Tham khảo tài liệu [18], [22] và làm thực nghiệm điều kiện của phương pháp được xác định
Chuẩn bị các điều kiện sắc kí
- Chuẩn: Tetrodotoxin (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, hàm lượng: 99%, SKS: 038K1804) - Dung dịch chuẩn: Dung dịch TTX chuẩn trong dung môi pha mẫu, có nồng độ chính
xác khoảng 1µg/ml.
- Dung dịch thử: Hòa tan độc tố tinh thể thu được ở phần chiết xuất trong dung môi pha mẫu với nồng độ khoảng 1µg/ml.
Các điều kiện sắc ký:
- Thiết bị: Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Scientific TSQ quantum Ultra - Cột: Alltech Apollo C8 (25 cm x 4,6mm; 5µm)
- Pha động: Đệm acetat – Methanol (30:70)
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µl/min
- Thể tích tiêm: 10µl - Điều kiện khối phổ + Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10 + Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
Cách tiến hành
Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào máy sắc ký lỏng khối phổ, ghi lại sắc ký đồ và tính diện tích của pic TTX. Mỗi mẫu thử làm lại 3 lần, lấy kết quả trung bình
Tính hàm lượng của TTX đã phân lập, dựa vào nồng độ TTX trong dung dịch chuẩn và diện tích của pic TTX trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử.
Công thức:
Hàm lượng TTX được tính theo công thức
X% = 100 t t C c t m V C S S Trong đó:
Sc, St: diện tích peak trong sắc ký đồ cho bởi dung dịch chuẩn, thử Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/mL)
mt: khối lượng chất đem định lượng (µg) Vt: thể tích pha mẫu thử (mL)
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
3.1.1. Chiết xuất
Acid acetic là một acid hữu cơ yếu có khả năng hòa tan TTX và không độc nên lựa chọn acid acetic làm dung môi chiết. Theo tài liệu [20] TTX được chiết bằng dung môi acid acetic ở nồng độ 0,1%. Khảo sát nồng độ dung môi chiết xuất ở 3 nồng độ 0,1%; 0,5%; 1% và so sánh các chỉ tiêu: khối lượng độc tố toàn phần thu được sau khi chiết xuất và độ tinh khiết
Trong quá trình thử nghiệm, nhận thấy dịch chiết cá nóc tương đối đục gây khó lọc và không thu được dịch trong suốt vì vậy tiến hành lọc 3 lần qua 3 loại vật liệu lọc: vải xô, giấy lọc có kích 5 µm; 0,45µm để thu được dịch lọc trong. Để dễ dàng cho quá trình lọc và không gây tắc: tiến hành ly tâm (6000v/p) trong 20 phút sau khi lọc qua vải xô. Sau khi lọc thô qua vải xô, đun nóng 800C trong 5 phút thấy dịch vẫn xuất hiện tủa nên đun 800C trong 10 phút để tạo tủa hết.
Theo quy trình dịch lọc thu được từ giai đoạn ngâm chiết trước khi chạy cột trao đổi ion được điều chỉnh pH 7,5; khảo sát ở các môi trường acid pH 5,5; pH 7,5 và môi trường kiềm pH 9,0; chỉ tiêu so sánh: khối lượng độc tố toàn phần thu được sau khi chiết xuất và độ tinh khiết
Tiến hành: - Ngâm chiết:
+ Nghiền nhỏ 1kg phủ tạng cho vào trong xô, sau đó thêm vào 1,5L dung môi chiết
Trường hợp 1: acid acetic 0,1% Trường hợp 2: acid acetic 0,5% Trường hợp 3: acid acetic 1%
+ Khuấy trộn trong 2 giờ, lọc qua vải xô để thu được dịch ngâm chiết đầu. Thêm 1,5L nước khử ion vào bã, khuấy trộn và lọc như trên. Tiến hành 3 lần để chiết kiệt.
+ Gộp các dịch chiết lại, đun nóng dịch chiết ở 800C trong 10 phút, sau đó làm lạnh
+ Lọc thô qua vải, ly tâm (6000v/p) trong 20 phút thu lấy dịch rồi tiến hành lọc lần lượt qua giấy lọc kích thước 5µm trên phễu Buchner; 0,45µm trên bộ lọc thủy tinh có bơm hút chân không để thu được dịch lọc trong.
- Quá trình làm giàu bằng trao đổi ion và tách TTX:
+ Điều chỉnh pH dịch lọc thu được về pH: Trường hợp 1: pH=7,5
Trường hợp 2 : pH=5,5 Trường hợp 3: pH=9,0
bằng dung dịch ammoniac 10% (tt/tt). Cho dịch lọc chạy qua cột trao đổi ion với tốc độ 100ml/h
+ Sau khi toàn bộ dịch lọc đã chạy qua cột trao đổi ion, rửa cột với nước khử ion cho đến khi không còn protein trong nước rửa. Rửa giải cột trao đổi ion bằng dung dịch acid acetic 10% (tt/tt) với tốc độ 50ml/h, để thu dịch TTX.
