Phân lập tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG PHÂN LẬP TETRODOTOXIN TỪ PHỦ TẠNG CÁ NÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG PHÂN LẬP TETRODOTOXIN TỪ PHỦ TẠNG CÁ NÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: 1. TS. Đào Thị Thanh Hiền 2. ThS. Phùng Minh Dũng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược cổ truyền 2. Công ty CPDP Mediplantex 3. Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương HÀ NỘI-2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS.Đào Thị Thanh Hiền giảng viên bộ môn Dược học cổ truyền, ThS.Phùng Minh Dũng tổng giám đốc công ty cổ phần dược phẩm Mediplantex đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn TS.Trần Việt Hùng phó giám đốc Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, thầy giáo TS.Bùi Hồng Cường và các thầy cô trong bộ môn Dược học cổ truyền, DS.Dương Minh Tân và các anh chị trong Viện kiểm nghiệm đã góp ý, tận tình giúp đỡ mọi mặt để tôi hoàn thành khóa luận này. Xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè những người thường xuyên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Dung LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. CÁ NÓC 2 1.1.1. Vị trí, phân loại 2 1.1.2. Đặc trưng hình thái 3 1.1.3. Tập tính sống- phân bố 3 1.1.4. Thành phần độc tố 4 1.1.5. Độc tính 5 1.2. TETRODOTOXIN 6 1.2.1. Tính chất, cấu trúc 7 1.2.2. Tác dụng dược lý- độc tính 9 1.2.3. Ứng dụng điều trị của TTX 11 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TTX 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 14 2.1.1. Nguyên liệu 14 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất: 14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Chiết xuất độc tố toàn phần 15 2.2.2. Phân lập TTX 15 2.2.3. Định tính TTX 15 2.2.4. Định lượng TTX 15 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.3.1. Phương pháp chiết xuất 15 2.3.2. Phương pháp phân lập TTX 17 2.3.3. Định tính TTX 19 2.3.4 Định lượng TTX bằng phương pháp LC-MS/MS 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 22 3.1.1. Chiết xuất 22 3.1.2 Phân lập: 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 36 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, chữ viết tắt Nội dung CE Collision energy-năng lượng bắn phá dc- Decarbamoyl- Dd Dung dịch ESI Electron spray ionization-ion hóa tia điện GTX Gonyautoxin HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Sắc kí lỏng khối phổ MLD Mean lethal dose-liều gây chết trung bình NMR Nuclear Magnetic Resonance-cộng hưởng từ hạt nhân PL Phụ lục PSP Paralytic Shellfish Poisoning-độc tố gây liệt TTX Tetrodotoxin STX Saxitoxin SRM Select reaction monitoring DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả chiết xuất 25 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết 26 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát pH 27 Bảng 3.4: Kết quả phân lập 30 Bảng 3.5: Kết quả định lượng 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Các họ cá nóc trong bộ cá nóc Tetraodontiformes 3 Hình 1.2: Công thức TTX và các analog (TTXs) 5 Hình 1.3: Công thức của nhóm chất độc PSP (saxitoxin và các dẫn xuất) 5 Hình 1.4: Cấu trúc phân tử TTX (A) cấu trúc phẳng, (B) cấu trúc 3-D 7 Hình 1.5: Cơ chế sự epime hóa nhóm OH-C4 của TTX 9 Hình 1.6: TTX chẹn kênh vận chuyển natri làm tê liệt thần kinh 10 Hình 2.1:Sơ đồ chiết xuất TTX từ phủ tạng cá nóc 16 Hình 2.2: Sơ đồ phân lập theo phương pháp của Maoquing Zhou 18 Hình 3.1: (A) dịch chiết qua giấy lọc 5µm, (B) dịch chiết qua giấy lọc 0,45µm 