ma trận hai chiều thuộc kiểulogical Mỗi điểm ảnh chỉ có thể nhận một trong hai giá trị là 0 (đen) hoặc 1 (trắng)

Ảnh màu RGB: Còn gọi là ảnh “truecolor” do tính trung thực của nó Ảnhnày được biểu diễn bởi một ma trận ba chiều kích thước m x n x 3, với m x n là kíchthước ảnh theo pixels Các số tại mỗi phần tử của ma trận biểu diễn cho ba màuriêng rẽ gồm: đỏ (red), lục (green) và lam (blue)

CHƯƠNG II

THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU2.1 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất

Bảng 2.1: Các hóa chất được sử dụng

Tên hóa chất Hàm lượng (%) Xuất xứ

Bản sắc lý lớp mỏng tráng

2.1.2 Trang thiết bị

Cân phân tích Sartorius 224S

Bộ phản ứng 4 chỗ Eyela/Tokyo Rikakikai

Thiết bị làm lạnh sinh hàn Eyela PFR 1000

Máy cô quay Buchi

Micropipette thể tích 10-100lPipet chính xác 1ml

Máy hút chân không, phễu BuchnerBuồng soi UV Vilber Lourmat

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. Thiết lập chương trình xử lý hình ảnh tính toán diện tích vết sắc ký sử

dụng ngôn ngữ Matlab

Nguyên tắc:

Hình ảnh được cấu tạo từ rất nhiều các điểm nhỏ gọi là điểm ảnh hay pixel,điểm ảnh được xem như là dấu hiệu hay cường độ sáng tại một tọa độ trong khônggian của đối tượng

Trước tiên ảnh màu (RGB) sẽ được chuyển đổi thành ảnh xám (mỗi điểmảnh sẽ được loại bỏ các thông tin về màu và giữ lại những thông tin về độ sáng) vàmang giá trị trong khoảng 0 – 1 Những điểm ảnh có sự thay đổi nhanh hoặc đột

ngột về mức xám sẽ được xác định là những điểm biên giữa vật thể và môi trường

Ảnh xám (grayscale) này được tiếp tục chuyển đổi thành ảnh nhị phân (trắngđen) với hệ số mức chuyển đổi X thích hợp: các điểm ảnh mang giá trị lớn hơn hệ

số X sẽ nhận giá trị 1 và trở thành màu trắng và các điểm ảnh mang giá trị nhỏ hơn

hệ số X sẽ nhận giá trị 0 và trở thành màu đen

Từ hình trắng đen, ta coi hình ảnh như là một ma trận với nhiều hàng và cột,

sử dụng hàm nghịch đảo để chuyển giá trị 0 thành 1 và 1 thành 0, theo đó tính tổng

ma trận thì sẽ thu được tổng giá trị các điểm ảnh màu đen chính là diện tích pixel

của vật thể khảo sát.

Một số hàm được sử dụng để thiết lập chương trình xử lý ảnh:

I = rgb2gray ( ) : chuyển hình màu thành hình xám

Im2bw (I, level) : chuyển đổi hình xám sang hình trắng đen tùy thuộc vào hệ

số mức chuyển đổi lựa chọn

Imread ( ) : đọc hình ảnh.

Imshow ( ) : trình xuất hình ảnh

[r_X c_X] : xây dựng ma trận với hàng và cột

Sum ( ) : tính tổng giá trị

Num2str ( ) : chuyển dữ liệu dạng số sang dạng chuỗi

Figure ( ): tạo một cửa sổ mới cho trình xuất

2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng M.B.I và felodipin có

trong hỗn hợp sau phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [3] [6]

2.2.2.1 Khảo sát độ lặp lại

Khảo sát sự ổn định kết quả bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đối với dungdịch chuẩn và dung dịch thử bằng cách tiến hành sắc ký lớp mỏng cho cả mẫuchuẩn và mẫu thử để so sánh diện tích của vết sắc ký Đối với mỗi dung dịch chấm

3 vết lên bản mỏng, triển khai sắc ký ghi nhận hình ảnh ở bước sóng 254nm và tínhdiện tích của vết sắc ký thu được

a) M.B.I

Hệ dung môi triển khai là n-hexan – aceton (10:1)

Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10mg mẫu chuẩn hòa tan trong 1mlisopropyl ancol