-Sơ tinh chế qua than hoạt:
+ Gộp dịch TTX thu được ở trên. Điều chỉnh tới pH 8,5 bằng dung dịch amoniac
10% (tt/tt). Lọc qua giấy lọc 0,45µm
+ Duy trì pH 8,5 của dịch rửa giải trong 2 giờ. Trong khoảng thời gian này, cho
dịch rửa giải chạy qua cột silica diatomaceous - than hoạt.
+ Rửa cột silica diatomaceous - than hoạt với nước khử ion, rồi rửa giải bằng
dung dịch acid acetic 0,2% trong ethanol 20% cho đến khi hết TTX (kiểm tra bằng TLC).
-Cô đặc và kết tinh:
+ Cô đặc dung dịch thu được bằng máy cất quay ở nhiệt độ 100oC đến khi còn khoảng 300ml thì lấy ít để nguội, lấy đem sắc kí lớp mỏng.
+ Cô tiếp cho tới khi còn 10ml thì làm lạnh dịch cô đặc tới 200C, điều chỉnh pH 9,0 bằng dung dịch ammoniac đậm đặc.
+ Cho vào tủ lạnh, để yên cho độc tố kết tinh. Lọc lấy độc tố tinh thể rửa 3 lần,
mỗi lần với 5 ml với nước khử ion. Sấy trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd; 2 h) cho đến khối lượng không đổi để thu được tinh thể độc tố toàn phần có chứa TTX.
Kết quả:
1. Nồng độ dung môi chiết: acid acetic 0,1% Dịch chạy cột trao đổi ion có pH=7,5
Dịch chiết qua các loại giấy lọc
Hình 3.1: (A) dịch chiết qua giấy lọc 5µm, (B) dịch chiết qua giấy lọc 0,45µm
Định tính TTX bẳng sắc kí lớp mỏng dịch chiết đã cô
Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng (Rf=0,2)
(C): dung dịch chuẩn TTX (T): dung dịch thử
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn đều cho vết màu hồng khi phun thuốc thử hiện màu, vị trí vết của dung dịch thử và dung dịch chuẩn là tương ứng nhau.
Bảng 3.1: Kết quả chiết xuất
Acid acetic 0,1%
Khối lượng nguyên liệu (g) 1001,1
Khối lượng độc tố toàn phần (mg) 29,8
Lượng TTX trong độc tố toàn phần (mg) 21,2
Độ tinh khiết (%) 71,1
Bàn luận:
- Lựa chọn dung môi là acid acetic loãng để hòa tan TTX. Quá trình đun nóng,
làm lạnh dịch chiết nhằm loại bỏ tủa scleroprotein (protein sợi), chất béo.
- Tiến hành lọc thô nhằm loại các tạp lớn gây ảnh hưởng đến quá trình lọc và
chạy cột. Dịch lọc thô đem ly tâm để loại các tạp có thể gây tắc, ảnh hưởng đến tốc độ lọc. Lọc tiếp qua giấy lọc có kích 5 µm vẫn còn khá đục nên lọc qua giấy lọc 0,45µm. Dịch lọc thu được khá trong suốt thuận lợi cho quá trình chạy cột - Giai đoạn chảy qua cột trao đổi ion giúp loại bỏ được protein, peptid và các dẫn chất của TTX. Nếu không loại được những chất này làm tăng độ nhớt của dịch gây cản trở cho các quá trình kết tinh TTX sau này.
- Giai đoạn chảy qua cột diatomaceous silica-than hoạt nhằm loại acid amin kiềm
- Cô đặc dịch rồi điều chỉnh pH dịch 9,0 rồi làm lạnh để kết tinh TTX, rửa với nước lạnh để loại bớt các tạp lượng thấp còn sót lại trong dịch, sấy khô đến khối lượng không đổi để định lượng lượng TTX có trong độc tố toàn phần.
- Dựa vào phương pháp chiết xuất của Maoquing Zhou (2003) và tùy vào điều kiện phòng thí nghiệm để tiến hành, chiết ra 29,8mg độc tố toàn phần có độ tinh
khiết tương đối 71,7%. Phương pháp này có ưu điểm sử dụng các dung môi an toàn.