24 Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng (Rf=0,2) 24 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến kết quả chiết xuất 26 Hình 3.4: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của pH chạy cột đến kết quả chiết xuất 27 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có vùng tài nguyên biển dồi dào và tiềm năng khai thác biển rất lớn. Trong những năm gần đây, công tác điều tra nguồn lợi biển đã được đẩy mạnh nhằm đánh giá hiện trạng nguồn lợi hải sản và xu hướng biến động của chúng, cá nóc cũng là một trong những đối tượng được quan tâm nghiên cứu [2]. Cá nóc được coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xương sống, chỉ đứng sau cóc độc vàng. Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ yếu trong số này là tetrodotoxin thuộc nhóm độc tố thần kinh cực kỳ nguy hiểm, có tính bền nhiệt lớn và khả năng gây tử vong cao [10]. TTX có triển vọng thay thế morphin để giảm đau trong ung thư và cai nghiện [3], [13] nhưng TTX có hàm lượng rất thấp trong cá nóc. Có vài nghiên cứu về chiết xuất TTX nhưng không được công bố hoặc công bố không đầy đủ [4], [6], [20], [21]. Với mục đích nghiên cứu TTX trong cá nóc, tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc” được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm. Mục tiêu của đề tài: 1. Nghiên cứu chiết xuất độc tố toàn phần từ phủ tạng cá nóc ở quy mô phòng thí nghiệm 2. Nghiên cứu phân lập tetrodotoxin từ độc tố toàn phần ở quy mô phòng thí nghiệm. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. CÁ NÓC 1.1.1. Vị trí, phân loại [10] Phân ngành có sọ Craniata Lớp cá xương Osteichthyes Phân lớp cá vây tia Actinopterygii Liên bộ cá vược Percomorpha Bộ cá nóc Tetraodontiformes + Phân bộ cá nóc hòm Ostracioidei 1. Họ cá nóc hòm Ostraciidae Họ phụ cá nóc hòm lục lăng Aracaninae Họ phụ cá nóc hòm Ostraciinae + Phân bộ cá nóc Tetraodontoidei 2. Họ cá nóc ba răng Triodontidae 3. Họ cá nóc Tetraodontidae Họ phụ cá nóc dẹt Canthigasterinae Họ phụ cá nóc tròn Tetraodontinae 4. Họ cá nóc nhím Diodontidae Về tổng thể, bộ Tetraodontiformes chứa 10 họ còn sinh tồn với khoảng 430 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [15]. Kết quả nghiên cứu năm 2013 của Betancur-R và cộng sự cho rằng bộ Cá nóc có quan hệ họ hàng gần với nhánh chứa bộ Lophiiformes và họ Caproidae [17]. Người ta cũng ước tính rằng bộ này là hậu duệ của các loài sinh sống ven san hô, đã xuất hiện khoảng 95 triệu năm trước [15]. [...]... [10] Hình 1.1: Các họ cá nóc trong bộ cá nóc Tetraodontiformes Đặc điểm quan trọng để nhận biết và phân biệt với các loài cá khác là cá nóc không có vây bụng và các vây đều không có gai cứng Vây lưng và vây hậu môn nằm đối diện hoặc gần đối diện với nhau và chúng nằm cách xa vây ngực, gần với vây đuôi Vây đuôi thường tròn hoặc bằng hoặc lõm nông (trừ cá nóc ba răng có vây đuôi chẻ sâu) Cá nóc không có... vây ngực Thân cá nóc không có vảy Cá nóc nhím có gai sắc nhọn như lông nhím Cá nóc hòm có lớp giáp cứng liên kết với nhau thành hình hộp bao quanh cơ thể Miệng cá nóc bé nhưng răng khoẻ; xương hàm và xương gần hàm gắn liền với nhau thành mỏ cứng thích nghi với các loài thức ăn có vỏ cứng Cá nóc không có xương sườn và các xương dăm ở phần thịt Dạ dày cá có thể co dãn và ở nhiều loài cá nóc có thể hút... (IVAC) đã phân lập được TTX từ phủ tạng cá nóc Nghiên cứu thu được 19,21mg tinh thể TTX có độ tinh khiết 80-85%, hiệu suất 35-50% Tuy nhiên nghiên cứu mới 13 chỉ dừng lại ở quy mô nhỏ phục vụ công việc điều chế huyết thanh kháng