Dung dịch thử: dung dịch sau phản ứng hút lấy 10l pha vừa đủ 200l dungdịch

b) Felodipin

Hệ dung môi khai triển cyclohexan – ethyl acetat (6:4)

Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10mg mẫu chuẩn hòa tan trong 1ml etanoltuyệt đối

Dung dịch thử: dung dịch sau phản ứng pha vừa đủ 10ml

2.2.2.2 Khảo sát tính tuyến tính

a) M.B.I

Xây dựng đường hồi quy tuyến tính diện tích vết của mẫu chuẩn M.B.I theonồng độ từ 0.0133g/ml đến 0.004g/ml bằng cách cân 6 mẫu chuẩn có khối lượngchính xác lần lượt là 0.0133g, 0.012g, 0.01g, 0.008g, 0.006g, 0.004g, sau đó dùngmicropipet hút chính xác 1ml isopropyl ancol cho lần lượt vào hòa tan các mẫu trênrồi triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định diện tích vết sắc ký thu được.

b) Felodipin

Xây dựng đường hồi quy tuyến tính diện tích vết của mẫu chuẩn M.B.I theo nồng

độ từ 0.0192g/ml đến 0.008g/ml bằng cách cân 6 mẫu chuẩn có khối lượng chínhxác lần lượt là 0.0192g, 0.018g, 0.016g, 0.014g, 0.012g, 0.01g, 0.008g, sau đó dùngmicropipet hút chính xác 1ml etanol tuyệt đối cho lần lượt vào hòa tan các mẫu trênrồi triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định diện tích vết sắc ký thu được

2.2.2.3 Khảo sát độ đúng

Độ đúng là mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực Độ đúngđược tiến hành bằng mẫu thử thêm chuẩn đối chiếu Tiến hành sắc ký lớp mỏng chodung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn đối chiếu:

- Với M.B.I :mẫu thử thêm 1mg và 2mg chuẩn đối chiếu

- Với felodipin: mẫu thử thêm 0.5mg, 1mg và 2mg chuẩn đối chiếu

Ghi nhận hình ảnh và tính diện tích của vết sắc ký thu được

2.2.3 Xác định và giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng đến

phản ứng tổng hợp M.B.I từ 2,3-dichlorobenzaldehyd và methyl acetoacetat

Có rất nhiều các tác nhân ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng của giai đoạnnày như: nhiệt độ, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng, thời gian, tỉ lệ chất xúc tác

so với nguyên liệu ban đầu, hệ xúc tác…Do điều kiện phòng thí nghiệm chưa cónhiều loại xúc tác khác nhau nên không khảo sát được nhiều hệ xúc tác mà sử dụng

hệ xúc tác cho giai đoạn này là piperidin và acid acetic

2.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ phản ứng thấp cho hiệu suất thấp và thời gian phản ứng kéo dàikhông hiệu quả về mặt kinh tế Tuy nhiên nhiệt độ cao có thể tạo các sản phẩm phụ

và ảnh hưởng đến tỷ lệ đồng phân E và Z trong khi đó chỉ có dạng đồng phân E mới

thích hợp để điều chế felodipin đạt chuẩn dược dụng Theo US Pat 6,858,747 B2

cho rằng phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt độ khoảng từ 30-60oC Vì thế, nghiêncứu này sẽ tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 30-70oC

Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và 0,116g(1mmol) methyl acetoacetat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1mlisopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-diclorobenzaldehyd là 1:10, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ, các phản ứng nàyđược thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau nằm trong khoảng 30-70oC

2.2.3.2 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng

Tỉ lệ mol tác chất có ảnh hưởng rất lớn đến việc hình thành sản phẩm phụ và

tỉ lệ mol giữa 2,3-diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat có thể 0,5-2 (US Pat

5,977,369) Trong nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát tỉ lệ mol giữa

2,3-diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat từ 1:0,8-1:1,3

Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và lượngmethyl acetoacetat thay đổi theo tỉ lệ từ 0,8-1,3 so với 2,3-diclorobenzaldehyd rồicho vào bình cầu dung tích 25ml,và thêm vào 1ml isopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của

hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-diclorobenzaldehyd là 1:10, nhiệt độ phản ứng

là 60oC, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ

2.2.3.3 Thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng ngắn cho hiệu suất thấp nhưng thời gian phản ứng kéodài thì không hiệu quả về mặt kinh tế và cho nhiều sản phẩm phụ Đối với giai đoạn

1 thì thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 3-18 giờ (US Pat 5,977,369), nghiên cứu

thực hiện khảo sát thời gian từ 4-10 giờ

Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và 0,116g(1mmol) methylacetoacetat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1mlisopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-

diclorobenzaldehyd là 1:10, ở nhiệt độ phản ứng là 60oC, các phản ứng này đượcthực hiện ở những khoảng thời gian 4, 6, 8, và 10 giờ.