2. Khảo sát nồng độ dung môi chiết ở các nồng độ: 0,1%; 0,5%; 1% pH dịch chạy cột trao đổi ion pH=7,5
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết
Acid acetic 0,1% Acid acetic 0,5% Acid acetic 1% Khối lượng nguyên liệu (g) 1001,1 1002,9 1002,1
Khối lượng độc tố toàn phần
(mg) 29,8 28,3 27,6
Lượng TTX trong độc tố toàn
phần (mg) 21,2 18,1 17,2
Độ tinh khiết (%) 71,1 63,5 62,3
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến kết quả chiết xuất 56.00% 58.00% 60.00% 62.00% 64.00% 66.00% 68.00% 70.00% 72.00% 26.5 27 27.5 28 28.5 29 29.5 30
Acid acetic 0,1% Acid acetic 0,5% Acid acetic 1%
Bàn luận: Khối lượng tinh thể độc tố toàn phần có chứa TTX và độ tinh khiết
giảm theo độ tăng của nồng độ acid acetic. Ở nồng độ acid acetic 0,1% khối lượng tinh thể độc tố toàn phần có chứa TTX và độ tinh khiết thu được là cao nhất. Do càng nồng độ acid cao thì hòa tan nhiều tạp hơn, ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất TTX.
3. Khảo sát pH chạy cột trao đổi ion: pH 5,5; pH 7,5; pH 9,0 Dung môi chiết: acid acetic 0,1%
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát pH
pH 5,5 pH 7,5 pH 9,0
Khối lượng nguyên liệu
(g) 1001,6 1001,1 1002,5
Khối lượng độc tố toàn
phần (mg) 19,3 29,8 29,5
Lượng TTX trong độc tố
toàn phần (mg) 13,8 21,2 19,9
Độ tinh khiết (%) 71,5 71,1 67,5
Hình 3.4: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của pH chạy cột đến kết quả chiết xuất
65.00% 66.00% 67.00% 68.00% 69.00% 70.00% 71.00% 72.00% 0 5 10 15 20 25 30 35 pH 5,5 pH 7,5 pH 9,0
Bàn luận:
-pH của dịch lọc chạy cột trao đổi có ảnh hưởng đến kết quả chiết xuất. Với pH 5,5 dịch khi đem cô và kết tinh khó hơn, dịch nhớt hơn do không loại bỏ được protein, peptid khiến TTX khó kết tinh hơn nên khối lượng tinh thể TTX toàn phần giảm đi nhiều; với pH 9,0 lượng tinh thể TTX toàn phần thu được không khác nhiều ở pH 7,5 nhưng độ tinh khiết thấp hơn do ở pH 9,0 khả năng bị hấp phụ ở cột trao đổi ion của TTX giảm nên lượng TTX trong dịch rửa giải giảm đi.
- pH tốt nhất để thuận lợi cho quá trình chiết xuất là 7,5 lượng tinh thể độc tố toàn phần thu được có khối lượng lớn nhất và độ tinh khiết cao nhất.
3.1.2 Phân lập:
Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ yếu là TTX, còn lại đều có hàm lượng nhỏ. Trong quá trình chiết xuất một phần các analog đã được loại bỏ. Ba analog chính khác là acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydrotetrodotoxin thường xuất hiện với TTX do có đặc tính hóa học tương đối giống nhau. Sử dụng phương pháp tinh chế nhiều lần nhằm loại các analog có hàm lượng thấp. Sử dụng dung môi acid acetic loãng 5% để tinh chế nhiều lần theo sơ đồ (Hình 2.2)
Cách tiến hành:
1) Hòa tan độc tố tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt). 2) Điều chỉnh tới pH 9,0 bằng dung dịch amoniac đậm đặc.
3) Cho vào tủ lạnh, để yên cho TTX kết tinh.
4) Lọc lấy TTX tinh thể, rửa 3 lần, mỗi lần với 5 ml với nước cất.
5) Sấy trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd; 2 h).
6) Hòa tan TTX tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt), rồi tiếp tục tiến hành như mô tả ở các bước từ 2 đến.4
7) Sấy TTX tinh thể thu được trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd) đến khối lượng không đổi.
Kết quả :
1. Định tính TTX trong tinh thể đã phân lập
- Dựa vào khối phổ ESI-MS : Tiêm trực tiếp 1 lượng mẫu dịch chiết vào detector khối phổ, Trên sắc ký đồ ESI-MS, ở chế độ quét toàn thang (TIC – Total ion chromatographic) xuất hiện mảnh khối m/z = 320, ở chế độ MS/MS, bắn phá mảnh mẹ m/z = 320 với mức năng lượng CE = 35V, xuất hiện các mảnh con m/z = 302, m/z = 162 đặc trưng cho TTX (PL1)
- LC-MS/MS: Sắc ký đồ thu được của dung dịch thử có pic với thời gian lưu (tR=6,8 phút) và phổ MS/MS giống với thời gian lưu của pic và phổ trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn (PL5, PL6).