TTX [4] 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu để chiết xuất -phân lập: phủ tạng các loại cá nóc thu mua... Toshio cùng cộng sự đưa ra phương pháp chiết xuất phân lập và tinh chế TTX như sau: từ 100 kg trứng cá nóc chiết bằng nước, phân lập bằng cách cho qua cột trao đổi ion Amberlite IRC-60, than hoạt tính và kết tinh trong dung dịch amoniac cho 1-2 gam độc tố thô [27] - Năm 2003 Maoquing Zhou và cộng sự tiến hành chiết xuất, phân lập TTX như sau: từ 20kg trứng cá nóc chiết bằng acid acetic, đun nóng, làm lạnh,... gây tử vong cao [3] Tuy nhiên, không phải loài cá nóc nào cũng độc Độc tố trong các loài 6 cá nóc khác nhau thì khác nhau Hàm lượng độc tố trong cơ thể còn thay đổi theo mùa, vùng địa lý và giai đoạn phát triển của cá thể [10] Các bộ phận khác nhau của cá nóc có độc tính với mức độ rất khác nhau Mức độ độc của đa số các loài có thể được sắp xếp theo trật từ giảm dần của độ mạnh như sau: trứng, tinh hoàn,... hoàn, gan, ruột, da, thịt [7], [8] Theo giai đoạn trưởng thành và thuần thục sinh dục, cá nóc có độc tính cao ở giai đoạn 5 đối với cá đực và giai đoạn 6 đối với cá cái Độc tính của cá nóc thường tăng cao vào các tháng 2-3 và 7-9 trong năm, đây cũng là mùa sinh sản của cá nóc [7] Tại Việt Nam, người ta đã tiến hành phân tích độc tố của 35 loài [7], [8], trong đó: ̶ 10 loài có độc tính rất mạnh ̶ 7 loài... trúc A được gọi tetrodotoxin , là nồng độ chủ yếu của TTX thu được từ cá nóc tự nhiên TTX cấu trúc F thường được gọi “4-epi tetrodotoxin Do nhóm hydroxyl ở C-4 gần với nhóm hydroxyl ở C-9 trong 4-epi tyetrodotoxin, phân tử H2O dễ dàng bị loại bởi tương tác với H+, tạo ra một analog của TTX chứa liên kết ether, được gọi là “4-epi anhydrotetrodotoxin” Các đặc tính hóa học của ba phân tử tetrodotoxin ... sống- phân bố [10] Cá nóc phân bố khá rộng cả về không gian và khía cạnh sinh thái Một số loài ưa sống đáy, trong khi số khác sống ở các rạn san hô có độ sâu từ vài chục mét đến hàng trăm mét hay các vùng nước ven bờ, đầm lầy, cửa sông; thậm chí một số ít loài còn sống ở nước ngọt, sông suối, hồ Cá nóc là loài ăn tạp, sống đơn lẻ hoặc theo đàn và thường không di cư 4 Trên thế giới có khoảng 246 loài cá. .. Trên thế giới có khoảng 246 loài cá nóc, bao gồm cả cá nóc nước mặn và nước ngọt, chúng sống ở các khu vực biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới của Thái Bình Dương, ấn Độ Dương và Đại Tây Dương Việt Nam có khoảng 67 loài cá nóc thuộc bốn họ nói trên Chúng phân bố khá rộng và được bắt gặp gần như ở toàn vùng biển Việt Nam 1.1.4 Thành phần độc tố Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ... (tt/tt), rồi tiếp tục tiến hành như mô tả ở các bước từ 2 đến.4 7) Sấy TTX tinh thể thu được trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd) đến khối lượng không đổi Hình 2.2: Sơ đồ phân lập theo phương pháp của Maoquing Zhou Tính hiệu suất quá trình phân lập 𝐻= 𝑚𝑠 𝑚𝑡 Trong đó mt: khối lượng TTX trước phân lập ms: khối lượng TTX sau phân lập 19 2.3.3 Định tính TTX A Sắc kí lớp . Aracaninae Họ phụ cá nóc hòm Ostraciinae + Phân bộ cá nóc Tetraodontoidei 2. Họ cá nóc ba răng Triodontidae 3. Họ cá nóc Tetraodontidae Họ phụ cá nóc dẹt Canthigasterinae Họ phụ cá nóc tròn Tetraodontinae. Osteichthyes Phân lớp cá vây tia Actinopterygii Liên bộ cá vược Percomorpha Bộ cá nóc Tetraodontiformes + Phân bộ cá nóc hòm Ostracioidei 1. Họ cá nóc hòm Ostraciidae Họ phụ cá nóc hòm lục. PHÂN LẬP TETRODOTOXIN TỪ PHỦ TẠNG CÁ NÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG PHÂN LẬP TETRODOTOXIN