Tất cả các phản ứng trên đều được thực hiện trong bình phản ứng 4 chỗ cógắn hệ thống sinh hàn và cài đặt tốc độ khuấy 185 vòng/phút Để đánh giá phảnứng, tất cả các hỗn hợp sau phản ứng được lấy ra 10l bằng micropipet và pha thêmisopropyl ancol sao cho thể tích dung dịch là 200l, chấm sắc ký bằng ống maoquản 5l, tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng Kết quả hình ảnh của bảng sắc ký sẽđược xử lý bằng phần mềm matlab để tính toán diện tích của vết M.B.I tạo thành

Từ đường chuẩn vết M.B.I đã xây dựng có thể suy ra nồng độ hàm lượng M.B.I củamẫu thử và tính toán sơ bộ hiệu suất của phản ứng

Dựa trên thông số hiệu suất phản ứng và tỉ lệ tạp chất tạo thành ở các điềukiện thăm dò, tiến hành giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng Ở mỗiyếu tố, mức giới hạn có thể giữ nguyên hoặc thay đổi so với điều kiện phản ứngtrong các tài liệu tham khảo sao cho hiệu suất sản phẩm tạo thành cao, tỉ lệ tạp chất

ít

2.2.4 Xác định và giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng đến

phản ứng tổng hợp felodipin từ M.B.I và ethyl-3-aminocrotonat.

Có rất nhiều các tác nhân ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng của giai đoạnnày như: nhiệt độ, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng, thời gian, tỉ lệ chất xúc tác

so với nguyên liệu ban đầu,…Xúc tác sử dụng trong phản ứng này là pyridin vàkhông khảo sát tỉ lệ mol xúc tác so với nguyên liệu ban đầu mà sử dụng xúc tác với

tỉ lệ 1:10 so với nguyên liệu ban đầu cho tất cả các phản ứng

2.2.4.1 Nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ phản ứng thấp cho hiệu suất thấp, tuy nhiên nhiệt độ cao có thể tạonhiều sản phẩm phụ gây khó khăn cho quá trình tinh chế, vì vậy cần phải khảo sátphản ứng ở khoảng nhiệt độ thích hợp sao cho hiệu suất phản ứng cao và sản phẩm

phụ ít Theo US Pat 5,310,917 cho rằng phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt độ

khoảng từ 50-140oC Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 40-90oC

Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và 0,0646g (0.5mmol)ethyl-3-aminocrotonat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệxúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ, cácphản ứng này được thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau nằm trong khoảng 40-

90oC trong bình phản ứng 4 chỗ có gắn hệ thống sinh hàn

2.2.4.2 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng

Tỉ lệ mol tác chất có ảnh hưởng rất lớn trong giai đoạn này vì liên quan đến

việc hình thành sản phẩm phụ khi lượng ethyl-3-aminocrotonat tăng lên Theo US.

Pat 6,858,747 B2 thì tỉ lệ mol ethyl-3-aminocrotonat có thể từ 0.8 đến 2 so với tỉ lệ

mol M.B.I Trong nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát tỉ lệ mol giữa M.B.I vàethyl-3-aminocrotonat từ 1:0,8-1:1,3

Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và lượng aminocrotonat thay đổi theo tỉ lệ từ 0,8-1,3 so với M.B.I rồi cho vào bình cầu dungtích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệ xúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, nhiệt

ethyl-3-độ phản ứng là 80oC, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ trong bình phản ứng 4chỗ có gắn hệ thống sinh hàn

2.2.4.3 Thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng ngắn cho hiệu suất thấp nhưng thời gian phản ứng kéodài thì không hiệu quả về mặt kinh tế và cho nhiều sản phẩm phụ Đối với giai đoạn

2 thì thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 8-30 giờ (US Pat 6,858,747 B2), nghiên

cứu thực hiện khảo sát thời gian từ 4-10 giờ

Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và 0,0646g (0.5mmol)ethyl-3-aminocrotonat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệ

xúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, ở nhiệt độ phản ứng là 80oC, các phản ứngnày được thực hiện ở những khoảng thời gian 4, 6, 8, và 10 giờ.

Tất cả các phản ứng trên đều được thực hiện trong bình phản ứng 4 chỗ càiđặt tốc độ khuấy 185 vòng/phút Để đánh giá phản ứng, tất cả các hỗn hợp sau phảnứng được định mức bằng etanol tuyệt đối đến 10ml, sau đó tiến hành sắc ký lớpmỏng Kết quả hình ảnh của bản sắc ký sẽ được xử lý bằng phần mềm matlab đểtính toán diện tích của vết felodipin tạo thành Từ đường chuẩn vết felodipin đã xâydựng có thể suy ra nồng độ hàm lượng felodipin của mẫu thử và tính toán sơ bộhiệu suất của phản ứng

Dựa trên thông số hiệu suất phản ứng và tỉ lệ tạp chất tạo thành ở các điềukiện thăm dò, tiến hành giới hạn khoảng của các yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, tỉ lệmol, thời gian phản ứng Ở mỗi yếu tố, mức giới hạn có thể giữ nguyên hoặc thayđổi so với điều kiện phản ứng trong các tài liệu tham khảo sao cho hiệu suất sảnphẩm tạo thành cao, tỉ lệ tạp chất ít và hiệu quả về kinh tế

2.1.1. Bố trí thí nghiệm và xác định các thông số tối ưu bằng cách sử dụng

Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Benhken được thiết lập trong phần mềmJMP với tổng số thí nghiệm là 15 Theo đó, các yếu tố khảo sát sẽ được mã hóatrong hệ tọa độ không thứ nguyên với tọa độ của mức cơ sở bằng 0, trùng với gốc

hệ trục tọa độ Các yếu tố mã hóa sẽ nhận 2 giá trị -1 và +1 tương ứng với mức trên

và mức dưới của mức cơ sở (Bảng 2.2.)

Bảng 2.2 Mã hóa các yếu tố ảnh hưởng

Mức dưới -1 Mức cơ sở Mức trên+1

Ma trận thực nghiệm thu được gồm 30 thí nghiệm (Bảng 2.3), trong đó cácthí nghiệm sẽ được lặp lại 1 lần để tăng độ tin cậy của số liệu.

Bảng 2.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm ST

Tiến hành phản ứng 3 lần ở điều kiện đã dự đoán để kiểm tra tính chính xáccủa phương trình hồi quy đối với thực nghiệm.

2.2.6 Tinh chế

2.2.6.1Tinh chế M.B.I

Sau phản ứng tổng hợp M.B.I ta thu được một hỗn hợp gồm nguyên liệu đầucòn dư sau phản ứng, M.B.I dưới dạng đồng phân E và Z Nếu đem cả hỗn hợp này

tiếp tục cho phản ứng thì hiệu suất tạo felodipin đạt tiêu chuẩn dược dụng sẽ khôngcao, lẫn nhiều tạp khó tách nên cần phải tinh chế tách M.B.I ra khỏi hỗn hợp.

Dựa vào tính chất vật lí khác nhau của 2 dạng đồng phân trên ta có thể kếttinh M.B.I ở nhiệt độ 0-5oC trong 10-12 giờ vì ở nhiệt độ thấp đồng phân dạng Etồn tại ở thể rắn khác với đồng phân dạng Z ở thể lỏng Sau đó lọc dưới áp suấtgiảm và rửa với isopropyl ancol lạnh thu được tinh thể M.B.I

Phần dịch lọc được tiến hành cô quay ở 60oC loại bớt dung môi rồi đun nóngdịch ở 60oC trong 1 giờ để chuyển từ dạng đồng phân Z sang đồng phân E (US Pat

5,977,369).

Quy trình tinh chế M.B.I được mô tả như sơ đồ 2.1

Hỗn hợp sau phản ứng

Làm lạnhLọc áp suất giảm

M.B.I

2.2.6.2 Tinh chế felodipin

Dịch sau phản ứng đem cô quay ở nhiệt độ 50oC để loại bớt dung môi, cắnthu được hòa tan trong dicloromethan, lắc cho tan hết cắn Thêm 0,1ml HCl 24% đểchuyển hỗn hợp về môi trường pH acid rồi thêm vào 10ml nước và chuyển quaphễu chiết, chiết lấy phần dicloromethan bên dưới đem cô quay ở 40oC loại bớtdicloromethan Thêm vào 3ml diisopropyl ether kết tinh felodipin Tinh thể đượclàm lạnh ở 0-5oC trong 2-3 giờ để ổn định sau đó đem lọc áp suất giảm và rửa vớidiisopropyl ete để thu tinh thể felodipin

Diisopropyl ete

HCl 24%

Dicloromethan

Hỗn hợp sau phản ứng

Cô quayCắn

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ-BÀN LUẬN

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3 THIẾT LẬP CHƯƠNG TRÌNH XỬ LÝ ẢNH TÍNH DIỆN TÍCH

VẾT SẮC KÝ

Dựa trên nguyên tắc đã trình bày ở phần thực nghiệm, tiến hành viết mãnguồn chương trình và chạy chương trình Ảnh xám được chuyển đổi thành ảnh nhịphân với hệ số mức chuyển đổi được lựa chọn là 0,3

Hình 3.1: Quá trình xử lý hình ảnh bằng matlab vết M.B.I

Nhận xét: vết sắc ký ở ảnh nhị phân có hình dạng tương tự ở ảnh màu Phương pháp

phân tích hình ảnh vết M.B.I và vết felodipin trên bản mỏng yêu cầu các ảnh chụpphải đồng nhất, nghĩa là các ảnh chụp phải giống nhau về độ sáng, độ phân giải, cự

ly chụp…Do đó cần cố định máy ảnh ở cùng một chế độ và khoảng cách

Kết luận: chương trình có thể xử lý hình ảnh và tính toán được diện tích vết sắc kývới đơn vị là pixel

Hình 3.2: Quá trình xử lý hình ảnh bằng matlab vết felodipin

3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG M.B.I VÀ

FELODIPIN CÓ TRONG HỖN HỢP SAU PHẢN ỨNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

3.2.1 Khảo sát độ lặp lại

Tiến hành chạy sắc ký đối với mẫu chuẩn và mẫu thử, mỗi mẫu chấm 3 vết,sắc ký đồ thu được sẽ đem xử lý hình ảnh tính diện tích vết có được kết quả trongbảng 3.1

Hình ảnh vết được chụp trong buồng UV với bước sóng 254 nm

3.2.1.1M.B.I

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại.

3.2.2.1 M.B.I

Kết quả sau khi xử lý ảnh bằng matlab được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Bảng kết quả tính diện tích vết theo nồng độ M.B.I.

Hình 3.4: sắc ký đồ của vết

felodipin chuẩn theo nồng độ

Theo đồ thị 3.2, sự tương quan tuyến tính giữa diện tích vết với nồng độfelodipin có ý nghĩa với giá trị R2= 0,9974.

Đường hồi qui tuyến tính diện tích vết theo nồng độ của mẫu chuẩnfelodipin:

Mẫu thử + 1mg M.B.I chuẩn: Y2 = 4553 (pixel)

Mẫu thử + 2mg M.B.I chuẩn: Y3 = 4750 (pixel)

Từ các giá trị diện tích vết thu được ta thay giá trị Y vào phương trình đườnghồi qui Y = 197531X + 2530.6, từ đó suy ra:

Nồng độ M.B.I có trong mẫu thử:

X1 = (Y1 – 2530.6)/197531 = (4354 -2530.6)/197531 = 0.00923 (g/ml)

Dung dịch sau phản ứng được lấy ra 10l pha vừa đủ 200l dung dịch Nênlượng M.B.I có trong dung dịch sau phản ứng là: 0.00923*20 = 0.1846 (g/ml)

Hiệu suất phản ứng: H =mtt/mlt =0.1846/(273*10-3) = 67.62(%)

Tương tự, ta có thể áp dụng cho những mẫu thử khác

Nồng độ M.B.I có trong mẫu thử + 1mg M.B.I chuẩn:

Vết 1: M.B.I chuẩn

Vết 2: Mẫu thử

Vết 3: Mẫu thử + 1mg M.B.I chuẩn

Vết 4: Mẫu thử + 2mg M.B.I chuẩn

Hình 3.5: Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của M.B.I