- NMR: dựa vào phổ cộng hưởng từ xác định được cấu trúc đặc trưng của TTX (PL2,PL3)
2. Định lượng TTX bằng phương pháp LC/MS/MS
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch TTX chuẩn trong dung môi pha mẫu, có nồng độ chính xác 1µg/ml.
Cách pha: tiêm khoảng 4mL dung môi pha mẫu vào lọ chuẩn 1mg, lắc kỹ, hoà tan hoàn toàn TTX, rút dung dịch ra, cho vào bình định mức 20,0mL. Tráng lại 3 lần, mỗi lần 4mL dung môi pha mẫu. Gộp dịch vào bình định mức 20,0mL. Thêm dung môi pha mẫu cho đến vạch, lắc siêu âm kỹ, lọc qua giấy lọc. Hút 1ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, lắc kỹ. Lọc qua màng lọc 0,45µm ta thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1µg/ml.
- Dung dịch thử:
Hòa tan độc tố tinh thể thu được ở phần chiết xuất trong dung môi pha mẫu với nồng độ khoảng 1µg/ml.
Cách pha dung dịch thử: cân chính xác khoảng 2,03mg chất vừa phân lập theo quy trình, pha trong bình định mức 20mL. Thêm 12mL dung dịch acid acetic 0,1%, lắc siêu âm kỹ, thêm dung dịch acid acetic 0,1% vừa đủ, lọc qua giấy lọc. Hút 1ml dung dịch này, pha trong 10mL Methanol thu được dung dịch 1. Hút tiếp 1mL
dung dịch 1, pha loãng trong 10mL Methanol. Lọc qua màng lọc 0,45µm thu được dung dịch tiêm sắc ký.
Tiến hành sắc kí LC-MS/MS ở các điều kiện đã nêu
Kết quả:
Sau khi tiến hành phân lập theo quy trình trên từ 29.8mg độc tố toàn phần chứa TTX thu được 20,7 mg TTX tinh thể.
Bảng 3.4: Kết quả phân lập
Lần tinh chế Khối lượng tinh thể
(mg) Hàm lượng TTX (X%)
1 25,7 73,9
2 22,5 78,7
3 20,7 82,6
Tiến hành định lượng hàm lượng Tetrodotoxin trong lượng tinh thể phân lập được theo điều kiện ở trên, ta có bảng sau
Diện tích peak dung dịch chuẩn: Sc = 161602,8
Bảng 3.5: Kết quả định lượng TT St X% Lần 1 137251,9 83,7 Lần 2 135365,7 82,9 Lần 3 130998,1 81,1 Trung bình 82,6 RSD 1,61
Bàn luận:
- Quá trình phân lập ta tiến hành tinh chế nhiều lần để loại các analog của TTX. Điều chỉnh pH 8-9 nhằm kết tinh TTX sau đó lọc, rửa, sấy. Sau khi tiến hành phân lập thu được 20,7mg TTX tinh thể với độ tinh khiết là 82,6% đạt yêu cầu. - Hiệu suất của quá trình chiết xuất phân lập là: 69,5%
- Quy trình phân lập đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém với dung môi đơn giản, rẻ tiền. Thời gian phân lập nhanh.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN:
- Tiến hành chiết xuất được 29,8mg độc tố toàn phần có độ tinh khiết 71,1% từ phủ tạng cá nóc ở quy mô phòng thí nghiệm tham khảo theo quy trình Maoquing Zhou (2003) với các giai đoạn:
1. Chiết bằng phương pháp ngâm lạnh
2. Làm giàu bằng phương pháp trao đổi ion và tách TTX 3. Sơ tinh chế bằng diatomaceous silica-than hoạt
4. Cô đặc và kết tinh
- Khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất: nồng độ dung môi, pH dịch trước khi chạy cột trao đổi ion
- Tiến hành phân lập TTX ở quy mô phòng thí nghiệm theo quy trình Maoquing Zhou (2003) từ 29,8mg độc tố toàn phần bằng cách tinh chế nhiều lần thu được 20,7mg TTX tinh thể với độ tinh khiết là 82,6% đạt yêu cầu. Hiệu suất của quá trình phân lập là: 69,5%
- Quy trình chiết xuất-phân lập đơn giản và không dùng đến dung môi hữu cơ độc xác định được độ tinh khiết của TTX tinh thể thu được.
I. KIẾN NGHỊ:
Do thời gian tiến hành ngắn, điều kiện ở quy mô phòng thí nghiệm còn chưa đầy đủ nên hiệu suất chiết xuất phân lập còn chưa cao; chưa khảo sát hết các thông số khác của quy trình. Khối lượng nguyên liệu còn ít nên còn chưa đánh giá hết những hạn chế của quy trình nên chúng tôi đề nghị: